BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA CỦA NẤM MỐC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU LÀNG NGHỀ PHÚ LỄ Họ tên sinh viên: LÊ THỊ MAI LINH Ngành: BQCBNSTP VÀ DINH DƯỠNG NGƯỜI Niên khóa: 2007 - 2011 Tháng 08/2011 XÁC ĐỊNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HĨA CỦA NẤM MỐC TRONG Q TRÌNH LÊN MEN RƯỢU LÀNG NGHỀ PHÚ LỄ Tác giả LÊ THỊ MAI LINH Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản thực phẩm dinh dưỡng người Giáo viên hướng dẫn: TS PHAN THẾ ĐỒNG Tháng 08/2011 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn trước hết xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến công ơn nuôi dưỡng cha mẹ, người sinh thành, nuôi dạy ủng hộ bước đường học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất quý thầy cô khoa Cơng nghệ thực phẩm nói riêng q thầy trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh nói chung Thầy khơng quản ngại bao khó khăn, vất vả để truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho làm hành trang bước vào đời trở thành kỹ sư, trí thức trẻ tương lai Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy Phan Thế Đồng người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt thời gian học tập thực đề tài tập vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô phòng thí nghiệm hóa sinh vi sinh đặc biệt xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Vũ Thị Lâm An tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, tồn thể nhân viên cơng ty cổ phần sản xuất thương mại Phú Lễ tạo điều kiện cho có hội thực đề tài tạo điều kiện giúp đỡ thời gian thực đề tài Đặc biệt xin chân thành cảm ơn chị Đinh Thị Hạnh Tâm - nhân viên cơng ty tận tình hỗ trợ, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm cho suốt trình nghiên cứu đề tài Và tơi gửi lời cảm ơn đến thành viên thân yêu lớp DH07DD, người bạn giúp đỡ, động viên học tập sống Mong sau lớp trì tình cảm tốt đẹp Một lần tơi xin chân thành cảm ơn xin chúc tất thầy cô bạn bè lời chúc sức khỏe thành đạt ii TÓM TẮT Hệ nấm mốc bánh hồ men vi sinh yếu tố quan trọng định đến hiệu suất thu hồi rượu Đề tài: “Xác định khảo sát khả đường hóa nấm mốc q trình lên men rượu làng nghề Phú Lễ” nhằm mục đích làm rõ thêm vai trò nấm mốc quy trình sản xuất rượu truyền thống Thời gian thực địa điểm thí nghiệm: + Thời gian thực từ - đến 30 - năm 2011 + Địa điểm thí nghiệm:  Tại cơng ty Rượu Phú Lễ, 333 ấp Phú Thạnh, xã Phú Lễ, huyện Ba Tri, tỉnh Bến Tre  Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Nội dung đề tài : - Phân lập, định danh hệ nấm mốc có mẫu bánh hồ mẫu men vi sinh (CR, XN, M2) thu thập công ty - Nuôi cấy giống thuần, giữ giống tạo chế phẩm nấm mốc phương pháp nuôi cấy bề mặt - Khảo sát khả đường hóa tinh bột nếp giống mốc phân lập dạng chế phẩm nấm mốc thông qua phương pháp định lượng đường khử Kết đề tài : - Phân lập giống nấm mốc mẫu bánh hồ giống nấm mốc mẫu men vi sinh thu thập công ty - Khi đường hóa nguyên liệu nếp mẫu bánh hồ thu thập công ty, kết cho hàm lượng đường khử nhiều Song mẫu bánh hồ gồm hệ nấm mốc mà A.flavus, A.nidulan giống có khả sinh độc tố (aflatoxin, sterigmatocystin ) - R.microsporus phân lập bánh men có khả đường hóa tinh bột cho hàm lượng đường khử cao so với nấm mốc L.ramosa phân lập bánh hồ iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU .1 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục đích đề tài: 1.3 Nội dung đề tài: 1.4 Phạm vi nghiên cứu: .1 1.4.1 Giới hạn nghiên cứu: .1 1.4.2 Địa điểm nghiên cứu: .2 1.4.3 Thời gian nghiên cứu: Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu công ty rượu Phú Lễ 2.1.1 Lịch sử hình thành q trình phát triển cơng ty 2.1.2 Chức nhiêm vụ 2.1.3 Bộ máy tổ chức công ty 2.2 Cơ sở lý thuyết trình lên men rượu đế 2.2.1 Cơ chế trình lên men .6 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 2.2.3 Nguyên liệu nấu rượu 2.2.4 Quy trình nấu rượu truyền thống làng nghề 2.3 Nấm mốc 12 2.3.1 Giới thiệu sơ lược nấm mốc 12 2.3.2 Các điều kiện cho nấm mốc sinh trưởng phát triển .12 2.3.3 Hệ nấm mốc trình lên men rượu 13 2.3.4 Vai trò hệ nấm mốc trình lên men rượu 14 iv Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 16 3.1.2 Thiết bị dụng cụ .18 3.2 Phương pháp .18 3.2.1 Phương pháp nghiên cứu 18 Sơ đồ nghiên cứu theo Hình 3.3 .18 3.2.2 Phương pháp phân tích 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết phân lập 23 4.2 Kết định danh 27 4.2.1 Khóa phân loại .28 4.2.2 Mơ tả lồi nấm mốc .28 4.3 Kết định lượng đường khử phương pháp Bertrand cho nấm mốc đường hóa tinh bột nếp .32 4.4 Đánh giá chất lượng giống nấm mốc sau trình đường hóa tinh bột .33 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC .40  v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PDA : Potato Dextrose Agar TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam QC : Nhân viên kiểm tra chất lượng RD : Nhân viên phát triển sản phẩm TKSX : Thống kê sản xuất vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.12: Hàm lượng đường khử tạo thành sau ủ 60 .32 Bảng 4.13: Kết đánh giá giống nấm mốc sau q trình đường hóa nếp 33 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Các sản phẩm rượu .4 Hình 2.2: Sơ đồ tổ chức máy công ty Hình 2.3: Sơ đồ quy trình nấu rươu làng nghề 10 Hình 2.4: Quá trình chưng cất rượu hộ dân 12 Hình 3.1: Bánh hồ 16 Hình 3.2: Men rượu 17 Hình 3.3: Sơ đồ nghiên cứu 18 Hình 3.4: Sơ đồ phân lập nấm mốc 19 Hình 3.5: Sơ đồ tiến hành công việc trước gửi mẫu định danh .20 Hình 3.6: Sơ đồ nếp cho nấm mốc ủ 60 .22 Hình 4.1: Khuẩn lạc H-1 ngày môi trường PDA 23 Hình 4.2: Khuẩn lạc H-2.1 ngày mơi trường PDA 24 Hình 4.3: Khuẩn lạc H-2.2 ngày môi trường PDA 25 Hình 4.4: Khuẩn lạc H-2.3 ngày môi trường PDA 25 Hình 4.5: Khuẩn lạc XN ngày môi trường PDA 26 Hình 4.6: Khuẩn lạc M2 ngày môi trường PDA 26 Hình 4.7: Khuẩn lạc CR ngày mơi trường PDA 27 Hình 4.8: Hình thái Lichtheimia ramosa (40X) so với tạp chí vi sinh vật học lâm sàng 29 Hình 4.9: Hình thái Apergillus flavus (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến 29 Hình 4.10: Hình thái E Nidulans (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến 30 Hình 4.11: : Hình thái Rhizopus microsporus (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến 31 Hình 4.14: Nếp cho nấm mốc R.microsporus ủ 60 34 Hình 4.15: Nếp cho nấm mốc L.ramosa ủ 60 .35 Hình 5.1: Sơ đồ quy trình đề nghị sản xuất bánh hồ 37 viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Rượu sản phẩm sử dụng phổ biến dịp lễ hội, sinh hoạt văn hóa giao tiếp người Việt Nam việc lựa chọn làm quà biếu, quà tặng dịp lễ tết Hiện thị trường, sản phẩm rượu đa dạng chủng loại mẫu mã Sản phẩm rượu Phú Lễ sản phẩm góp phần làm nên tiếng tăm thị trường rượu nước Với nguyên liệu nếp mùa Ba Tri bánh hồ sản xuất theo phương pháp truyền thống 36 vị thuốc bắc bí truyền, rượu Phú lễ giữ nét đặc trưng rượu làng nghề Vai trò hệ nấm mốc q trình lên men rượu đánh giá quan trọng Để làm rõ vấn đề định thực đề tài “Xác định khảo sát khả đường hóa nấm mốc dùng q trình lên men rượu làng nghề Phú Lễ” 1.2 Mục đích đề tài: - Xác định giống mốc hệ men,hồ sử dụng cho trình lên men rượu - Đánh giá bước đầu vai trò giống mốc 1.3 Nội dung đề tài: - Phân lập, định danh hệ nấm mốc có mẫu bánh hồ mẫu men thu thập công ty - Nuôi cấy giống thuần, giữ giống tạo chế phẩm nấm mốc theo phương pháp nuôi cấy bề mặt - Khảo sát khả đường hóa tinh bột nếp giống mốc phân lập dạng chế phẩm nấm mốc 1.4 Phạm vi nghiên cứu: 1.4.1 Giới hạn nghiên cứu: Đề tài phân lập, định danh xác định vai trò hệ nấm mốc có mẫu bánh hồ mẫu men công ty cung cấp Hình 4.8: Hình thái L.ramosa (40X) so với tạp chí vi sinh vật học lâm sàng  Aspergillus flavus Trên PDA khuẩn lạc dạng thảm thô, màu xanh vàng sẫm Đầu hạt đính hình bán cầu, hình cầu, hình cầu dẹt hình trụ Cuống hạt đính xù xì có gai nhỏ, khơng màu, tương đối dài khoảng 400 - 1000 µm Bọng hình thái bất , đầu hạt đính nhỏ bọng tròn, đầu hạt đính lớn bọng hình cầu Thể bình mọc hai hàng Hạt đính phần lớn xù xì, hình tròn hình lê Mốc sinh enzym amylase, protease, maltase, invectase, catalase có khả phân giải tinh bột thành đường, protein thành acid amin Hình 4.9: Hình thái A.flavus (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến  Emericella nidulans (tên đồng nghĩa Aspergillus nidulans) Trên PDA khuẩn lạc có dạng nhung mịn, màu vàng xanh rìa trắng tươi Mặt trái khuẩn lạc màu vàng nhạt 29 Trạng thái hạt đính chiếm ưu thế, thể phát triển rải rác lớp hạt đính Thể thường phong phú hình cầu tới cận cầu, đơn độc, đường kính lên xuống từ 100 - 300 µm, bao quanh lớp màu vàng tới nâu vàng sợi nấm rải rác mang “tế bào Hull” có đường kính 25 µm Bào tử túi hình thấu kớnh - 4,5 ì 3,2 - 3,5 àm u hạt đính màu xanh vàng sẫm, hình cột với hai lớp: thể bình cuống thể bình Cuống hạt đính màu nâu, vách trơn Hạt đính vách xù xì, hình cầu, đường kính - 3,5 µm Hình 4.10: Hình thái E.nidulans (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến 30  Rhizopus microsporus Trên PDA khuẩn lạc có màu đen, khuẩn ty phân nhánh rối, xồm mọc vươn không cao Mặt trái khuẩn lạc có màu vàng, phát triển nhanh sau ngày 37 oC Khuẩn ty mọc khóm nâu xám, cao khoảng mm cao Cuống túi bào tử đơn độc thành nhóm 4(6), suốt tới nâu, rễ giả ngắn, vách trơn xù xì dài 1000 µm, đường kính 10 - 18 µm Túi bào tử hình cầu, nâu đen trưởng thành, đường kính (50)100 - 180 µm Trụ hình cầu tới cận cầu, có mấu hình phễu Bào tử túi hình khác nhau, cầu, elipxoit - 10(24) chiều dài, nâu, đơn độc, suốt, vách trơn Bào tử vách dày nhiều, riêng lẻ thành chuỗi ngắn, khơng màu, có hột xuất sợi nấm, túi bào tử hình cầu, hình giống elipxoit, hình trụ - 30 µm hoc 12 45 ì - 35 àm Hỡnh 4.11: Hình thái R.microsporus (40X) so với hình cấu tạo tác giả Nguyễn Phùng Tiến 31 Từ kết định danh loại bỏ không khảo sát hàm lượng đường khử giống E.nidulans, A.flavus chúng có khả sinh độc tố gây bệnh cho người Hai giống lại L.ramosa, R.microsporus tiến hành kiểm tra khả đường hóa tinh bột nếp thơng qua phương pháp định lượng đường khử 4.3 Kết định lượng đường khử phương pháp Bertrand cho nấm mốc đường hóa tinh bột nếp Trong sản xuất rượu, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột phải trải qua trình thủy phân (giai đoạn dịch hóa đường hóa) trước lên men Amylase enzym thủy phân tinh bột có khả chịu nhiệt cao Sản phẩm q trình dịch hóa dextrin đường mang tính khử (maltose, glucose) Hiệu q trình đánh giá cách tiến hành định lượng đường khử Giống lại L.ramosa, R.microsporus, tổ hợp L.ramosa + R.microsporus nuôi cấy mơi trường cám gạo bình tam giác với độ ẩm ban đầu 60% sau cho vào q trình thủy phân nếp ủ 60 So sánh khả tạo thành đường khử giống so với mẫu bánh hồ đối chứng ban đầu cơng ty, thí nghiệm lặp lại lần Kết trình bày Bảng 4.12 Bảng 4.12: Hàm lượng đường khử tạo thành sau ủ 60 Giống % hàm lượng đường khử sau ủ 60 Mẫu bánh ban đầu 70,2 ± 5,4 L.ramosa 60,8 ± 3,14 R.microsporus 63,4 ± 6,6 L.ramosa + 51,1 ± 4,2 R.microsporus Nhận xét: Qua xử lý thống kê, kết cho thấy có khác biệt có ý nghĩa ảnh hưởng giống đến hàm lượng đường khử (phụ lục 2) Giống mẫu bánh hồ đối chứng ban đầu công ty cho hàm lượng đường khử nhiều (70,2%) song gồm hệ nấm mốc mà A.flavus, E.nidulans giống có khả sinh độc tố aflatoxin, sterigmatocystin Vì sản xuất bánh hồ khâu nhân giống quan trọng cần tuân thủ môi 32 trường nuôi cấy trùng, đồng thời cải tiến lại phương pháp sản xuất bánh hồ truyền thống cách cấy trực tiếp giống mốc khâu nhân giống R.microsporus cho hàm lượng đường khử (63,4%) cao so với L.ramosa (60,8%) Trong tổ hợp L.ramosa + R.microsporus cho hàm lượng đường khử thấp (51,1%) 4.4 Đánh giá chất lượng giống nấm mốc sau trình đường hóa tinh bột (nếp) Nếp sau nấu chín, hạt có trạng thái mềm dẻo kết dính với Khi cho chế phẩm nấm mốc giống R.microsporus giống L.ramosa ủ để hở nắp sau 60 giờ, kết trình bày Bảng 4.13 Bảng 4.13: Kết đánh giá giống nấm mốc sau trình đường hóa nếp R.microsporus L.ramosa + Các hạt nếp chuyển sang trạng thái + Các hạt nếp chuyển sang trạng thái rời rạc, dung dịch hồ tinh bột loãng rời rạc, dung dịch hồ tinh bột chậm nhanh so với dung dịch hồ R.microsporus + Khi quan sát, bào tử nấm mốc phát + Khi quan sát, bào tử nấm mốc phát triển nhanh xung quanh hạt triển chậm so với R.microsporus nếp + Bào tử màu đen có mùi thơm đặc + Bào tử màu trắng, khơng có mùi trưng thơm đặc trưng + Sau q trình ủ, quan sát khơng có + Sau q trình ủ, quan sát mẫu nấm mốc khác mọc ngồi nấm mốc cấy vào có nấm mốc khác mọc 33 Hình 4.14: Nếp cho nấm mốc R.microsporus ủ 60 34 Hình 4.15: Nếp cho nấm mốc L.ramosa ủ 60 35 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Phân lập giống nấm mốc mẫu bánh hồ giống nấm mốc mẫu bánh men thu thập công ty - Trong mẫu bánh hồ thu thập công ty chứa nhiều dạng khuẩn lạc khác nhau, khó kiểm sốt q trình đường hóa nếp nguyên liệu - Khi đường hóa nguyên liệu nếp mẫu bánh hồ thu thập công ty, khả đường hóa cho hàm lượng đường khử cao 70,2% - R.microsporus phân lập bánh men có khả đường hóa tinh bột cho hàm lượng đường khử (63,4%) cao so với nấm mốc L.ramosa có bánh hồ (60,8%) - Trên thực tế, sản xuất rượu nấm mốc Aspergillus awamori Aspergillus usami ứng dụng rộng rãi chúng có khả sinh nhiều enzym glucoamylase Theo lý thuyết, enzym có khả cắt liên kết α-1,6 mạch amylopectin nếp giúp thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucose Q trình đường hóa triệt để góp phần làm tăng hiệu suất thu hồi rượu - Qua kết nghiên cứu trên, đưa quy trình đề nghị sản xuất bánh hồ theo phương pháp cấy giống qua tuyển chọn nhằm đảm bảo chất lượng bánh hồ (hệ nấm mốc ổn định hơn, tránh tạp nhiễm từ giống nấm mốc có hại mơi trường), nâng cao hiệu suất thu hồi rượu trình bày Hình 5.1 Để có 50 g bánh hồ ướt cần: + Cám gạo 70%: chọn cám có kích thước lớn, lượng tinh bột cám phải chiếm 20%, không bị ẩm, mùi lạ mốc + Trấu 15%: Rửa sạch, loại bỏ sạn cát, để phơi khô 36 + Nước vô trùng: tạo độ ẩm 60% cho môi trường nhân giống Nước khử trùng theo phương pháp autoclave (nhiệt độ 120 – 121 oC, 1atm, 15 phút) nhằm tiêu diệt vi sinh vật nấm men, mốc, vi khuẩn… + Giữ giống ống nghiệm thạch nghiêng môi trường PDA Cám Trấu Phối trộn vị thuốc Độ ẩm 60% Hấp diệt trùng autoclave (121 oC,1atm, 15 phút) n Nước vô trùng Giống mốc Hòa bào tử 10 ml nước vô trùng Ủ ( To = 37 oC, 36 giờ) Chế phẩm hồ ướt Sấy ( to ≤ 40 oC) Thành phẩm (ẩm độ < 12%) Hình 5.1: Quy trình đề nghị sản xuất bánh hồ 37 5.2 Kiến nghị - Cải tiến lại phương pháp sản xuất bánh hồ truyền thống cách chủ động cấy giống nấm mốc vào bánh Trong trình sản xuất bánh hồ, ý khâu nuôi cấy nhân giống cần thực mơi trường vơ trùng - Có thể mua giống A.awamori, A.usami giữ giống, nuôi cấy nhân giống phục vụ cho sản xuất bánh hồ Hệ nấm mốc bánh hồ ổn định giống, q trình đường hóa triệt để nâng cao hiệu suất thu hồi rượu 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, 2007 Vi sinh vật thực phẩm Nhà xuất Y Học, Hà Nội, 301 trang Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học, tái lần thứ Nhà xuất Đại Học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh, 460 trang Vương Thị Việt Hoa, 2002 - 2003 Thực tập vi sinh đại cương Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm, 69 trang Lương Đức Phẩm, 2006 Chương Sản xuất cồn - rượu etylic (ethanol), nấm men công nghiệp Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, trang 94 - 286 Vương Thị Việt Hoa Chương Công nghệ sản xuất enzyme vi sinh vật, vi sinh thực phẩm Trang 28 - 39 Lâm Thanh Hiền,1999 Chương nấm mốc - nấm men, vi sinh vật học đại cương Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diêp, Nguyễn Thúy Hương Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh trường Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, trang 62 - 71 Chapter identification of the common food - borne fungi, introduction to food borne fungi Robert A Samson, Ellen S Hoekstra, Jens C Frisvad, Ole Filtenborg Pp - 166 Dương Ngọc Hân, 2003 Phân lập định danh nấm bánh men rượu - khảo sát trình lên men rượu nếp than Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Phạm Thị Mỹ Diện, 2010 Bước đầu nghiên cứu sản xuất rượu chưng cất từ hạt nhãn Đồ án tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 10 Trần Thị Hồng Chúc, 2008 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình bảo quản rượu nếp than sản xuất công nghệ enzym nấm men chủng Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Công Nghệ Thực Phẩm, Đại học Cần Thơ, Việt Nam 11 Phạm Thanh Duy, Lê Thị Liên Lên men rượu từ tinh bột Truy cập ngày 10 tháng năm 2011 TP Hồ Chí Minh 39 PHỤ LỤC Phân lập nấm mốc - Môi trường nuôi cấy: PDA (Potato Dextrose Agar)  Môi trường pha sẵn: 39,5 g  Nước cất: 1000 ml Cách pha chế môi trường ni cấy: + Cân xác mơi trường cho vào bình tam giác chứa sẵn lít nước + Khuấy cho tan hết, hấp tiệt trùng autoclave thời gian 15 phút 121 oC Phân phối khoảng 20 -25 ml môi trường vào đĩa petri vô khuẩn - Cách tiến hành phân lập: phân lập theo phương pháp pha loãng mẫu 1.1 Phân lập nấm mốc bánh hồ Pha loãng g bánh hồ với ml nước cất vô trùng ta nồng độ pha lỗng10-1 Tiếp tục dùng micropipet vơ trùng hút ml dịch pha lỗng 10-1 vào ống nghiệm có chứa ml nước cất ta nồng độ pha loãng 10-2, tương tự thu nồng độ pha lỗng 10-5 Đổ mơi trường PDA vào đĩa petri vô trùng để đông Dùng micropipet hút 0,1 ml dd pha loãng nồng độ 10-5 vào đĩa petri chứa môi trường thạch PDA, lấy que gạt vô khuẩn trải mẫu lên mặt thạch Các thao tác thực lửa đèn cồn Đậy nắp đĩa lại để thạch thấm hút hết mẫu vài phút Lật úp ngược đĩa thạch lại đem ủ tủ ấm nhiệt độ 37 oC 72 Mẫu đối chứng cho nhiễm nấm mốc từ môi trường suốt trình phân lập làm sau: để mở nắp đĩa thạch môi trường PDA suốt trình thao tác, kết thúc trình đậy nắp đĩa đem ủ nhiệt độ 37 oC 72 Sau 72 đem quan sát so sánh với mẫu nấm mốc đối chứng Loại bỏ khuẩn lạc mang đặc điểm giống khuẩn lạc mẫu đối chứng Chọn khuẩn lạc mang đặc điểm khác nhau, dùng que cấy thước thợ cẩn thận thu bào tử khuẩn lạc cấy chấm đĩa thạch PDA Đem ủ 37 oC 72 Lặp lại - lần đến thu khuẩn lạc Kiểm tra khuẩn lạc quan sát khuẩn lạc mắt thường, kính hiển vi 40 1.2 Phân lập mốc mẫu bánh men Pha loãng g bánh men với ml nước cất vô trùng ta nồng độ pha lỗng10-1 Tiếp tục dùng micropipet vơ trùng hút ml dịch pha lỗng 10-1 vào ống nghiệm có chứa ml nước cất ta nồng độ pha loãng 10-2, tương tự thu nồng độ pha lỗng 10-5 Đổ mơi trường PDA vào đĩa petri vô trùng để đông Dùng micropipet hút 0,1 ml dd pha loãng nồng độ 10-5 vào đĩa petri chứa môi trường thạch PDA, lấy que gạt vô khuẩn trải mẫu lên mặt thạch Các thao tác thực lửa đèn cồn Đậy nắp đĩa lại để thạch thấm hút hết mẫu vài phút Lật úp ngược đĩa thạch lại đem ủ tủ ấm nhiệt độ 37 oC 72 Mẫu đối chứng cho nhiễm nấm mốc từ môi trường suốt trình phân lập làm sau: để mở nắp đĩa thạch môi trường PDA suốt trình thao tác, kết thúc trình đậy nắp đĩa đem ủ nhiệt độ 37 oC 72 Sau 72 đem quan sát so sánh với mẫu nấm mốc đối chứng Loại bỏ khuẩn lạc mang đặc điểm giống khuẩn lạc mẫu đối chứng Chọn khuẩn lạc mang đặc điểm khác nhau, dùng que cấy thước thợ cẩn thận thu bào tử khuẩn lạc cấy chấm đĩa thạch PDA Đem ủ 37 oC 72 Lặp lại - lần đến thu khuẩn lạc Kiểm tra khuẩn lạc quan sát khuẩn lạc mắt thường, kính hiển vi Định lượng đường khử phương pháp Bertrand (Theo TCVN 1990 165.64) Cách tiến hành: Cân g mẫu ủ nghiền nhỏ đem tiến hành khử tạp chất cách thêm ml dung dịch acetate chì 30% vào bình định mức 100 ml, lắc để lắng phút Cho tiếp 20 ml dd Na2SO4 bão hòa để loại chì thừa, lắc để kết tủa lắng xuống Thêm tiếp nước cất đến vạch 100 ml, lắc lọc qua giấy lọc Dịch lọc thu đem tiến hành định lượng đường khử Tiến hành định lượng đường khử: hút 10 ml dung dịch đường cần khảo sát 10 ml thuốc thử Fehling vào bình tam giác 250 ml Đậy nắp đem đun sôi khoảng phút, kết tủa đỏ xuất hiện, lấy để nguội 41 Lọc rửa kết tủa vài lần nước ấm dịch lọc khơng phản ứng kiềm với giấy quỳ Hòa tan kết tủa Cu2O giấy lọc vào bình tam giác cách cho từ từ khoảng 30 ml Fe2(SO4)3 H2SO4 dùng đũa khuấy cẩn thận để hòa tan hoàn toàn kết tủa Chuẩn độ KMnO4 1/30N đến xuất màu hồng nhạt bền 20 - 30 s Cơng thức tính kết quả: X= a: số mg glucose tìm tra bảng ứng với số ml KMnO4 1/30N dùng để chuẩn bị mẫu phân tích trừ số ml KMnO4 1/3N dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng (nước) V: Thể tích pha lỗng mẫu (100 ml) V1: Thể tích mẫu lấy đem xác định đường khử m: Lượng mẫu đem phân tích 1000: Hệ số đổi gam thành mg Bảng 3.1: Tỉ lệ KMnO4 1/30N đường khử KMnO4 1/30N (ml) Glucose (mg) 0,2 0,8 1,8 2,8 3,9 5 6,1 7,2 8,3 9,3 10 10,4 42 Kết phân tích hàm lượng đường khử: Bảng 4.12: Hàm lượng đường khử tạo thành sau ủ 60 % hàm lượng đường khử sau ủ 60 Giống Lần Lần Lần Hỗn hợp giống ban đầu 64,8 70,2 75,6 L.ramosa 58,6 64,4 59,4 R.microsporus 63,7 56,6 69,8 51 47 55,4 L.ramosa+R.microsporus Kết phân tích phương sai phần mềm Minitab for window One - way ANOVA: Ham luong duong khu versus giong Analysis of Variance for Ham luon Source DF SS MS F P Gióng 561,2 187,1 7,46 0,011 Error 200,7 25,1 Total 11 761,9 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev 70,200 5,400 60,800 3,143 3 63,367 6,606 51,133 4,202 + -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) ( -* ) ( * ) + -+ -+ -+ Pooled StDev = 5,008 50 43 60 70 80 ...XÁC ĐỊNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐƯỜNG HÓA CỦA NẤM MỐC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU LÀNG NGHỀ PHÚ LỄ Tác giả LÊ THỊ MAI LINH Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp... men rượu đánh giá quan trọng Để làm rõ vấn đề định thực đề tài Xác định khảo sát khả đường hóa nấm mốc dùng trình lên men rượu làng nghề Phú Lễ 1.2 Mục đích đề tài: - Xác định giống mốc hệ men, hồ... đạt ii TÓM TẮT Hệ nấm mốc bánh hồ men vi sinh yếu tố quan trọng định đến hiệu suất thu hồi rượu Đề tài: Xác định khảo sát khả đường hóa nấm mốc trình lên men rượu làng nghề Phú Lễ nhằm mục đích