BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus sp Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : PHẠM VĂN LÂM Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus sp Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG PHẠM VĂN LÂM Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM, ban Chủ Nhiệm môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho tơi thực thành cơng khóa luận Xin tỏ lòng biết ơn đến Trương Phước Thiên Hồng Người tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận Ngàn lần gửi lời biết ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Phan Thành Người định hướng, dìu dắt ln giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Lời cảm ơn chân thành tới bạn Đỗ Tô Hoa Mai Người quan tâm, chia sẻ giúp đỡ rất nhiều suốt thời gian làm đề tài Các anh chị, bạn thực tập phòng vi sinh sinh học phân tử khuyến khích, ủng hộ giúp đỡ để tơi thực tốt khóa luận Cùng tồn thể lớp CNSH 34 hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Công ơn cha mẹ sinh thành, dưỡng dục hy sinh tất ăn học nên người Con xin cảm ơn gia đình chỗ dựa vững cho vững bước qua khó khăn Phạm Văn Lâm i TĨM TẮT Mục đích nghiên cứu nhằm tạo giống Lactobacillus sp phục vụ cho sản xuất sữa chua, dưa chua phomat quy mô nhỏ, xa quy mô công nghiệp Đồng thời cấp thơng tin mẫu vi khuẩn địa, đóng góp phần liệu Lactobacillus sp cho Genbank, tăng hiểu biết dòng Lactobacillus có nguồn gốc Việt Nam, giảm phụ thuộc nguồn giống vi sinh từ nước Nghiên cứu tiến hành gồm ba giai đoạn Giai đoạn một, mẫu vi khuẩn thu thập từ sản phẩm lên men phân lập lưu trữ Giai đoạn hai, mẫu định danh Lactobacillus sp phản ứng sinh hóa đặc trưng Giai đoạn ba, mẫu vừa định danh phản ứng sinh hóa kiểm tra lại phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng Lactobacillus sp Trong nghiên cứu này, 31 mẫu vi khuẩn phân lập khảo sát đặc điểm sinh hóa Trong đó, có 24 mẫu vi khuẩn cho phản ứng sinh hóa phù hợp với phản ứng sinh hóa chủng Lactobacillus sp Đồng thời có mẫu vi khuẩn cho kết sản phẩm phản ứng PCR phù hợp với loài Lactobacillus Với mẫu dưa chua thu thập từ chợ Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: CSNL) Lactobacillus fermentum mẫu phân lập từ Sữa chua WellYo – Siêu Thị Coop – Mart Suối Tiên – Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: WY); mẫu dưa chua thu thập từ chợ Việt Thắng – Thủ Đức – thành phố Hồ Chí Minh (kí hiệu là: CS) Lactobacillus casei ii SUMMARY Thesis: “The application of molecular biology techniques in identifying Lactobacillus sp strains” This study aims to find out the Lactobacillus sp strains collection to use for small-scale production, further to an industrial scale It also provides the informations about some field bacterial samples, partly contributed the data for Genbank, increased the knowledge about some Lactobacillus strains derived from Vietnam, reduced the reliance on foreign microbiological sources The study was carried out in three steps Firstly, the bacterial samples collected from fermented products were isolated and stored Secondly, the samples were identified by typically biochemical reactions of Lactobacillus sp Finally, the samples (just identified by biochemical reactions) were verified by PCR with specific primer pairs of Lactobacillus sp In this study, 31 bacterial samples were isolated and examined biochemical characteristics Of these, there were 24 bacterial samples consistent with biochemical reactions of Lactobacillus sp Also, there were bacterial samples resulted in PCR products consistent with species of Lactobacillus Lactobacillus in pickle sample collected from Thu Duc market - Ho Chi Minh city (signed as CSNL) was identified as Lactobacillus fermentum Lactobacillus species in sample isolated from WellYo yogurt - Suoi Tien Coop-Mart supermarket - Thu Duc district - Ho Chi Minh city (signed as WY) and pickle sample collected from Viet Thang market - Thu Duc district - Ho Chi Minh city (signed as CS) were indentified as Lactobacillus casei Keywords: Lactobacillus sp., identification, PCR iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Sơ lược Lactobacillus 2.1.1 Giới thiệu .3 2.1.2 Quá trình lên men vi khuẩn Lactobacillus 2.1.3 Sự lên men lactic vi khuẩn Lactobacillus .4 2.1.4 Tính kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus 2.1.5 Sự phát triển vi sinh vật 2.1.6 Ứng dụng Lactobacillus 2.2 Phương pháp sinh học phân tử dùng để định danh vi sinh vật .8 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008) 2.2.2 Phương pháp điện di 2.2.3 Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) .9 2.2.3.1 Khái quát PCR .9 2.2.3.2 Nguyên tắc chung phản ứng PCR 2.2.3.3 Các thành phần phản ứng PCR 10 2.2.3.4 Các giai đoạn phản ứng PCR .11 2.3 Một số nghiên cứu giới nước vi khuẩn Lactobacillus 12 iv 2.3.1 Nghiên cứu giới .12 2.3.2 Nghiên cứu nước 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị hóa chất 14 3.2.1 Mẫu phân lập .14 3.2.2 Dụng cụ thiết bị 15 3.2.3 Hóa chất .15 3.3 Phương pháp nghiên cứu 17 3.3.1 Phân lập chọn lọc vi khuẩn 17 3.3.1.1 Thu nhận mẫu phân lập 17 3.3.1.2 Phân lập vi khuẩn .17 3.3.1.3 Chọn lọc làm 17 3.3.1.4 Bảo quản giống vi khuẩn 17 3.3.2 Dùng phản ứng sinh hóa để định danh 18 3.3.2.1 Nhuộm Gram 18 3.3.2.2 Thử nghiệm catalase .18 3.3.2.3 Thử nghiệm khả lên men đường 18 3.3.2.4 Thử nghiệm tính di động mơi trường thạch mềm 18 3.3.2.5 Một số phản ứng sinh hóa khác 19 3.3.3 Phản ứng PCR .20 3.3.3.1 Ly trích DNA tổng số vi khuẩn 20 3.3.3.2 Thực phản ứng PCR 20 3.3.3.3 Điện di kiểm tra phản ứng PCR .22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết phân lập làm .23 4.2 Kết định danh vi khuẩn phản ứng sinh hóa 25 4.2.1 Kết nhuộm Gram 26 4.2.2 Kết thử nghiệm catalase 26 4.2.3 Kết thử nghiệm di động môi trường thạch mềm 26 4.2.4 Kết số phản ứng sinh hóa khác 27 4.3 Kết định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus sp phương pháp PCR .29 v 4.3.1 Kết phản ứng PCR L fermentum 30 4.3.2 Kết phản ứng PCR L casei 31 4.3.3 Kết phản ứng PCR L acidophilus 32 4.3.4 Kết phản Multiplex PCR L casei L acidophilus 32 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DMSO Dimethyl Sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid LPS lipopolysaccharde PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosomal ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate TBE Tris-borate-EDTA U Unit vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kí hiệu mẫu phân lập .14  Bảng 3.2 Các thiết bị nghiên cứu 15  Bảng 3.3 Các hóa chất sử dụng phản ứng PCR 16  Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR định danh L fermentum 20  Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L fermentum .20  Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR định danh L casei 21  Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L casei 21  Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR định danh L acidophilus 21  Bảng 3.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L acidophilus 22  Bảng 3.10 Thành phần phản ứng Multiplex PCR 22  Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn tổng số mẫu phân lập .23  Bảng 4.2 Một số phản ứng sinh hóa dùng định danh Lactbacillus sp 25  Bảng 4.3 Phản ứng sinh hóa Lactobacillus 27  viii Bảng 3.9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR định danh L acidophilus Bước Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Khởi động 94 oC phút Biến tính 94 oC 30 giây Bắt cặp 60 oC 30 giây Kéo dài 72 oC 60 giây Kết thúc 72 oC phút Số chu kỳ 30 Bảng 3.10 Thành phần phản ứng Multiplex PCR Thành phần Nồng độ cuối Buffer 1X MgCl2 2mM dNTP 0,41 mM IDL11F 0,33M IDL03R 0,33M IDL22R 0,33M IDL04F 0,33M Taq polymerase 1,5U DNA mẫu 10 – 50 ng Thêm nước DEPC để đạt tổng thể tích phản ứng 30µl 3.3.3.3 Điện di kiểm tra phản ứng PCR Sản phẩm PCR phân tích điện di gel agarose 3%, hiệu điện 50V 50 phút 100V 10 phút Kết điện di nhuộm với Ethidium bromide 20 phút, sau quan sát tia UV lưu lại máy chụp ảnh để kiểm tra 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập làm Từ 31 mẫu cải chua sữa chua, chọn 31 khuẩn lạc có hình thái, đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Lactobacillus có khả phát triển mơi trường MRS có độ pH thấp, khuẩn lạc lồi, trắng trong, hình cầu, bề mặt nhẵn trơn láng Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn tổng số mẫu phân lập Mẫu CPTN CSNT CSTR CSBT LTIIQ MST C1 C2 CPST CS CSNL L4 LT1 LT2 NCTB Q1 Q2 S2 STQ LA2 LA4 NCTH CSST KTX BET LA6 L PRO VI WY Y Nguồn gốc mẫu phân lập Dưa chua – Tây Ninh Dưa chua – Tây Ninh Dưa chua – Tây Ninh Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương Dưa chua - Thủ Dầu Một, Bình Dương Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua - Thủ Đức, TPHCM Dưa chua -Long An Dưa chua -Long An Sữa bò tươi-Thủ Đức, TPHCM Sữa chua - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua Betagen - Thủ Đức TPHCM Sữa chua -Long An Sữa chua Lothamilk - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua Probi - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua Vinamilk - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua WellYo - Thủ Đức, TPHCM Sữa chua Yakult - Thủ Đức, TPHCM 23 Mật độ vi khuẩn (cfu/ml) 1,6 x 107 4,9 x 107 2,66 x 109 7,3 x 107 2,6 x 107 5,6 x 107 6,6 x 108 2,3 x 108 3,6 x 103 x 107 5,6 x 108 4,5 x 107 x 107 3,68 x 107 5,96 x 109 1,32 x 109 4,13 x 108 4,2 x 106 4,2 x 106 4,8 x107 2,7 x108 1,8 x 108 5,5 x 103 3,31 x 108 1,1 x 109 3,3 x 108 x 107 x 105 1,6 x 109 x 109 1,13 x 109 a b c Hình 4.1 Mẫu Sữa chua - Thủ Đức, TPHCM (KTX) môi trường MRS (a) Cấy trộn; (b) Cấy chấm; (c) Cấy ria Mật độ vi khuẩn tồn mẫu có dao động lớn: mẫu cải cải chua, mật độ vi khuẩn thường dao động khoảng từ 103 đến 109 cfu/ml, mẫu phân lập từ mẫu sữa chua có mật độ vi khuẩn ổn định khoảng 109 cfu/ml Mật độ vi khuẩn mẫu cải chua có dao động mẫu cải tiểu thương muối thủ công bày bán liên tục hết, điều có nghĩa lúc thu nhận mẫu tùy thuộc vào mẫu cải làm hay để lâu mà mật độ vi sinh vật khác Thường mẫu làm cải màu xanh, vàng nhạt, nước cải tương đối trong, mật độ vi sinh vật lúc tương đối cao Những mẫu để lâu cải chuyển sang màu vàng sậm, nước đục, mật độ vi sinh lúc thấp trình lên men lactic sinh acid nhiều làm mơi trường có độ pH thấp Việc lựa chọn nồng độ theo dãy nồng độ liên tiếp trở nên khó khăn phải ước lượng cảm quan Với mẫu sữa chua đóng hộp sẵn có ước lượng mật độ vi khuẩn sẵn đồng thời sản phẩm loại có đồng mật độ vi khuẩn, nên việc lựa chọn nồng độ pha loãng đơn giản Mật độ vi khuẩn sản phẩm sữa chua đóng hộp sẵn hầu hết đạt 109 cfu/ml 24 4.2 Kết định danh vi khuẩn phản ứng sinh hóa Bảng 4.2 Một số phản ứng sinh hóa dùng định danh Lactbacillus sp Mẫu Gram Hình dạng Catalase CPST + Cầu CPTN + Cầu + CSBT + Cầu + S2 + Cầu BET + Que C1 + Que C2 + Que CS + Que CSNL + Que CSNT + Que + CSST + Que CSTR + Que KTX + Que L + Que L4 + Que + LA2 + Que LA4 + Que LA6 + Que LT1 + Que LT2 + Que LTIIQ + Que MST + Que NCTB + Que NCTH + Que PRO + Que Q1 + Que Q2 + Que STQ + Que + VI + Que WY + Que Y + Que (-): âm tính, (+): dương tính Glucose Sinh khí (glucose) Lactose Sinh khí (lactose) Di động + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - 25 Oxy hóa Lên men - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4.2.1 Kết nhuộm Gram (b) (a) Hình 4.2 Kết nhuộm Gram (a) Trực khuẩn Gram dương mẫu Sữa chua Betagen - Thủ Đức TPHCM (BET) , (b) Cầu khuẩn Gram dương mẫu Dưa chua – Tây Ninh (CPST) cầu khuẩn Gram dương Kết nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn phân lập Gram dương, hầu hết trực khuẩn Những giống cầu khuẩn gồm CSBT, CPTN, ST, STQ Do Lactobacillus vi khuẩn hình que nên khẳng định giống giống cần phân lập Việc có xuất cầu khuẩn giải thích ngồi Lactobacillus số vi khuẩn khác tham gia vào trình lên men Streptococcus, Leconostoc, Pediococcus Các vi khuẩn có dạng hình cầu thuộc nhóm vi khuẩn lên men lactic 4.2.2 Kết thử nghiệm catalase Kết cho thấy hầu hết chủng phân lập khơng có enzyme catalase, riêng với chủng CPST, CSNT, CSBT, CPTN có sinh catalase Lactobacillus giống vi khuẩn khơng có men catalase nên khẳng định giống giống cần phân lập 4.2.3 Kết thử nghiệm di động môi trường thạch mềm Kết thử nghiệm cho thấy toàn chủng kiểm tra khơng có khả di động, vi khuẩn cấy vào môi trường mọc vết cấy mà không lan xung quanh, điều phù hợp với đặc điểm Lactobacillus Từ kết quan sát hình thái, nhuộm Gram, thử nghiệm Catalase, lên men Glucose Lactose ta kết luận có 24/31 chủng vi khuẩn phân lập 26 thuộc giống Lactobacillus Gồm giống sau: VI, BET, WY, PRO, L, Y, LA2, NCTH, NCTB, LA4, C1, C2, CS, MST,LA6, LTIIQ, CSTR, CSST, Q1, Q2, CSNL, KTX, LT1, LT2 4.2.4 Kết số phản ứng sinh hóa khác Bảng 4.3 Phản ứng sinh hóa Lactobacillus Sinh hóa Mẫu BET C2 CS CSST KTX LA2 LA6 LTI NCTB NCTH PRO VI WY Y C1 CSNL CSTR L LA4 LTII LTIIQ MST Q1 Q2 CIT GEL IND MAN MET SAC URE VP SUC TB DEX - - - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ++ + + + ++ + + + + + + + ++ ++ ++ + ++ + + + + CIT : thử nghiệm Citrat ; GEL : thử nghiệm Gelatin ; IND : thử nghiệm Indol ; MAN thử nghiệm lên men đường Manitol ; MET : thử nghiệm Methyl Red ; SAC : thử nghiệm lên men Sacharose ; URE : thử nghiệm Urease ; VP : thử nghiệm Voges – Proskauer ; SUC : thử nghiệm lên men đường Sucrose ; TB : thử nghiệm phân giải tinh bột ; DEX : thử nghiệm lên men đường Dextrose (‒) : âm tính; (+): dương tính khơng sinh hơi; (++) dương tính có sinh Theo Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Phạm Đình Trúc Linh (2007) khác chủng Lactobacillus sp phản ứng lên men đường Glucse, Manitol Lactose Các mẫu: VI, MST, LTI phù hợp với phản ứng sinh hóa Lactobacillus acidophilus, tương tự: Y, PRO, NCTB, Q1, LTIIQ, LA2, LA4, 27 LA6, WY là: Lactobacillus casei, mẫu L, CSST, C2, LTII, CSTR, CSNL, Q2, CS là: Lactobacillus fermentum (+) (-) Hình 4.3 Phản ứng sinh hóa lên men đường Sucrose (‒) : âm tính; (+): dương tính (+) (++) (-) Hình 4.4 Phản ứng sinh hóa lên men đường Glucose (‒) : âm tính; (+): dương tính khơng sinh hơi; (++) dương tính có sinh 28 (-) Hình 4.5 Phản ứng sinh hóa Citrat (‒) : âm tính; (+): dương tính (-) Hình 4.6 Phản ứng sinh hóa Indol (‒) : âm tính; (+): dương tính 29 4.3 Kết định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus sp phương pháp PCR 4.3.1 Kết phản ứng PCR L fermentum Các mẫu DNA mẫu vi khuẩn chọn ngẫu nhiên để thực phản ứng PCR khuếch đại trình tự vùng 16S rRNA với cặp primer LF1, LF2 mẫu CSNL, Q1, LTIIQ, MST cho kết PCR tương đối rõ, band kích thước tương đương khoảng 337 bp Kết luận có mẫu (CSNL) trùng với kết thử sinh hóa, mẫu có kết khác biệt với kết sinh hóa 500bp 337bp 200bp Hình 4.7 Hình điện di kết phản ứng PCR L fermentum (1 ) CSNL, (2) Q1, (3) WY, (4) L, (5) Y, (6) Ladder 50bp, (7) LTIIQ, (8) CS, (9) MST điện di gel agarose 3%, hiệu điện 50V 50 phút 100V 10 phút 30 4.3.2 Kết phản ứng PCR L casei Tương tự thí nghiệm xác định L fermentum, mẫu thực phản ứng PCR với cặp mồi định danh L.casei nhằm kiểm tra lại kết định danh L.fermentum 500bp Hình 4.8 Hình điện di kết phản ứng PCR L casei (1) Ladder 50bp, (2) CS, (3) LTII, (4) MST, (5) Q1 Điện di gel agarose 3%, hiệu điện 50V 50 phút 100V 10 phút Kết điện di từ hình 4.4 4.6 cho thấy mẫu CS, LTII, MST, Q1, WY, VI, L cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 727 bp, phù hợp với nghiên cứu Kwon ctv (2004) Tuy nhiên, nhận thấy có mẫu trùng với kết MST Q1, mẫu không trùng với kết thử sinh hóa (LTII, MST, Q1, VI, L) Chỉ có mẫu cho kết phù hợp với kiểm tra sinh hóa kiểm tra (WY, CS) Sự trùng lắp kết định danh L fermentum L casei giải thích cặp primer tham khảo từ nguồn khác Tuy việc kiểm tra bắt cặp primer trình tự 31 loài đặc hiệu thực tế có khả xảy Vì cần giải trình tự có giải thích 4.3.3 Kết phản ứng PCR L acidophilus Các mẫu DNA mẫu vi khuẩn L, Q1, MST, VI khuếch đại trình tự vùng 16S 23S rRNA với cặp primer IDL04F, IDL22R Cả mẫu không thấy xuất sản phẩm khuếch đại phù hợp với primer Từ kết phản ứng PCR cho thấy mẫu vi khuẩn khơng phải lồi L acidophilus 100bp 50bp Hình 4.9 Hình điện di kết phản ứng PCR L acidophilus (1) Ladder 50bp, (2) L, (3) Q1, (4) MST, (5) VI Điện di gel agarose 3%, hiệu điện 50V 50 phút 100V 10 phút 4.3.4 Kết phản ứng Phản ứng PCR đơn Multiplex PCR L casei L acidophilus Sau tiến hành phản ứng PCR xác định L casei L acidophilus, thực phản ứng multiplex PCR định danh loài, nhằm đưa quy trình định danh nhanh đơn giản Thí nghiệm tiến hành mẫu: WY, L, Y, CS, VI Tuy nhiên, giống với kết thí nghiệm định danh L acidophilus, phản ứng multiplex không xuất sản phẩm có kích thước phù hợp với L acidophilus, xuất sản phẩm có kích thước phù hợp với L casei Để hoàn 32 thiện quy trình multiplex định danh lồi cần mẫu dương tính với L acidophilus để làm mẫu chứng dương cho thí nghiệm 500bp Hình 4.10 Hình điện di Kết phản ứng Phản ứng PCR đơn Multiplex PCR L casei L acidophilus : (8) ladder 50bp (1)VI , (2) L, (10) Y, (14) WY(16) CS, L acidophilus (phản ứng đơn ) (3) WY, ( 4)VI, (6)L, (9)CS, (11)Y, , L casei (phản ứng đơn) (5) WY, (7) Y, (12) VI , (13)CS, (15) L Phản ứng Multiplex Điện di gel agarose 3%, hiệu điện 50V 50 phút 100V 10 phút 33 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 31 mẫu dưa chua sữa chua phân lập 31 mẫu vi khuẩn Dựa vào kết sinh hóa đặc trưng định danh 24/31 mẫu vi khuẩn phân lập mẫu vi khuẩn Lactobacillus sp Định danh phản ứng PCR mẫu 24 mẫu vi khuẩn phân lập Mẫu dưa chua thu thập từ chợ Thủ Đức – TPHCM (kí hiệu mẫu CSNL) cho sản phẩm phản ứng PCR phù hợp với Lactobacillus fermentum Mẫu phân lập từ Sữa chua WellYo – Siêu Thị Coop - Mart Suối Tiên(kí hiệu mẫu WY) Mẫu dưa chua thu thập từ chợ Việt Thắng – Thủ Đức – TPHCM (kí hiệu mẫu CS) cho sản phẩm phản ứng PCR phù hợp với Lactobacillus casei 5.2 Đề nghị - Gửi mẫu giải trình tự để có kết luận chắn tên loài mẫu CSNL, WY CS - Tối ưu quy trình PCR định danh L casei - Xây dựng quy trình PCR định danh quy trình Multiplex PCR cho lồi L acidophilus 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Vương Thị Việt Hoa 2006 Giáo trình Vi sinh vật đại cương Đại học Nông Lâm TPHCM Hồ Quỳnh Thùy Dương 2008 Sinh học phân tử NXB Giáo dục Lê Thanh Mai 2009 Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men Đại học Bách Khoa Hà Nội NXB Khoa học kỹ thuật Lê Xuân Phương 2005 Giáo trình vi sinh vật học mơi trường NXB Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Duy Anh 2005 Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học, Luận văn kĩ sư Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học quốc gia Tp HCM Nguyễn Đức Lượng 2002 Thí nghiệm vi sinh vật học tập NXB Đại học quốc gia TP.HCM Nguyễn Ngọc Hải 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật NXB Nơng Nghiệp TP.HCM Phạm Đình Trúc Linh 2007 Khảo sát khả sinh axít lactic tính kháng Lactobacillus acidophilus vi khuẩn E coli dùng để sản xuất chế phẩm probiotic, Luận văn kĩ sư Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 10 Phạm Thị Trúc Phương 2005 Nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng sản xuất probiotic Luận văn kĩ sư Bộ môn Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 11 Trần Thị Thu Hồng 2009 Nghiên cứu Xác định chủng vi sinh vật Lactobacillus có mặt phế phụ phẩm nhà máy bia thử nghiệm bổ sung vào phần ăn cho lợn sau cai sữa Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 12 Trần Hoàng Ngọc Ái 2007 Nghiên cứu đề tài “Xác định nhanh Lactobacillus phương pháp PCR” phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới 13 Trần Hạnh Triết 2005 Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus sporogenes, Luận văn kĩ sư Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 14 Trần Linh Thước 2007 Phương pháp hân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm NXB Giáo dục 15 Trịnh Đình Đạt 2006 Cơng Nghệ Sinh Học – Tập Công Nghệ Di Truyền NXB Giáo dục 16 Tô Minh Châu 2000 Vi sinh vật ứng dụng chăn nuôi Tủ sách trường Đại học Nơng Lâm 35 TIẾNG NƯỚC NGỒI 17 Dickson E.M., Riggio M.P., and L Macpherson 2005 “ A novel speciesspecific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum”, Journal of Medical Microbiology (2005), 54, 299–303 18 Holt J.G 1994 Bergey’s manual of determinative bacteriology, (9th edition) Published by Springer, USA 19 Kwon H.S., Yang E.H., Yeon S.W., Kang B.H., and T.Y Kim 2004 “Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA”, FEMS Microbiology Letters 239 (2004) 267–275 20 Nelson D.L 2004 Lehninger Principles of biochemistry, (4th edition) Published by W H Freeman, USA 21 Prescott L.M 2002 Microbiology , (5th Edition) Published by McGraw-Hill Science, USA TÀI LIÊU TỪ INTERNET 22 http://www.thuviensinhhoc.com Ngày truy cập: 03/2012 23 http://enfo.agt.bme.hu/drupal/node/4330 Ngày truy cập: 03/2012 24 http://www.uiweb.uidaho.edu/micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf Ngày truy cập: 03/2012 25 http://www.umm.edu/altmed/articles/lactobacillus_000310.htm Ngày truy cập: 2/2012 36 ... thực phẩm nên làm gia vị loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Chúng dùng để acid hóa rượu vang hoa nghèo acid, ngồi vi khuẩn có khả tiết enzyme mạnh sử dụng công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm,... điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Hai loại gel sử dụng phương pháp gel polyacrylamide gel agarose Việc chọn loại gel nồng độ chất tạo thành gel tùy thuộc vào kích thước trung... định tính dựa tạo thành nitrite cạn kiệt nitrate Nitrite tạo thành từ nitrate phản ứng với sulphanilamide N – napthylenediamine hydrochloride pH acid cho hợp chất có màu hồng Thử nghiệm urease: dựa