BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG BIỂU HIỆN GEN ORF6 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : VÕ TẤN HÙNG Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TẠO DỊNG BIỂU HIỆN GEN ORF6 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV) Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI VÕ TẤN HÙNG KS VÕ KHÁNH HƯNG Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, q thầy Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho suốt năm học tập trường Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải KS Võ Khánh Hưng tạo hội cho làm đề tài này, hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi, tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Thảo Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, người giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Cảm ơn anh chị, quý thầy cô Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Môi trường giúp đỡ suốt thời gian thực tập Viện Xin cám ơn tất bạn sinh viên lớp DH08SH giúp đỡ, động viên, chia sẻ vui buồn khoảng thời gian vừa qua Cuối cùng, ghi nhớ công lao sinh thành dưỡng dục bố mẹ, cảm ơn bố mẹ hai em yêu thương, ủng hộ, tạo điều kiện cho học tập tốt; động viên, giúp đỡ vượt qua khó khăn sống suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Võ Tấn Hùng i TÓM TẮT Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn, virus PRRS gây ra, bệnh gây thiệt hại kinh tế nhiều nước phát triển ngành chăn nuôi lợn, có Việt Nam Nhiều nghiên cứu cho thấy protein M mã hóa gen ORF6 protein có tính kháng ngun cao protein cấu trúc bảo tồn chủng virus PRRS châu Âu Bắc Mỹ Việc biểu protein M nhằm hướng đến việc phát triển kít ELISA chẩn đốn virus PRRS hay phát triển vaccine tiểu đơn vị cần thiết Do đó, mục đích nghiên cứu nhằm tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu Trong nghiên cứu này, vùng trình tự chứa gen ORF6 từ virus PRRS thực địa (Bình Dương) thu nhận kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi ORF6-F1 ORF6-R1 Sau đó, vùng trình tự chứa gen ORF6 tạo dòng vào vector pGEM-T Easy tế bào E coli DH5α (E coli DH5α-pGEM-ORF6) Tiếp theo, gen ORF6 thu nhận từ vector tái tổ hợp pGEM-ORF6 kỹ thuật PCR với cặp mồi ORF6F2 ORF6-R2 Cuối cùng, gen ORF6 tạo dòng vào vector biểu pGEX-4T1 tế bào E coli BL21 (E coli BL21-pGEX-ORF6) Kết cho thấy vùng trình tự chứa gen ORF6 có kích thước 780 bp chèn thành cơng vào vector pGEM-T Easy tế bào E coli DH5α Gen ORF6 có kích thước 525 bp thu nhận chèn thành công vào vector biểu pGEX-4T1 tế bào E coli BL21 Dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 sẵn sàng cho việc cảm ứng biểu protein M IPTG, nhằm phục vụ cho nghiên cứu ii SUMMARY Thesis “Molecular cloning of ORF6 gene of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)” Porcine reproductive and respiratory syndrome, caused by PRRS virus, has been considered one of the most causing economic loss diseases in many swine-producing countries, including Vietnam Many studies suggested that M protein (matrix protein) encoded by ORF6 gene has highly antigenicity and is the most conserved structural protein between North American and European isolates The expression of M protein for developing a diagnostic ELISA kit or subunit vaccine is essential Therefore, the major purpose of this study is to clone ORF6 gene into expression vector In this study, the sequence including ORF6 gene from field PRRS virus (Binh Duong province) was obtained by RT-PCR with primer pair ORF6-F1 and ORF6-R1 After that, the sequence including ORF6 gene was cloned into pGEM-T Easy vector in E coli DH5α (E coli DH5α-pGEM-ORF6) Next, ORF6 gene was amplified from pGEM-ORF6 recombinant vector by PCR with primer pair ORF6-F2 and ORF6-R2 Finally, ORF6 gene was cloned into pGEX-4T1 expression vector in E coli BL21 (E coli BL21-pGEX-ORF6) The results indicated that the sequence including ORF6 gene (780 bp) was successfully inserted into pGEM-T Easy vector in E coli DH5α ORF6 gene (525 bp) was successfully obtained and inserted into pGEX-4T1 expression vector in E coli BL21 The E coli BL21 strain carrying pGEX-ORF6 recombinant vector is ready for expression of M protein by IPTG induction, to serve for further studies Keywords: PRRS, ORF6, cloning, E coli iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 2.1.1 Phân bố bệnh 2.1.2 Virus gây bệnh .2 2.1.3 Đường lây truyền PRRS 2.1.4 Triệu chứng lâm sàng 2.1.5 Bệnh tích PRRS 2.1.6 Các phương pháp chẩn đoán PRRS .5 2.1.7 Điều trị phòng bệnh 2.2 Các nghiên cứu liên quan đến protein M virus PRRS .6 2.2.1 Nghiên cứu nước 2.2.2 Nghiên cứu nước 2.3 Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai 2.3.1 Khái quát tạo dòng .9 2.3.2 Vật liệu dùng tạo dòng .10 2.3.3 Kỹ thuật dùng tạo dòng 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 iv 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu 14 3.2.1 Dụng cụ thiết bị 14 3.2.2 Hóa chất mơi trường .14 3.2.2.1 Hóa chất 14 3.2.2.2 Môi trường 15 3.2.3 Vật liệu sinh học 15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Tạo dòng vùng chứa gen ORF6 vào vector pGEM-T Easy 17 3.3.1.1 Ly trích RNA virus PRRS 17 3.3.1.2 Khuếch đại vùng chứa gen ORF6 RT-PCR 17 3.3.1.3 Tinh sản phẩm PCR 18 3.3.1.4 Nối sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy 19 3.3.1.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli DH5α 19 3.3.1.6 Chọn lọc dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp .20 3.3.2 Tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu pGEX-4T1 22 3.3.2.1 Thu nhận gen ORF6 từ vector pGEM-ORF6 PCR 22 3.3.2.2 Cắt gen ORF6 enzyme BamHI EcoRI 23 3.3.2.3 Ly trích vector pGEX-4T1 .24 3.3.2.4 Mở vòng vector pGEX-4T1 enzyme BamHI EcoRI 25 3.3.2.5 Nối gen ORF6 vào vector pGEX-4T1 25 3.3.2.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli BL21 26 3.3.2.7 Chọn lọc dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 4.1 Kết 28 4.1.1 Tạo dòng vùng chứa gen ORF6 vào vector pGEM-T Easy 28 4.1.1.1 Thu nhận vùng chứa gen ORF6 28 4.1.1.2 Tạo vector pGEM-T Easy tái tổ hợp biến nạp vào E coli DH5α .29 4.1.1.3 Chọn lọc dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp .29 4.1.2 Tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu pGEX-4T1 32 4.1.2.1 Thu nhận cắt gen ORF6 với enzyme giới hạn .32 4.1.2.2 Ly trích mở vòng vector pGEX-4T1 32 v 4.1.2.3 Tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào E coli BL21 33 4.1.2.4 Chọn lọc dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp 34 4.2 Thảo luận 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO .41 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ampr Gen kháng ampicillin BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin cDNA Complementary DNA dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAO Food and Agriculture Organization GST Glutathione S-transferase IFA Indirect immunofluorescence assay IPMA Immunoperoxidase Monolayer Assay IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside kb Kilobase pair kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site mRNA Messenger ribonucleic acid MSD Mystery swine disease NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical density OIE World Organisation for Animal Health vii ORF Open reading frame PAM Porcine alveolar macrophages PCR Polymerase chain reaction PEARS Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription PCR SIRS Swine infertility and respiratory syndrome SOC Super Optimal broth with Catabolite repression Taq Thermus aquaticus TBE Tris-borate-EDTA UV Ultraviolet viii 4.1.2 Tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu pGEX-4T1 4.1.2.1 Thu nhận cắt gen ORF6 với enzyme giới hạn Để thu nhận gen ORF6 nhằm phục vụ mục đích biểu hiện, phản ứng PCR thực vector tái tổ hợp pGEM-ORF6 với cặp mồi ORF6-F2 ORF6R2 Ở đầu 5’ mồi ORF6-F2 ORF6-R2 có gắn trình tự nhận biết enzyme BamHI EcoRI Cặp mồi thiết kế nhằm khuếch đại gen ORF6 nằm phía bên vùng trình tự chèn vào vector pGEM-T Easy Sản phẩm khuếch đại có kích thước dự kiến khoảng 547 bp Kết hình 4.6 cho thấy gen ORF6 thu nhận thành cơng Hình 4.6 Kết PCR thu nhận gen ORF6 từ pGEM-ORF6 Giếng 1: thang 100 bp (ABM, Canada); giếng 2: đối chứng âm với mẫu nước; giếng 3: sản phẩm gen ORF6 Vùng gen ORF6 sau tinh xử lý với hai enzyme BamHI EcoRI nhằm tạo đầu nối tương thích với vector biểu pGEX-4T1 mở vòng với hai enzyme 4.1.2.2 Ly trích mở vòng vector pGEX-4T1 Vector biểu pGEX-4T1 ly trích từ tế bào E coli BL21 có mang pGEX-4T1 đóng vòng (hình 4.7) kít QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen, Đức) nhằm thu lượng lớn vector dùng biểu Sau đó, vector pGEX-4T1 mở vòng với hai enzyme BamHI EcoRI nhằm tạo đầu nối tương thích với gen ORF6 chèn vào Vector pGEX-4T1 sau cắt có kích thước khoảng 4,9 kb (hình 4.8) 32 Hình 4.8 Mở vòng vector pGEX-4T1 Hình 4.7 E coli BL21 mang pGEX4T1 mơi trường LB-ampicillin 100 µg/ml Giếng 1: thang kb (ABM, Canada); giếng 2: pGEX-4T1 sau ly trích; giếng 3: pGEX-4T1 sau cắt với BamHI EcoRI 4.1.2.3 Tạo vector tái tổ hợp biến nạp vào E coli BL21 Sau xử lý với enzyme giới hạn, đoạn gen ORF6 nối vào vector pGEX-4T1 tạo thành vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 Q trình tạo dòng vào vector pGEM-T Easy sử dụng chủng tế bào E coli DH5α Đây chủng E coli có hiệu suất biến nạp cao cho phép vector tái tổ hợp diện với số lượng lớn tế bào Tuy nhiên, dòng tế bào khơng thích hợp cho mục đích biểu Do đó, dòng tế bào E coli BL21 sử dụng để biến nạp vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 nhằm phục vụ cho mục đích biểu sau (1) Hình 4.9 Kết biến nạp pGEX-ORF6 vào E coli BL21 A: đĩa E coli BL21 biến nạp pGEX-ORF6; B: đĩa đối chứng với E coli BL21; (1): khuẩn lạc mang vector pGEX-ORF6 33 Vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 biến nạp vào tế bào E coli BL21 phương pháp sốc nhiệt giống E coli DH5α Các dòng tế bào E coli BL21 mang pGEX-ORF6 sàng lọc đĩa LB agar bổ sung ampicillin 100 µg/ml Kết thể hình 4.9 4.1.2.4 Chọn lọc dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp Tác nhân chọn lọc ampicillin cho phép tế bào mang vector tái tổ hợp phát triển Tuy nhiên, để chọn lọc dòng tế bào E coli BL21 mang vector tái tổ hợp xác nhận đoạn gen ORF6 chèn vào vector, cần tiến hành sàng lọc lại phương pháp PCR khuẩn lạc Kết thể hình 4.10 cho thấy tạo thành cơng dòng tế bào E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 (E coli BL21-pGEX-ORF6) Hình 4.10 PCR khuẩn lạc kiểm tra dòng E coli BL21 mang pGEX-ORF6 Giếng 1: thang 100 bp (ABM, Canada); giếng 2: đối chứng âm với mẫu nước; giếng 3: kết kiểm tra dòng E coli BL21-pGEX-ORF6 Để kiểm tra lại trình tự đoạn gen ORF6 chèn vào vector pGEX-4T1 phục vụ cho mục đích biểu hiện, tiến hành tăng sinh dòng E coli BL21-pGEX-ORF6 Vector pGEX-ORF6 sau ly trích kít QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen, Đức) gửi giải trình tự cơng ty Nam Khoa với cặp mồi pGEX-F pGEX-R nằm vector Kết giải trình tự phân tích công cụ BLAST sở liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 34 Khi tiến hành BLAST trình tự gen ORF6 chèn vào vector pGEX-4T1 sở liệu NCBI, kết cho thấy gen ORF6 chèn vào vector có tương đồng 99% với vùng gen ORF6 virus PRRS chủng 07QN (chủng thực địa) Giữa hai vùng trình tự có sai khác nucleotide (hình 4.11) Hình 4.11 Kết phân tích gen ORF6 chèn vào pGEX-4T1 NCBI Query gen ORF6 chèn vào pGEX-4T1; Sbjct trình tự gen virus PRRS chủng 07QN (chủng thực địa); khung màu đỏ: vị trí sai khác hai trình tự Cặp mồi pGEX-F pGEX-R dùng giải trình tự thiết kế bắt hai đầu vùng nhân dòng MCS vector pGEX-4T1 Vì vậy, đoạn gen chèn vào vector vị trí, giải trình tự cặp mồi thu vùng trình tự, hai đầu vùng trình tự nằm vector, đoạn gen chèn vào Để kiểm tra, kết giải trình tự cặp mồi pGEX-F pGEX-R BLAST với trình tự vector pGEX-4T1 (GenBank: U13853.1) Kết cho thấy hai đầu vùng gen khuếch đại cặp mồi pGEX-F pGEX-R bắt với trình tự vector pGEX-4T1, thiết kế ban đầu (hình 4.12) 35 Như vậy, kết giải trình tự sau BLAST gen virus PRRS vector pGEX-4T1 xác nhận gen ORF6 chèn vào vector pGEX-4T1 chiều vị trí mong muốn Hình 4.12 Kết giải trình tự sau BLAST vector pGEX-4T1 Query kết giải trình tự với cặp mồi pGEX-F pGEX-R; Sbjct trình tự vector pGEX-4T1 Để kiểm tra trình tự amino acid mã hóa gen ORF6 chèn vào vector biểu pGEX-4T1, tiến hành dịch mã giả định gen ORF6 thành chuỗi amino acid so sánh với chuỗi amino acid ngân hàng gen công cụ BLASTx (NCBI) Kết cho thấy trình tự amino acid mã hóa gen ORF6 tương đồng 100% với protein M (matrix protein) virus PRRS (hình 4.13) Hình 4.13 Kết phân tích trình tự amino acid mã hóa gen ORF6 Query trình tự amino acid mã hóa gen ORF6; Sbjct trình tự amino acid matrix protein ngân hàng gen 36 4.2 Thảo luận Mục tiêu chủ yếu nghiên cứu tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu nhằm phục vụ cho nghiên cứu biểu protein M mã hóa gen này, sử dụng làm kháng ngun để phát triển kít ELISA chẩn đốn kháng thể virus PRRS phát triển làm vaccine tiểu đơn vị Tuy nhiên, nghiên cứu hướng tới việc giữ dòng vi khuẩn mang đoạn gen ORF6 trước biểu Do đó, nghiên cứu tiến hành qua hai giai đoạn: tạo dòng gen ORF6 vào vector giữ dòng tạo dòng vào vector biểu Nhằm giảm thiểu sai sót q trình RT-PCR thu nhận đoạn gen ORF6, cặp mồi ORF6-F1 ORF6-R1 thiết kế nhằm khuếch đại vùng trình tự có kích thước khoảng 780 bp chứa đoạn gen ORF6 bên Để giữ dòng đoạn gen ORF6, nghiên cứu sử dụng phương pháp cloning TA với vector pGEM-T Easy (Promega, Mỹ) Đây phương pháp tạo dòng nhanh, hiệu đoạn gen mong muốn vào vector giữ dòng mà không cần phải dùng tới enzyme giới hạn Kết biến nạp (hình 4.2) cho thấy vector tái tổ hợp biến nạp tốt vào tế bào E coli DH5α Tuy số khuẩn lạc thu đĩa không nhiều, lỗi kỹ thuật q trình thao tác, số khuẩn lạc trắng (chứa vector mang đoạn gen chèn) nhiều so với số khuẩn lạc xanh (chứa vector tự đóng vòng), cho thấy đoạn gen nối hiệu vào vector Kết giải trình tự đoạn gen chèn vào vector pGEM-T Easy (hình 4.5) cho thấy có vài vị trí nucleotide sai khác so sánh với trình tự tham khảo cơng bố ngân hàng gen Điều lý giải hai nguyên nhân: thứ lỗi kéo dài mạch Taq DNA polymerase, nhiên khả thấp Taq DNA polymerase thương mại thường có lỗi chép khoảng 1/10.000 nucleotide; nguyên nhân thứ hai có khả xảy nhiều hơn, sai khác trình tự virus PRRS chủng thực địa so với trình tự chủng virus tham khảo công bố ngân hàng gen Tuy nhiên, sai khác không đáng kể, đoạn gen ORF6 mục tiêu có kích thước khoảng 525 bp (vùng tơ màu vàng hình 4.5) Dựa kết phân tích, nghiên cứu tiếp tục thực giai đoạn thứ hai Để phục vụ mục đích biểu hiện, cặp mồi ORF6-F2 ORF6-R2 thiết kế có chứa trình tự enzyme cắt đầu 5’ nhằm thu nhận toàn gen ORF6 để chèn vào vector biểu Phương pháp sử dụng giai đoạn phương pháp tạo dòng 37 định hướng Theo đó, đoạn gen mục tiêu thu nhận phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế đặc biệt Mỗi mồi có gắn trình tự nhận biết loại enzyme cắt khác đầu 5’ Vector tạo dòng chứa trình tự nhận biết hai enzyme Do đó, sau xử lý với enzyme giới hạn, đoạn gen cần chèn gắn chiều vào vector Vector biểu sử dụng nghiên cứu vector pGEX-4T1 Họ vector pGEX mang đặc điểm thích hợp cho việc biểu gen Đoạn gen chèn vào vector biểu dạng protein dung hợp với GST (Glutathione Stransferase) với cảm ứng IPTG Tất bước tạo dòng biểu thực với chủng E coli BL21 Đây chủng E coli sử dụng rộng rãi nhiều nghiên cứu biểu gen, thích hợp cho việc biểu mức độ cao protein, đặc biệt protein dung hợp với GST Khả biến nạp chủng E coli BL21 so với E coli DH5α Tuy nhiên, kết biến nạp hình 4.9 cho thấy vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 biến nạp hiệu vào tế bào E coli BL21 Ở vector pGEX4T1, tác nhân chọn lọc gen kháng ampicillin cho phép nhận diện khuẩn lạc phát triển mơi trường có chứa ampicillin dòng vi khuẩn có mang vector pGEX-4T1, khơng biết vector có chèn đoạn gen mục tiêu vào hay chưa Đây hạn chế hệ thống vector pGEX Vì vậy, để chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector chèn đoạn gen mục tiêu (gen ORF6), cần phải tiến hành sàng lọc nhiều khuẩn lạc so với sàng lọc vector pGEM-T Easy Kết giải trình tự với cặp mồi pGEX-F pGEX-R nằm vector pGEX4T1 cho thấy đoạn gen ORF6 chèn vào vị trí mong muốn vector pGEX-4T1 Trình tự gen ORF6 chèn vào vector có sai khác nucleotide so với trình tự tham khảo Đây sai khác trình tự virus PRRS chủng thực địa so với trình tự chủng virus tham khảo công bố ngân hàng gen Tuy nhiên, tiến hành dịch mã giả định gen ORF6 thành chuỗi amino acid, kết cho thấy chuỗi amino acid hoàn toàn tương đồng với protein M virus PRRS Như gen ORF6 chèn vào vector pGEX-4T1 có khả biểu thành protein M Dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 cảm ứng IPTG để biểu protein M dạng dung hợp với GST Protein dung hợp GST-M dễ dàng tinh sắc ký lực với GST protein M tách khỏi protein dung hợp enzyme thrombin 38 Nghiên cứu chúng tơi có tương đồng với nghiên cứu Suesuttajit ctv năm 2008 tạo dòng gen ORF6 virus PRRS phân lập Thái Lan Đầu tiên tác giả sử dụng phương pháp tạo dòng TA để tạo dòng sản phẩm PCR gen ORF6 vào vector pCR®8/GW/TOPO® (Invitrogen, Mỹ) Sau đó, tiếp tục tạo dòng vào vector pGEX-4T2, vector biểu thuộc họ vector pGEX Protein M biểu dạng dung hợp GST-M kích thước khoảng 44 kDa (GST 26 kDa protein M 18 kDa) Trong phạm vi giới hạn thời gian kinh phí khóa luận tốt nghiệp, nghiên cứu dừng lại bước tạo dòng vào vector biểu nhằm làm tiền đề cho nghiên cứu Tóm lại, nghiên cứu thành cơng việc tạo dòng vùng chứa đoạn gen ORF6 vào vector pGEM-T Easy tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu pGEX4T1 Dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 sử dụng để cảm ứng biểu thu nhận protein M, phục vụ cho nghiên cứu Trong bối cảnh tình hình nhiễm virus PRRS ngày phức tạp nghiên cứu có ý nghĩa việc phát triển kít ELISA chẩn đốn kháng thể virus PRRS xa phát triển vaccine tiểu đơn vị nhằm ngăn chặn kiểm soát bệnh nguy hiểm 39 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu nghiên cứu, rút số kết luận sau: Đã thu nhận thành công vùng chứa gen ORF6 virus PRRS phân lập Bình Dương phương pháp RT-PCR với cặp mồi ORF6-F1 ORF6-R1 Tạo dòng thành công tế bào E coli DH5α mang vector pGEM-T Easy chứa vùng gen ORF6 kích thước 780 bp (E coli DH5α-pGEM-ORF6) Tạo dòng thành cơng tế bào E coli BL21 mang vector biểu pGEX-4T1 chứa gen ORF6 kích thước 525 bp (E coli BL21-pGEX-ORF6) 5.2 Đề nghị Trong phạm vi giới hạn thời gian kinh phí khóa luận tốt nghiệp, đề tài dừng lại việc tạo dòng gen ORF6 vào vector biểu Để tiếp tục phát triển đề tài phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, xin đưa số đề nghị sau: Tiến hành cảm ứng biểu protein M từ dòng E coli BL21 mang vector tái tổ hợp pGEX-ORF6 IPTG Khảo sát nồng độ IPTG thời gian cảm ứng tối ưu cho việc biểu protein M Tiến hành tinh protein dung hợp GST-M cột sắc ký lực sử dụng glutathione gắn kết với giá thể Sepharose cắt protein M khỏi protein dung hợp GST-M enzyme thrombin Kiểm tra tính kháng nguyên protein M phương pháp Western blot với mẫu huyết lợn bị nhiễm virus PRRS 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Cục Thú y 2007 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Cục Thú y 2008 Hướng dẫn phòng, chống Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương, Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt Nguyễn Bá Hiên 2009 Phân tích gen M mã hóa protein màng virus gây bệnh “tai xanh” Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc giới Tạp chí Khoa học Phát triển 2009, tập 7, số 3: 282290 Nguyễn Hồng Lộc 2007 Giáo trình Cơng nghệ DNA tái tổ hợp NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Như Hiền 2007 Cơng nghệ sinh học - Tập - Sinh học phân tử tế bào - Cơ sở khoa học công nghệ sinh học NXB Giáo dục Trịnh Đình Đạt 2010 Công nghệ sinh học - Tập - Công nghệ di truyền NXB Giáo dục TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Albina E., Leforban Y., Baron T., Plana Duran J., and P Vannier 1992 An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus Ann Rech Vet 23: 167-176 Bae S.J., Kim J.W., Yoon Y.S., and S.Y Kang 2009 Expression of ORF6 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus Korean J Vet Serv 32: 19-25 10 Bautista E.M., Suarez P., and T.W Molitor 1999 T cell responses to the structural polypeptides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Arch Virol.144: 117-134 11 Benfield, D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L., Goyal S.M., Robison D., Christianson W.T., Morrison R.B., Gorcyca D., and D Chladek 1992 Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR2332) J Vet Diagn Invest 4: 127-133 12 Botner A., Strandbygaard B., Sorensen K.J., Have P., Madsen K.G., Madsen E.S., et al 1997 Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine Vet Rec 141: 497-9 13 Brown T.A 2010 Gene cloning and DNA analysis-An introduction, 6th edition Blackwell Publishing, Chichester, West Sussex, PO19 8SQ, UK 14 Cho H.J., Mcnab B., Dubuc C., Jordan L., Afshar A., Magar R., Prins S., and Eernissek 1997 Comparative study of serological methods for the detection of antibodies to porcine reproductive and respiratory syndrome virus Can J Vet Res 61: 161-166 15 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., and G Milane 1996 Antigenic variability among North-American and European strains of PRRSV as defined by 41 monoclonal antibodies to the matrix protein J Clin Microbiol 34: 1488-1493 16 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., and D Rogan 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659-688 17 Delputte P.L., Vanderheijden N., Nauwynck H.J., and M.B Pensaert 2002 Involvement of the matrix protein in attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparin-like receptor on porcine alveolar macrophages J Virol 76: 4312-4320 18 Denac H., Moser C., Tratschin J.D., and M.A Hofmann 1997 An indirect ELISA for the detection of antibodies against porcine reproductive and respiratory syndrome virus using recombinant nucleocapsid protein as antigen J Virol Methods 65: 169-181 19 Gagnon C.A., and S Dea 1998 Differentiation between porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates by restriction fragment length polymorphism of their ORFs and genes Can J Vet Res 62: 110-116 20 Halbur P.G., Andrews J.J., Huffman E.L., Paul P.S., Meng X.J., and Niyoy 1994 Developmentof a streptavidin-biotin immunoperoxidase procedure for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen in porcine lung J Vet Diagn Invest 6: 254-257 21 Houben S., Callebaut P., and M.B Pensaert 1995 Comparative study of a blocking enzyme-linked immunosorbent assay and the immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs J Virol Methods 51: 125-128 22 Jeong H.J., Song Y.J., Lee S.W., Lee J.B., Park S.Y., Song C.S., Ha G.W., Oh J.S., Oh Y.K., and I.S Choi 2010 Comparative measurement of cell-mediated immune responses of swine to the M and N proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Clinical and vaccine immunology 17: 503-512 23 Jiang W.M., Jiang P., Li Y.F., et al 2006a Recombinant adenovirus expressing GP5 and M fusion proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus induce both humoral and cell-mediated immune responses in mice Vet Immunol Immunopathol 113: 169-180 24 Jiang Y.B., Xiao S.B., Fang L.R., et al 2006b DNA vaccines co-expressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) display enhanced immunogenicity Vaccine 24: 2869-2879 25 Keffaber K.K 1989 Reproductive failure of unknown etiology Am Assoc Swine Pract Newslett 1: 1-10 26 Larochelle R., and R Magar 1997 Differentiation of North American and European porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotypes by in situ hybridization J Virol Methods 68: 161-168 27 Loemba H.D., Mounir S., Mardassi H., Archambault D., and S Dea 1996 Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus Arch Virol 141: 751-761 28 Mardassi H., Massie B., and S Dea 1996 Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs to of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virology 221: 98-112 29 Martelli P., Gozio S., Ferrari L., Rosina S., De Angelis E., Quintavalla C., Bottarelli 42 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 E., and P Borghetti 2009 Efficacy of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccine in pigs naturally exposed to a heterologous European (Italian cluster) field strain: clinical protection and cellmediated immunity Vaccine 27: 3788-3799 Meng X.J 2000 Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development Vet Microbiol 74: 309-329 Meng X.J, Paul P.S., Halbur P.G., and M.A Lum 1995 Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe Arch Virol 140: 745-755 Metwally S., Mohamed F., Faaberg K., Burrage T., Prarat M., Moran K., Bracht A., Mayr G., Berninger M., Koster L., To T.L., Nguyen V.L., Reising M., Landgraf J., Cox L., Lubroth J., and C Carrillo 2010 Pathogenicity and Molecular Characterization of Emerging Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Vietnam in 2007 Transboundary and Emerging Diseases 57: 315-329 Meulenberg J.J 2000 PRRSV, the Virus Vet Res 31: 11-21 Meulenberg J.J., Petersen-den B.A, De Kluyver E.P., Moor-mann R.J., Schaaper W.M., and G Wensvoort 1995 Characterization of proteins encoded by ORFs to of Lelystad virus Virology 206: 155-163 OIE 2004 Porcine reproductive and respiratory syndrome In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Part 2, Section 2.6., Chapter 2.6.5 OIE 2010 Porcine reproductive and respiratory syndrome Chapter 2.8.7 Paton D.J., Brown I.H., Edwards S and G Wensvoort 1991 'Blue ear' disease of pigs Vet Rec 128: 617 Plagemann P.G.W 2003 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Origin Hypothesis Emerg Infect Dis 9: 903-908 Qian P., Li X., Tong G., and H Chen 2003 High-level Expression of the ORF6 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) in Pichia pastoris Virus genes 27: 189-196 Sambrook J., and D.W Russell 2001 Molecular cloning, vol 3, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA Snijder E.J., van Tol H., Pedersen K.W., Raamsman M.J., and A.A de Vries 1999 Identification of a novel structural protein of arteriviruses J Virol 73: 6335-6345 Suesuttajit N., Thonghuang B., Jaramechai P., and A Nuntaprasert 2008 Cloning and Expression of ORF4 and ORF6 Genes of Thai Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Isolate in E coli In: Proceedings 7th Chula Univ Vet Sci Ann Con., pp 84 Wasik A., Callahan J.D., Christopher-Hennings J., Gay T.A., Fang Y., Dammen M., Reos M.E., Torremorell M., Polson D., Mellencamp M., Nelson E., and W.M Nelson 2004 Detection of U.S., Lelystad, and European-like porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and relative quantitation in boar semen and serum samples by real-time PCR J Clin Microbiol 42: 4453-4461 Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M., Laak E.A., Bloemraad M., and E.P Kluyver 1991 Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus Vet Q 13: 121-130 43 45 Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R., ChristopherHennings J., and E.A Nelson 2001 A 10-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b Virology 287: 183-191 46 Xiang Z.J., Tong W.X., Dong X.J., Tao Y., Ye L., Bao Z.J., and H.R Liang 2011 Immune responses in pigs induced by recombinant Canine Adenovirus expressing M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Intern J Appl Res Vet Med 9: 332-341 47 Yoon I.J., Joo H.S., Christianson W.T., Kim H.S., Collins J.E., Morrison R.B., and G.D Dial 1992 An indirect fluorescent antibody test for the detection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera J Vet Diagn Invest 4: 144-147 48 Zheng Q., Chen D., Li P., Bi Z., Cao R., Zhou B., and P Chen 2007 Coexpressing GP5 and M proteins under different promoters in recombinant modified vaccinia virus Ankara (rMVA)-based vaccine vector enhanced the humoral and cellular immune responses of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Virus Genes 35: 585-595 49 Zuckermann F.A., Garcia E.A., Luque I.D., Christopher-Hennings J., Doster A., Brito M., and F Osorio 2007 Assessment of the efficacy of commercial porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccines based on measurement of serologic response, frequency of gamma-IFN-producing cells and virological parameters of protection upon challenge Vet Microbiol.123: 69-85 TÀI LIỆU TỪ INTERNET 50 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Ngày truy cập: 02/2012 51 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp Ngày truy cập: 03/2012 52 http://www.rovetco.com/?act=news&detail=detail&news_id=94&cat_id=3&cat_it em_id=232&lang=vn Ngày truy cập: 03/2012 53 http://www.thepigsite.com/pighealth/article/142/porcine-reproductive-andrespiratory-syndrome-prrs Ngày truy cập: 03/2012 44 PHỤ LỤC Các vùng trình tự vector pGEM-T Easy T7 RNA polymerase transcription initiation site multiple cloning region SP6 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 10 - 128 139 - 158 SP6 RNA polymerase transcription initiation site pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site 141 176 - 197 lacZ start codon lac operator 180 200 - 216 β-lactamase coding region 1337 - 2197 phage f1 region 2380 - 2835 lacoperon sequences pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site T7 RNA polymerase promoter (–17 to +3) 2836 - 2996, 166 - 395 2949 - 2972 2999 - Các vùng trình tự vector pGEX-4T1 - Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205 - 211; -35: 183 - 188; lac operator: 217 237; Vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918 - 935 - Vùng MCS: 930 - 966 - Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1330 - 1335; -35: 1307 - 1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235 - Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon kết thúc (TGA): 4398 - Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2995; vùng cần thiết cho chép: 2302 - 2998 - Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp vị trí 869 - 891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp vị trí 1041 - 1019 Kết giải trình tự vùng chứa gen ORF6 với cặp mồi ORF6-F1, ORF6-R1 >ORF6 (ORF6-F1, ORF6-R1) GACAAAACCCCTATAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGGGGTCGTCTCTAGACG ACTTCTGCAATGATGGCACAGCTCCACAGAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCCATTACC TACACGCCAGTGATGATATATGCTCTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGC TTCTGCACCTTTTGATCTTTCTGAATTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCG TGCACTTTGAGAGCACAAATAGGGTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTGGTTGCACT TCTTTGGGGAGTGTATTCAGCCATAGAAACCTGGAAATTCATCACTTCCAGATGC CGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAAGTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAA GTGCCGCGGGCTTTCATCCGATTGCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCG GCGTCCCGGCTCCACTACGGTCAACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTC GTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATG CCAAATAATAACGGCAAGCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGGAATGGCCAGCCAGT CAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAG AGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATT TCCCTCTTGCGACTGAAGATGACGTCAGGCACCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCA TGTGG Kết giải trình tự gen ORF6 với cặp mồi pGEX-F, pGEX-R >ORF6 (pGEX-F, pGEX-R) GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTT CCGCGTGGATCCATGGGGTCGTCTCTAGACGACTTCTGCAATGATGGCACAGCTC CACAGAAGGTGCTTTTGGCGTTTTCCATTACCTACACGCCAGTGATGATATATGCT CTAAAGGTAAGTCGCGGCCGACTGCTAGGGCTTCTGCACCTTTTGATCTTTCTGAA TTGTGCTTTTACCTTCGGGTACATGACATTCGTGCACTTTGAGAGCACAAATAGG GTCGCGCTCACTATGGGAGCAGTGGTTGCACTTCTTTGGGGAGTGTATTCAGCCA TAGAAACCTGGAAATTCATCACTTCCAGATGCCGTTTGTGCTTGCTAGGCCGCAA GTACATTCTGGCCCCTGCCCACCACGTCGAAAGTGCCGCGGGCTTTCATCCGATT GCGGCAAATGATAACCACGCATTTGTCGTCCGGCGTCCCGGCTCCACTACGGTCA ACGGCACATTGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGT TAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTTAAATATGCCAAATAACAAGAATTCCCGGGT CGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCGTTTCGGTG ATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGG ... Monolayer Assay IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside kb Kilobase pair kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani MCS Multiple cloning site mRNA Messenger ribonucleic acid MSD Mystery swine disease NCBI National... tự amino acid mã hóa gen ORF6 .36 x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngành chăn ni Việt Nam nói chung ngành chăn ni lợn nói riêng đóng góp giá trị lớn kinh tế nước ta Hiện nay, nhà chăn nuôi phải... lứa tuổi, gây nhiều khó khăn cơng tác chẩn đốn phòng ngừa Nghiên cứu gen virus PRRS cho thấy có khung đọc mở (open reading frame - ORF) mã hóa cho thành phần khác virus Trong đó, vùng ORF6 mã hóa