Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc thành phần sinh khối cellulose 1.1.1 Cấu trúc cellulose Cellulose polimer cấu thành từ đơn phân glucose liên kết β-1,4 glycoside, vật liệu chủ yếu vách tế bào thực vật nguồn carbohydrate phong phú tự nhiên Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000 Các chuỗi cellulose gần liên kết với tạo thành cellulose qua liên kết hydrogen liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43] Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ xếp thành đơn vị lớn gọi sợi bản, sau bó thành sợi lớn gọi vi sợi cấu trúc thành sợi cellulose Sợi cellulose bền vững liên kết nội phân tử liên kết hydrogen nội phân tử Sự xắp xếp chuỗi riêng lẻ bên sợi tìm hiểu từ phân tích tán xạ tia X [23] Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm cấu trúc cố định vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với vị trí khác Chúng có khả ngăn ngừa xâm nhập khơng enzym mà chí phân tử nhỏ nước Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, sai sót cấu trúc tinh thể dẫn đến hình thành nhóm sợi cellulose có cấu trúc vơ định hình Sợi cellulose có cấu trúc bất quy tắc khác như: chỗ xoắn vi sợi, lỗ trống bề mặt, lỗ, hốc nhỏ số mạch nhỏ Tổng diện tích tiếp xúc sợi cellulose lớn bề mặt tinh thể cấu trúc kích thước Sự không đồng cấu trúc làm cho sợi bị hydrate nước nhúng vào môi trường lỏng cho phép xâm nhập phân tử lớn bao gồm enzym thủy phân cellulose [23] Phân tử cellulose bền vững, với thời gian bán rã 5-8 triệu năm cho phân cắt liên kết β-1,4 glycoside 25oC Trong khi, trình phân hủy sinh học thường nhanh cung cấp dòng carbon cho khí [43] Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1.1.2 Thành phần sinh khối thực vật Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng nửa nguồn carbon sinh Người ta ước tính lượng carbon thực vật đồng hóa hàng năm khoảng 200 tỷ [29] Khoảng 70% sinh khối thực vật cấu thành từ đơn vị đường chứa 5, carbon [27] Phân tử cellulose kết hợp thành sợi có cấu trúc tinh thể hình thành nên khung cho vách tế bào thực vật Sợi cellulose liên kết chéo với polysaccharide khác gọi hemicellulose để làm tăng độ bền cho vách tế bào Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân -D-xylose với liên kết 1,4-), glucomannan (đơn phân -D-mannose -D-glucose với liên kết -1,4-), xyloglucan (đơn phân -D- glucose với liên kết 1,4-, -D-xylose -D-glucose với liên kết -1,6-), 1,3-1,4-glucan (đơn phân -D-glucose với liên kết -1,3- -1,4-), số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm -D-glucose, -D-xylose, -D-mannose đơn vị đường khác với liên kết khác Bộ khung cellulose hemicellulose liên kết với pectin (đơn phân -D-galacturonic acid với liên kết chủ yếu -1,4-), với chức chất gắn vách tế bào [23] Thành phần cấu trúc vách tế bào có khác biệt lớn loài thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50% trọng lượng khô thực vật Trong số trường hợp, sợi cellulose gắn vào mạng lưới sợi sinh học khác, chủ yếu hemicellulose chiếm khoảng 20 đến 35% lignin chiếm khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật [23] Lignin, diện với cellulose nhiều loài thực vật giúp làm cứng vách tế bào thực vật Các loại thực vật khác có thành phần lignin khác Tuy nhiên, diện lignin ngăn cản chuyển đổi polysaccharide thành đơn phân tác động enzym [6] Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Hình 1.1 Cấu trúc cellulose vách tế bào thực vật [46] Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp so với cellulose khiết không thành phần phức tạp chúng mà cấu trúc đa dạng tế bào thực vật Tế bào thực vật khác kích thước tổ chức Một số loại tế bào thực vật có vách mỏng, bị lignin hóa dễ dàng bị thủy phân enzym thủy giải polysaccharide [23] Sinh khối thực vật khó khăn việc thủy giải vì: chúng liên kết với hemicellulose, bao bọc lignin có cấu trúc tinh thể có khả hình thành sáu liên kết hydrogen: bốn liên kết nội phân tử hai liên kết liên phân tử Do đó, trước thủy giải với enzym, việc tiền xử lý cần thiết để gia tăng diện tích bề mặt cellulose cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicellulose, phá vỡ cấu trúc tinh thể gia tăng cấu trúc lỗ tinh thể [11] 1.2 Các chủng sinh vật sinh cellulase 1.2.1 Nấm mốc Nhiều vi sinh vật có khả phân hủy cellulose có vài vi sinh vật có khả phân hủy hiệu cellulose tinh thể [27] Các sinh vật phân hủy cellulose hiếu khí vi khuẩn nấm, sử dụng cellulose thơng qua sản xuất Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên số lượng lớn cellulase ngoại bào dịch ni cấy, có diện bề mặt tế bào Hầu hết loài nấm có khả sử dụng cellulose nguồn chất cho phát triển Nhiều loài nấm ngun thủy, lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả thủy giải cellulose vùng ruột động vật nhai lại Khả thủy giải cellulose tìm thấy nhiều lồi nấm kị khí khác [23] Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, vài lồi thuộc giống Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose Trái lại, ngành nấm Ascomycete, Basidiomycete Deuteromycete, ngành có 15,000 lồi, thủy giải mạnh cellulose Nhiều giống nấm thu hút nhiều nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose gỗ như: Chaetomium Helotium (Ascomycete); Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum Serpula (Basidiomycete); Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium Trichoderma (Deuteromycete) [23] Nấm mốc thuộc giống Trichoderma Aspergillus hai loài sản xuất số lượng lớn cellulase có nhiều sản phẩm thương mại dùng cơng nghiệp Trichoderma sản xuất lượng lớn endo-ß-glucanase exo-ß-glucanase với mức độ thấp ß-glucosidase, giống Aspergillus sản xuất số lượng lớn endo-ß-glucanase ß-glucosidase với số lượng thấp exo-ßglucanase [27] Phức hợp cellulase Trichoderma reesei chuyển đổi hồn tồn cellulose tự nhiên dẫn xuất cellulose thành glucose Sự phát triển loại nấm sản xuất loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ ánh sáng, khơng khí mơi trường xung quanh [34] Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả sử dụng cellulose tinh thể nguồn carbon Chúng tạo nhiều loại cellulase ngoại bào, có vạch có hoạt tính endoglucanase điện di gel polyacrylamide Hoạt tính CMCase tối ưu 65°C pH 2, cho thấy loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt acid [13] Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 1.2.2 Vi khuẩn sản xuất cellulase Trong số loài vi khuẩn, khả thủy giải cellulose tìm thấy hai bộ: Actinomycetales hiếu khí Clostridiales kị khí Dựa vào đặc điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose thấy bao gồm nhóm sinh lí sau [23]: o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor) o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas Thermobifida) o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, Sporocytophaga) Thông thường, vài lồi giống có hoạt tính thủy giải cellulose Các vi khuẩn khác việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối cellulose môi trường tự nhiên Việc phân loại vi khuẩn kị khí sử dụng cellulose phức tạp gần nhiều chủng vi khuẩn khơng có khả thủy giải cellulose lại có hệ thống gen cellulosome khơng biểu sai hỏng trình tự promoter lồi Clostridium acetobutylicum [33] Bảng 1.1 Đặc điểm sinh lý số vi khuẩn thủy giải cellulose [23] Tiêu thụ oxy Hiếu Khí Giống Lồi tiêu biểu Gram Kiểu hình To tối ưu Tạo bào tử Di động Hệ thống cellulase Acidothermus A cellulolyticus + Que - - Bacillus B pumilis + Que C cellovorans + Que Nội bào tử - Flagellar Caldibacillus Cellulomonasc + Que - Flagellar - Flagellar - Que cong Que - Cytophaga C flavigena, C uda C fulvus, C gilvus C hutchinsonii - Gliding Erwinia C carotovora - Que - Flagellar Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Không phức hợp Micromonospora M chalcae + Bào tử - Pseudomonas - Sporocytophaga P fluorescens var cellulosa S myxococcoides - que Flagellar Không phức hợp Gliding Không phức hợp Rhodothermus R marinus que Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Trung bình Ưa nhiệt Cellvibrio Que sợi que Bào tử Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Kị Khí Hồng Ngun Streptomyces S reticuli + Thermobifida T fusca + Acetivibrio D cellulolyticus - Anaerocellum D thermophilum + Butyrivibrio B fibrisolvens + Caldicellulosiruptor C saccharolyticum Clostridium C thermocellum, C cellulolyticum Que sợi Que sợi Que cong Que - Que cong Que + Que Eubacterium E cellulosolvens + Que Fervidobacterium F islandicum - Que Fibrobacter F succinogenes - Que Halocella H cellulolytica - Que Ruminococcus + Cầu Spirochaeta R albus, R flavefaciens S thermophila + Xoắn Thermotoga T neapolitana - Que Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt, trung bình Trung bình Ưa nhiệt Trung bình Trung bình Trung bình Ưa nhiệt Ưa nhiệt Bào tử - Bào tử - - - - Flagellar Không phức hợp Flagellar Không phức hợp Flagellar Không phức hợp Flagellar Phức hợp Nội bào tử Không phức hợp Không phức hợp Phức hợp - - - Que - - - Flagellar Không phức hợp Phức hợp - Phức hợp Khơng phức hợp Các nhóm vi khuẩn kị khí hiếu khí có khác chế thủy giải cellulose Hầu hết vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thơng qua hệ thống cellulase phức hợp tổ chức tốt polycellulosome Clostridium thermocellum [33] Mặc dù, vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas giống vi khuẩn kị khí tùy ý có hoạt tính phân hủy cellulase Các vi khuẩn thủy giải cellulose hiếu khí đất thường tìm thấy: Bacillus, Micromonospora Thermobifida [23] Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR phân lập từ suối nước nóng tạo vài loại cellulase bền nhiệt Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất loại endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C hoạt tính đến 70% 75°C sau ủ 30 phút Chủng vi khuẩn cho thấy có Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun nhiều tiềm dùng cơng nghiệp lọc dầu khả chịu nhiệt độ cao [27] Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp JXL có khả sử dụng nhiều loại chất cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose xylose Enzym Brevibacillus sp JXL có khả bền nhiệt cao, giữ 50% sau xử lý 100°C 1.3 Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 1.3.1 Đặc điểm chung 1.3.1.1 Cơ chất ưu tiên Những lồi vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus Clostridium) thường giới hạn phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển cellulose sản phẩm thủy phân chúng không phát triển đường đơn, đường đôi, đường đa cấu thành đơn phân khác glucose C thermocellum phát triển chậm môi trường glucose C thermocellum R albus dùng cellobiose ưu tiên so với glucose Một vài lồi vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose sử dụng xylan [23] Một vài báo cáo gần cho thấy vi khuẩn kị khí phân giải cellulose (Anaerocellum thermophilum, C saccharolyticus Halocella cellulolytica) có phạm vi rộng việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác với hợp chất tinh bột, đường đơn, đường đa Các chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, khoáng đa lượng, vi lượng số loại vitamin Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần yếu tố cho phát triển mạnh pepton hay dịch chiết nấm men [23] 1.3.1.2 Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe (CEM) Sự biến dưỡng cellulose thủy phân cellulose thành loại đường đơn đơi sau sử dụng sản phẩm thủy giải Có cách thủy giải cellulose [23]: Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun o Vi khuẩn hiếu khí nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào oxy hóa sản phẩm thủy phân thành CO2 nước o Vi khuẩn nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme cellulase vào cellulose, sản xuất phức hợp cellulase tổ chức thành cellulosome tạo nhiều sản phẩm lên men khác Yêu cầu cho thủy giải cellulose liên kết enzym vào cellulose hình thành phức hợp enzyme-cơ chất hình thành phức hợp CEM [23] Chủng đột biến C thermocellum F succinogenes khơng có kết dính giảm khả thủy phân cellulose Do đó, gắn kết phức hợp CEM yêu cầu quan trọng cho sử dụng cellulose vi khuẩn kị khí, tác nhân quan trọng cho thủy giải cellulose [23] Phức hợp CEM có nhiều thuận lợi hoạt tính thủy giải cellulose môi trường nuôi cấy: tập trung enzym bề mặt cellulose, cho phép vi sinh vật thủy giải cellulose tiếp xúc với sản phẩm thủy phân, bảo vệ vi khuẩn tác động bacteriophage enzym thủy giải protease mơi trường Nhìn chung, việc tạo yếu tố liên kết cellulose có nhiều lợi ích việc tiết kiệm phí tổn lượng cho vi khuẩn [23] 1.3.1.3 Sự hấp thu biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose Sự hấp thu glucose cellodextrin tìm thấy nhiều lồi thủy giải cellulose C thermocellum cho thấy hấp thu [14C]cellobiose cellodextrin hệ thống phụ thuộc ATP glucose hấp thụ theo chế riêng biệt phụ thuộc ATP Sự sụt giảm vận chuyển cellobiose cellodextrin nhanh chóng giảm nồng độ ATP nội bào Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Hình 1.2 Sự hấp thu carbohydrate phosphoryl hóa C.thermocellum [35] Chú thích: G-1-P, glucose-1-phosphate; G-6-P, glucose-6-phosphate; Pi, phosphate vơ cơ; CBPase, cellobiose phosphorylase; CDPase, cellodextrin phosphorylase; HK, hexokinase; PGM, phosphoglucomutase Chủng vi khuẩn thủy giải cellulose Streptomyces reticuli sản xuất protein ABC (ATP-binding cassette protein) có khả hỗ trợ vận chuyển cellobiose, cellotriose cellodextrin Trái lại, F succinogenes dùng nồng độ điện hóa cho hấp thu glucose cellobiose Sự yêu cầu Na+ cho phát triển cellulose cho thấy Na+ động lực cho hấp thụ cellodextrin [26] Nồng độ cellodextrin chất khác cellulose cellobiose định đường biến dưỡng cellodextrin phân cắt thủy giải phosphoryl hóa hay thủy giải khơng phosphoryl hóa Sự điều hòa dòng chất thơng qua hai đường biến dưỡng có lẽ cung cấp phương cách để điều chỉnh cung cấp ATP đáp ứng với yếu tố môi trường Sinh khối tế bào gia tăng với gia tăng chiều dài chuỗi cellodextrin, sản lượng tế bào cellulose cao cellobiose [26] Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Nguyên 1.3.1.4 Sự biến dưỡng lên men sản phẩm sau Đối với Clostridium R albus, ethanol H2 sản phẩm biến dưỡng cuối acetyl coenzyme A (acetyl-CoA) có vai trò quan trọng tạo ethanol acetate [14] Sự sản xuất ethanol nuôi cấy mẻ C thermocellum gia tăng cho thêm acetate lactate sụt giảm cho thêm ethanol [23] Chủng Anaerocellum thermophilum chủng số vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose, tạo lactate sản phẩm lên men cellulose [38] Sản phẩm cuối điều hòa vài mức độ: nồng độ chất trung gian, sản phẩm lên men, chất mang electron, hoạt tính tổng hợp enzym Chủng F succinogenes S85, R albus 7, R flavefaciens FD-1 thay đổi sản phẩm lên men thay đổi tỷ lệ phát triển, pH, nguồn carbohydrate tự nhiên C cellulolyticum C thermocellum có gia tăng tỉ lệ chuyển đổi ethanol thành acetate thay đổi tỷ lệ sản phẩm sau có diện dịch chiết nấm men môi trường [23] Hầu hết vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose phát triển tối ưu tiếp xúc trực tiếp với chất, vài loài tiếp xúc bắt buộc Giống vi khuẩn kị khí khác, vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose thường có sinh khối thấp, phần lớn chất chuyển thành sản phẩm lên men khác nhau: ethanol, acid hữu cơ, CO2 H2 [23] 1.3.2 Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình Clostridium thermocellum: vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, thủy giải cellulose có khả sinh ethanol, chuyển đổi trực tiếp chất cellulose thành ethanol Chúng phân hủy vật liệu cellulose thông qua phức hợp cellulase lớn gọi cellulosome Đây phức hợp protein phức tạp bao gồm khoảng 20 loại enzym có hoạt tính xúc tác khác có trọng lượng từ 40-180 KDa Cellulosome C thermocellum nghiên cứu nhiều dùng kiểu mẫu nghiên cứu cellulosome lồi khác Enzym thủy giải cellulose mơi trường nuôi cấy C thermocellum phân bố dịch lỏng bề mặt tế bào [23] 10 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun chiếm vai trò khơng lớn q trình thủy giải cellulose, chúng chiếm không tới 20% tổng số cellulase [40] T reesei tạo hai loại ß-glucosidase tham gia thủy giải cellobiose oligosaccharide thành glucose Cả hai loại BGLI BGLII thu nhận dịch nuôi cấy gắn lên vách tế bào ß-glucosidase vách tế bào làm giảm khả glucose vào môi trường thủy phân cellobiose T reesei sản xuất ß-glucosidase thấp loại nấm khác Aspergillus Sp Hơn nữa, ß-glucosidase T reesei bị kìm hãm mạnh glucose so với Aspergillus Trong công nghiệp nay, cellulase T reesei bổ sung với ß-glucosidase Aspergillus làm tăng khả đường hóa chúng [31] Loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium dùng cho nghiên cứu phân hủy lignocellulose Chúng tạo nhiều phức hợp enzym phân hủy cellulose, hemicellulose, lignin thành phần chủ yếu vách tế bào thực vật Sự phân hủy cellulose hemicellulose thường xảy trước, biến dưỡng lignin xảy sau có giới hạn nguồn carbon, nitrogen, sulfur [23] 1.4.5 Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 1.4.5.1 Đặc điểm chung Những vi khuẩn kị khí thiếu khả xâm nhập vào bên vật liệu cellulose chúng phải tìm chế hữu hiệu cho phân hủy cellulose có diện cạnh tranh nhiều vi sinh vật khác bị giới hạn ATP cho tổng hợp cellulase Điều dẫn đến phát triển “Hệ thống cellulase phức hợp”, gọi cellulosome, thường tìm thấy loài Clostridia Ruminococcus [23] Các cellulosome kết hợp với tạo thành polycellulosome gắn lên vách tế bào có đường kính 60-200 nm Mỗi polycellulosome chứa đựng vài trăm cellulosome [7] Cellulosome phức hợp ngoại bào lớn tương đối bền vững, trọng lượng phân tử từ 2-16 MDa cellulosome đạt đến trọng lượng 100 MDa polycellulosome [12], [33] Cellulosome phát lần đầu Bayer Lamed quan sát 16 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên thấy khối u bề mặt tế bào C thermocellum phức hợp chứa protein khơng có hoạt tính xúc tác có chức gắn liên kết tiểu đơn vị enzym Cellulosome không phân hủy cellulose tinh thể, mà c òn p hâ n hủ y hemicellulose, chitin, chí pectin [12] Cellulosome có khả phối hợp hoạt tính enzym không gian gần với vách tế bào vi khuẩn có khả phối hợp hoạt tính cellulase diện bên cellulosome Cellulosome thường chứa đến 13% carbohydrate, có vai trò bảo vệ khỏi hoạt tính protease có vai trò quan trọng nhận diện cohensin [23] Các sản phẩm thủy giải cellulose tế bào hấp thu tốt có tiếp xúc với vách tế bào [34] Cellulosome gắn kết linh hoạt với cellulose tinh thể [12] Cellulosome tìm thấy nhiều loài vi khuẩn: C cellulovoran, C cellulolyticum, C josui, C acetobutylicum, Acetovibrio cellulolyticus, Bacteroides cellulosolvens, R albus, R flavefaciens, Vibrio sp nhóm nấm kị khí Neocallimastix, Piromyces Orpinomyces [11], [23] Thành phần quan trọng cellulosome protein scaffoldin khơng có hoạt tính xúc tác, có chức tập hợp tiểu đơn vị cellulase Các tiểu đơn vị xúc tác chứa vùng dockerin khác có trách nhiệm gắn vào scaffoldin Mối quan hệ thể v ù n g cohesin scaffoldin, gắn kết với vùng, dockerin enzyme CBD scaffoldin liên kết phức hợp với cellulose [11] Có tám gen scaffoldin từ vi khuẩn thủy giải cellulose giải trình tự Chúng bao gồm cipA C thermocellum, cbpA C cellulovoran, cipC C cellulolyticum, cipA C josui, cipA C acetobutylicum , scaB R flavefacien, cipBc B cellulosolven cipV A cellulolyticus Phức hợp cellulosome C thermocellum tương tự lồi vi khuẩn ưa nhiệt trung bình C cellulovoran C cellulolyticum [11] Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome [12] Chủng vi khuẩn Nhiệt độ tối ưu Nguồn phân lập Acetivibrio cellulolyticus M Sewage Bacteroides cellulosolvens M Sewage Butyrivibrio fibrisolvens M Rumen 17 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Clostridium acetobutylicum M Soil Clostridium cellulovorans M Wood fermenter Clostridium cellobioparum M Rumen Clostridium cellulolyticum M Compost Clostridium josui M Compost Clostridium papyrosolvens M Paper mill Clostridium thermocellum T Sewage soil Ruminococcus albus M Rumen Ruminococcus flavefaciens M Rumen Ruminococcus succinogenes M Rumen M, mesophilic; T, thermophilic (trên 50°C) Mặc dù, C acetobutylicum không thủy phân cellulose, p h â n t í c h trình tự genome cho thấy có diện nhóm gen mã hóa cho cellulosome Nhóm gen bao gồm gen mã hóa protein scaffolding CipA, endocellulase Cel48A, vài endoglucanase nhóm 9, mannanase Man5G protein kị nước, OrfXp Tổ chức gen tương đồng với C cellulolyticum [11], [6] 1.4.5.2 Cấu trúc cellulosome Hình 1.5 Cấu trúc cellulosome C thermocellum [12] 18 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Scaffolding protein (scaffoldin) Cellulosome bao gồm protein scaffolding, kết hợp với nhiều loại enzym cellulosome Protein scaffolding, gọi “scaffoldin”, protein khơng có hoạt tính xúc tác gồm nhiều cohesin vùng CBD, vùng ưa nước, vùng dockerin II, vùng có hoạt tính enzym nhiều vùng chức chưa xác định scaffoldin [6], [12] Cohesin Dockerin Các cohesin diện scaffoldin có vị trí liên kết với vùng dockerin enzym cellulosome Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò quan trọng xắp xếp cellulosome Số lượng cohesin có scaffoldin khác lồi Có tương đồng trình tự amino acid cohesin từ lồi khác Tuy nhiên, cohesin có chuyên biệt tương tác với dockerin, cohesin C thermocellum không tương tác với dockerin C cellulolyticum ngược lại [6], [12] Có hai loại cohesin: cohesin loại I gắn chuyên biệt với dockerin loại I tiểu đơn vị xúc tác, cohesin loại II protein bề mặt tế bào gắn kết dockerin loại II scaffoldin vào vách tế bào Tất enzyme thuộc cellulosome chứa vùng dockerin Nếu enzyme không chứa dockerin, chúng thành phần cellulosome [11] Ở lồi C thermocellum, trình tự genome cho thấy có 72 protein chứa dockerin có chín cohesin phân tử scaffoldin Cohesin có độ tương đồng cao năm số có tương đồng 90% Cohesin chủng nhận biết gần tất dockerin chủng [9] CelD endoglucanase hoạt động nhất, scaffoldin gia tăng hoạt tính CelD 10 lần avicel khơng có hoạt tính CelD thiếu dockerin [11] Calcium kim loại cellulosome, tương tác dockerin cohesin yêu cầu Ca2+ nhiều lồi C thermocellum C cellulolyticum Do đó, cellulosome bị phân rã nồng độ EDTA trung bình EDTA kìm hãm hoạt tính cellulosome chúng có khả gắn kết với Ca2+ [15] Endoglucanase D có ba vị trí gắn Ca2+ vị trí gắn kết kẽm Ca2+ gia tăng tính bền nhiệt cho exoglucanase CelS, enzyme nhiều 19 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun cellulosome Sự gấp cuộn protein tạo thành dockerin phụ thuộc Ca2+, giải thích Ca2+ cần thiết cho tương tác cohesin-dockerin khả bền vững cellulosome [25] Các thành phần cellulosome bị phân rã xử lý với SDS-EDTADTT Cellulosome bị phân rã điều kiện khơng biến tính ủ nhiệt độ 60°C có diện EDTA cellulose tinh thể Trong trình phân tách, scaffoldin gắn vào cellulose tiểu đơn vị bị phóng thích [11] Cellulosome bị phân rã mà khơng hoạt tính thủy giải cellulose tinh thể dùng đ ệ m 50 mM Na acetate (pH 5.0) chứa 10 mM DTT, 10 mM EDTA 0.2% SDS 30°C 25 phút [9] Cellulose-Binding Domain Vùng liên kết carbohydrate (CBD) scaffoldin liên kết chặt chẽ cellulosome với chất cellulose CBD liên kết cellulosome với cellulose tinh thể hiệu cellulose vơ định hình [12] Sự tương tác CelS, CelD endoglucanase scaffoldin với chất cellulose thông qua cấu trúc CBD Các CBD khác gắn vị trí khác cellulose tinh thể S o s n h g i ữ a CBD CipA loài C thermocellum với hai loại T.reesei Cellulomonas fimi, CBD CipA có nhiều vị trí kết hợp với phân tử cellulose [11] CBD CipA lồi C thermocellum tạo dòng, biểu E coli, cấu trúc chúng xác định CBD gắn kết với Ca2+ mà chức chưa biết đến Cấu trúc CBD CipC loài C cellulolyticum xác định Chúng bao gồm vị trí gắn kết bề mặt gắn kết cellulose rãnh cạn với chức chưa biết đến [11] 1.4.5.3 Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào Vùng HLD hay S-layer homology (SLH) C cellulovoran có vai trò quan trọng liên kết cellulosome với bề mặt tế bào [31] Cellulosome gắn vào tế bào suốt pha lag, phóng thích vào mơi trường pha tăng trưởng, tồn tự môi trường gắn vào cellulose pha ổn định Tất protein cellulosome tiết ngoại bào gắn kết 20 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun bề mặt tế bào Sự gấp cuộn protein dockerin phụ thuộc Ca2+, xắp xếp cấu trúc cellulosome dễ dàng có diện Ca2+ bên ngồi tế bào [12] Hình 1.6 Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào thông qua tương tác cohesion-dockerin loại II với protein chứa vùng SLH, SdbA, Orf2p OlpB [11] Đầu cuối gen cipA gen loài C thermocellum ba khung đọc mở (ORF) mã hóa cho protein bề mặt tế bào Vùng SLH diện polypeptide liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn hình thành liên kết khơng cộng hóa trị với peptidoglycan vách tế bào Ba gen mã hóa gọi olpA, olpB, orf2p Gen thứ tư, sdbA, mã hóa cho protein bề mặt tế bào khác, phần khác diện genome [11] Protein OlpA định vị bề mặt tế bào C thermocellum Do đó, có giả thuyết cho vùng chịu trách nhiệm gắn cellulosome vào bề mặt tế bào OlpA có vùng cohesin loại I gắn kết với enzym cellulosome thông qua dockerin loại I Gene olpB mã hóa OlpB, định vị bề mặt tế bào [11] Protein SdbA C thermocellum có vùng cohesin loại II gắn chuyên biệt vào dockerin loại II CipA SdbA gắn thông qua vùng SLH chúng 21 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun với lớp S-layer tế bào, liên kết trực tiếp với lớp peptidoglycan vách tế bào Thực vậy, gắn kết CipA bề mặt tế bào xảy vùng dockerin CipA vùng cohesin loại II OlpB, ORF2p SdbA SdbA có vùng cohesin, Orf2p có hai vùng cohesin, OlpB có bốn cohesin, liên kết với một, hai bốn phân tử scaffoldin, tương ứng [11] Một vài enzyme không thuộc cellulosome lồi C thermocellum, liên kết trực tiếp với bề mặt tế bào, e.g., xylanase XynX, khơng có vùng dockerin có nhiều đoạn SLH [11], [6] 1.4.5.4 Sự xếp cellulosome Cấu trúc không gian ba chiều hai cohesin loại I C thermocellum C cellulolyticum làm sáng tỏ phân tích cấu trúc tinh thể X-ray Cohesin loại II CipA C thermocellum hình thành hình thể cuộn tròn bao gồm β-sheet [11] Vùng cohesin C cellulolyticum có gấp cuộn tương đồng với cohensin C thermocellum Cấu trúc cohesin cho thấy tất cohesin tương tự gấp cuộn hình thể Tương tác cohesin-dockerin loại I mạnh có diện Ca2+ Ái lực cao giải thích bền vững cấu trúc bậc bốn cellulosome môi trường ngoại bào [11] CelS protein thuộc cellulosome với cấu trúc bậc ba vùng dockerin vùng xúc tác đ ã xác định Phân tích phổ NMR, cho thấy Ca2+ kích thích gấp cuộn vùng dockerin thành cấu trúc bậc Sự gấp cuộn phụ thuộc Ca2+ có lẽ chế ngăn ngừa CelS gấp cuộn thành hình thức hoạt động tế bào chất, nơi mà nồng độ Ca2+ khoảng 1mM Sự thiếu Ca2+ chống lại gắn kết tiểu đơn vị xúc tác với scaffoldin trước tiết ngoại bào [11] Vùng dockerin chuyên biệt hai vị trí liên kết Ca2+ với trình tự giống trình tự xoắn-vòng-xoắn (EF-hand motif) Cấu trúc bao gồm hai xoắnvòng gắn kết với Ca2+ gắn kết với linker; xoắn E vòng motif EF-hand cổ điển khơng có vùng dockerin Mỗi tiểu vùng liên kết dockerin với Ca2+ ổn định nhóm chuỗi kị nước sâu bên [11] Dockerin có cấu trúc đối xứng Tương tác cohesin-dockerin loại I hình 22 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên thành phức hợp 1:1 Chứng tỏ hai dockerin đối xứng dùng để gắn kết với cohesin Trong cấu trúc cohesin không thay đổi phức hợp, dockerin trải qua thay đổi hình thể cấu trúc hòa tan cho thấy đối xứng gần hoàn toàn chúng Trong số trường hợp, cohesin gắn kết ưu tiên đoạn thứ hai dockerin, cho thấy đoạn thứ dockerin có lẽ cung cấp vị trí gắn kết thứ 2, có khả hình thành phức hợp 1:2 (1 dockerin với cohesin), thứ bậc cao cấu trúc cellulosome [11] Hình 1.7 Cấu trúc phức hợp Coh-XDoc loại II lồi C thermocellum [5] Chú thích: Cohesin loại II màu xanh dương, vùng dockerin loại II màu xanh vùng X màu xám Các chuỗi β vùng X cohesin loại II đánh số màu vàng Đầu N C-termini đánh dấu phù hợp Ca2+ mô tả vùng màu cam Sự nhận biết tương tác cohesin-dockerin trung gian tương tác kị nước mặt cohesin vòng xoắn dockerin Năm liên kết hydrogen hai protein tìm thấy, mà chủ yếu cặp amino acid Ser-Thr (vị trí 10 11 vòng liên kết với Ca2+) Đặc biệt, cặp Ser-Thr bảo tồn cách giới hạn dockerin C thermocellum khơng C cellulolyticum Những gốc amino acid khác hình thành trực tiếp liên kết hydrogen với cohesin, Arg (hoặc Lys) Leu (hoặc Ile), bảo tồn cao[11] 23 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Nguyên 1.4.5.5 Sự điều hòa nguồn carbon Điều kiện phát triển ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính thủy giải cellulose C thermocellum thành phần cellulosome Hoạt tính cellulase tổng cao tế bào nuôi cấy cellulose tế bào nuôi cấy cellobiose C thermocellum điều hòa sản xuất cellulase phụ thuộc vào nguồn carbon nguồn lượng có sẵn Mức độ sản xuất enzyme c a o nguồn carbon lượng có sẵn bị giới hạn có diện cellulose tinh thể [11] Nghiên cứu gần mRNA CelS kiểm soát tốc độ tăng trưởng điều kiện hạn chế carbon nguồn nitơ Sự biểu điều kiện giới hạn carbon cao điều kiện hạn nitrogen, cho thấy tác động nguồn carbon phiên mã Sự phiên mã tỷ lệ nghịch với tốc độ tăng trưởng Biểu gen CelS gấp ba lần cao giai đoạn tăng trưởng mũ cellulose so với cellobiose [11] Trong loài ưa nhiệt trung bình C cellulovoran, tinh thể cellulose thúc đẩy xắp xếp cellulosome Khi phát triển cellobiose, protein thuộc cellulosome không tổ chức diện môi trường nuôi cấy Khi cho thêm cellulose tinh thể dịch nuôi cấy ngoại bào, cellulosome hình thành Bổ sung carbohydrate hòa tan vào mơi trường có tế bào phát triển cellulose dẫn đến biến nhanh chóng khối u vài phút Cellulosome C cellulovoran chứa enzym cho phân hủy cellulose mà cho phân hủy xylan, lichenan, pectin mannan, giống cellulosome C thermocellum [11] Một nghiên cứu gần cách sử dụng kỹ thuật Northern dot blot nhằm bán định lượng biểu gen cellulase, hemicellulase pectinase khác cho thấy xylan, cellulose pectin, sử dụng nguồn cacbon, làm gia tăng mức độ biểu hầu hết gen Những kết cung cấp chứng phối hợp biểu gen cellulase hemicellulase, tồn kìm hãm dị hóa, ảnh hưởng hemicellulose phân hủy cellulose Sự biểu proteome cellulosome bị tác động nhiều nguồn carbon enzym không tổ chức cellulosome [11] 24 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 1.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase Theo truyền thống, mối quan hệ vi khuẩn với oxy phân loại theo nhiều cấp độ: hiếu khí, hiếu khí tùy ý, kị khí tùy ý, kị khí (kị khí trung bình, kị khí giới hạn kị khí tuyệt đối) Tuy nhiên, phân loại theo cách chưa phân loại xác mức độ kị khí vi khuẩn Thế oxy hóa khử số kị khí xác cung cấp mức độ liên tục mối quan hệ với oxy vi khuẩn [17] Mức độ oxy hóa khử chất hóa học định nghĩa oxy hóa khử Vi khuẩn hiếu khí có nhiều hệ thống làm giảm oxy hóa khử khơng bị ảnh hưởng nhiều mơi trường oxy hóa-khử cao Trong đó, vi khuẩn kị khí bị tác động mạnh mơi trường ni oxy hóakhử cao [17] Trong tự nhiên oxy chất oxy hóa khử cao (O2/2O2- oxy hóa – khử +0.81V) Oxy tác động tế bào vi khuẩn thông qua phản ứng hóa học với thành phần mơi trường tế bào Do đó, oxy phân tử cần loại bỏ mơi trường ni cấy kị khí để tạo nên khử thấp Một số vi khuẩn kị khí giới hạn kị khí tuyệt đối phát triển mơi trường khử thấp (ví dụ: vi khuẩn kị khí sinh methane phát triển mơi trường oxy hóa khử thấp -0.33V) Thế oxy hóakhử bền vững môi trường nuôi cấy cân tác nhân khử tác nhân oxy hóa: tác nhân oxy hóa thêm vào oxy-khử tăng, ngược lại thêm tác nhân khử oxy-khử giảm [17] Do đó, để ni cấy vi khuẩn kị khí giới hạn, gặp nhiều khó khăn thiết lập mơi trường khử thấp giới hạn oxy Để thực điều này, môi trường trình chuẩn bị phải loại bỏ oxy tác nhân khử thêm vào môi trường nuôi cấy Các tác nhân khử nên cho vào cuối chuẩn bị môi trường nồng độ chất khử phải tính tốn thích hợp để tránh gây độc cho vi khuẩn [17] Phương pháp phân lập vi khuẩn đĩa petri truyền thống không phù hợp cho việc phân lập vi khuẩn kị khí giới hạn Nhiều phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí đưa việc phân lập vi khuẩn kị khí đạt hiệu cao thực hiên đơn giản dựa phương pháp roll tube Hungate (Hungate, 25 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun 1950) Trong ống roll tube mơi trường agar phân bố lớp mỏng mặt ống nghiệm điều kiện khơng có oxy Kỹ thuật có nhiều thay đổi cải tiến bắt đầu xuất [17] Trong ống Hungate, môi trường nuôi cấy vi khuẩn đặt điều kiện khí khơng chứa oxy như: carbon dioxide, hydrogen, nitrogen hỗn hợp chất khí Carbon dioxide chất khí thường sử dụng chúng nặng khơng khí, rẻ tiền đóng vai trò chất đệm [17] Hơn nữa, việc phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase đòi hỏi nhận biết vi khuẩn sinh cellulase mơi trường ni cấy Vì thế, mơi trường ni cấy có chứa cellulose tinh thể sử dụng cho phân lập Trong môi trường này, vi khuẩn sinh cellulase có khả tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau khoảng thời gian ni cấy thích hợp Các chủng vi khuẩn ưa nhiệt, kị khí sinh cellulase thường có khoảng nhiệt độ sống tương đối rộng 40-85oC Việc phân lập chủng ưa nhiệt nuôi cấy nhiệt độ 60oC Trong ống roll tube, chủng phát triển tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau khoảng -10 ngày nuôi cấy nhiệt độ 600C Các khuẩn lạc thường có màu trắng có kích thước tương đối nhỏ 1.6 Phương pháp định danh sinh học phân tử Phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm di truyền phương pháp đại cho kết xác thời gian ngắn, thao tác đơn giản Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi trang thiết bị đại hóa chất đắt tiền ứng dụng số kỹ thuật [1]: Sử dụng mẫu dò (nucleic acid probes): mẫu dò trình tự nucleic acid sử dụng để xác định diện trình tự nucleotide đặc trưng chủng vi sinh vật biết tới Mẫu dò mạch đơn nucleic acid, thông thường DNA, gắn với nhân tố nhận biết (có thể phóng xạ) Tuy nhiên, vài trường hợp kỹ thuật cho độ nhạy không cao Một số vi sinh vật sử dụng kỹ thuật mẫu dò như: Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenza [1] 26 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun Khuếch đại trình tự DNA đặc hiệu nhờ PCR: kỹ thuật PCR sử dụng để khuếch đại trình tự đặc hiệu môi trường (đất, nước, thực phẩm, thể sinh vật) Kỹ thuật cho phép định danh vi sinh vật ni cấy diện mẫu Kỹ thuật ưa chuộng đơn giản, thời gian phát ngắn Tuy nhiên, kỹ thuật cần thiết phải có thơng tin đầy đủ trình tự DNA loài vi sinh vật, nhằm thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho loài hay giống vi khuẩn [1] Giải trình tự gen mã hóa cho tiểu phần RNA 16S ribosome: từ năm 1967, Zucker Kank Pauling cho phân tử sinh học là: “tài liệu lịch sử tiến hóa, thước đo tiến hóa”, để thước đo tiến hóa, phân tử chọn phải có đặc điểm sau [1]: o Phân tử phải có mặt tất sinh vật khảo sát o Phân tử khơng di truyền qua lại lồi o Trình tự sinh vật có độ bảo tồn biến động thích hợp o Phân tử phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thơng tin Ribosome 70S prokaryote đóng vai trò sinh tổng hợp protein ba loại phân tử rRNA (5S, 16S 23S) Bởi rRNA đóng vai trò quan trọng đảm nhận chức tất sinh vật, có nhiều tế bào, có tính bảo tồn cao có vùng trình tự ribonucleotide khác biệt lồi đặc trưng cho nhóm sinh vật Do vậy, rRNA xem thước đo tiến hóa sinh vật cơng cụ hữu ích cho phân loại định danh vi sinh vật Kỹ thuật khơng dựa vào rRNA mà dựa vào trình tự rDNA (trình tự mã hóa rRNA), DNA vật liệu dễ thu nhận có tính bền cao RNA Trong loại trình tự rRNA phân tử rRNA 16S thích hợp cho mục tiêu phân loại kích thước vừa phải chúng (khoảng 1500 ribonucleotide) Trong đó, phân tử 5S (khoảng 120 ribonucleotide) chứa q thơng tin phân tử 23S (khoảng 3000 ribonucleotide) lại dài gây khó khăn cho việc giải trình tự [1] Khi trình tự rDNA 16S giải mã hồn tồn ta định danh loài vi sinh vật mục tiêu nhờ so sánh với trình tự rDNA 16S lồi vi sinh vật quan tâm với tất trình tự rDNA 16S loài vi sinh vật lưu trữ 27 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hồng Ngun ngân hàng gen nhờ vào trình tự Blast, hay kết hợp sử dụng phần mềm để so sánh mức độ tương đồng trình tự Từ sở liệu ta vẽ phát sinh lồi (phytogentic tree), thể mối quan hệ tiến hóa loài cần định danh Ngày nay, rDNA 16S ngày sử dụng rộng rãi để nghiên cứu trình tiến hóa vi sinh vật hay định danh vi sinh vật [1] Hệ thống phát sinh loài hệ thống nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa Phân tích hệ thống phát sinh lồi tức ước tính mối quan hệ Lịch sử tiến hóa suy từ phân tích hệ thống phát sinh lồi, mơ tả sơ đồ dạng cây, mô tả mối quan hệ thừa hưởng phân tử di truyền sinh vật Nguyên tắc phát sinh loài thành viên nhóm bắt nguồn từ tổ tiên chung có mối quan hệ gần gũi với thành viên nhóm khác 28 ... thể [11] 1.2 Các chủng sinh vật sinh cellulase 1.2.1 Nấm mốc Nhiều vi sinh vật có khả phân hủy cellulose có vài vi sinh vật có khả phân hủy hiệu cellulose tinh thể [27] Các sinh vật phân hủy cellulose... Enzym Brevibacillus sp JXL có khả bền nhiệt cao, giữ 50% sau xử lý 100°C 1.3 Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 1.3.1 Đặc điểm chung 1.3.1.1 Cơ chất ưu tiên Những loài vi khuẩn kị khí...ị khí tùy ý, kị khí (kị khí trung bình, kị khí giới hạn kị khí tuyệt đối) Tuy nhiên, phân loại theo cách chưa phân loại xác mức độ kị khí vi khuẩn Thế oxy hóa khử số kị khí xác cung cấp mức đ