BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA - ITS VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN XN ĐƠNG Niên khóa: 2008 – 2012 Tháng 07/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU PHÂN LẬP NẤM Botryodiplodia theobromae Pat TRÊN CÂY CAO SU BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG rDNA – ITS VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR Hƣớng dẫn khoa học: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN ANH NGHĨA NGUYỄN XUÂN ĐÔNG KS VŨ THỊ QUỲNH CHI Tháng 07/2012 LỜI CẢM ƠN Lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ sinh thành nuôi dạy nên ngƣời Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Quý thầy cô Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học tận tình dạy dỗ, tạo điều kiện tối đa cho nhƣ bạn sinh viên khác hồn thành chƣơng trình học trƣờng Xin chân thành cám ơn Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Bộ môn Giống tiếp nhận tạo điều kiện cho tôi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Lời tri ân sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Anh Nghĩa, Kỹ sƣ Vũ Thị Quỳnh Chi trực tiếp hƣớng dẫn, bảo truyền đạt nhiều kiến thức suốt trình hồn thành khóa luận Các chú, anh chị Bộ mơn Bảo vệ Thực vật Phịng Cơng nghệ Sinh học - Bộ môn Giống -Viện nghiên cứu Cao su Việt Nam ln tận tình bảo, động viên giúp đỡ tơi để tơi hồn thành đƣợc khóa luận Cảm ơn Thạc sĩ Lê Hồng Ngọc Anh gia đình tận tình dạy tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực khóa luận Và cuối xin cám ơn bạn thân yêu Trƣờng Đại Học Nông Lâm, bạn sinh viên thực tập Bộ môn Bảo vệ Thực vật, bên tôi, san sẻ niềm vui nỗi buồn với tôi, động viên suốt thời gian qua Tháng năm 2012 NGUYỄN XN ĐƠNG i TĨM TẮT Nấm B theobromae gây bệnh nứt vỏ cao su hay gọi bệnh Botryodiplodia Bệnh gây hại thân cao su giai đoạn vƣờn ƣơng, vƣờn kiến thiết lẫn vƣờn khai thác Bệnh bùng phát mạnh năm gần gây thiệt hại đáng kể nhiều diện tích cao su ngành Kiểm sốt bệnh thuốc hóa học gây ảnh hƣởng đến mơi trƣờng Kiểm sốt bệnh biện pháp di truyền đƣợc hi vọng đem lại kết tốt Trong nghiên cứu này, 20 MPL nấm B theobromae từ dịng vơ tính khác đƣợc thu thập từ vùng khác đƣợc tách đơn bào tử, nhân sinh khối ly trích DNA tổng số Đa dạng di truyền nấm B theobromae đƣợc đánh giá cách khuếch đại vùng rDNA – ITS với cặp mồi ITS1 ITS4, giải trình tự, so sánh kết để tìm khác biệt thị ISSR sử dụng 16 mồi đa hình đƣợc sàng lọc từ sƣu tập gồm 34 mồi ISSR Ma trận hệ số tƣơng đồng phân loài đƣợc thiết lập để đánh giá đa dạng di truyền 20 MPL Kết khuếch đại vùng rDNA – ITS cho thấy 20 MPL cho sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc nhƣ nhau, kết giải trình tự vùng rDNA – ITS khẳng định chúng có kích thƣớc 541 bp trình tự nucleotide MPL giống hồn tồn Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng với 20 MPL đƣợc dùng nghiên cứu chƣơng trình BLAST cho thấy trình tự rDNA – ITS mẫu nghiên cứu có mức tƣơng đồng từ 98 – 99% so với trình tự nấm B theobromae có sẵn GenBank Điều khẳng định MPL đƣợc nghiên cứu loài nấm B theobromae Sự giống hồn tồn trình tự nucleotide vùng rDNA – ITS 20 MPL cho thấy tính bảo tồn cao vùng rDNA – ITS hệ gen MPL đƣợc nghiên cứu Phân tích ISSR sử dụng 16 mồi tạo đƣợc 214 băng có 76,6 % băng đa hình Cây phân lồi dựa phân tích UPGMA hệ số tƣơng đồng di truyền DICE chia 20 MPL thành nhóm Kết cho thấy có phân nhóm theo vị trí địa lý mức độ thấp khơng có mối liên quan phân nhóm di truyền nguồn gốc ký chủ (dịng vơ tính cao su) MPL nấm B theobromae Từ khóa : Botryodiplodia theobromae, rDNA-ITS, thị phân tử ISSR, đa dạng di truyền ii SUMMARY Nguyen Xuan Dong, Nong Lam University, Ho Chi Minh City July, 2012 “Genetic diversity of Botryodiplodia theobromae isolated from rubber trees using rDNA – ITS sequence and ISSR markers” B theobromae is the pathogen causing die-back on rubber tree, which is also known as Botryodiplodia disease This disease caused major damages on the trunk and spread rapidly in recent years, causing significant damage on a large area of rubber growing regions Chemical controls are effective but it could harm the environment Genetic controls are expected to bring positive effects A total of 20 isolates of B theobromae from different Hevea clones growing in various rubber plantations in Viet Nam was isolated and purified using single spore isolation method Total genomic DNA from these isolates was extracted and amplified using ITS1 and ITS4 primer Consequently, PCR products were sequenced and then aligned to find the differences Meanwhile, genetic diversity of 20 B theobromae isolates was analysed using ISSR markers with 16 polymorphic primers screened from 34 ISSR primers Analysis of rDNA - ITS sequences of 20 B theobromae isolates confirmed that they have the same size, 541 bp, and these sequences were identical BLAST search using the sequence of amplified rDNA - ITS showed that the rDNA – ITS sequences of the studied isolates was 98 – 99% similarity to that of rDNA – ITS of B theobromae credited in GeneBank These results confirm that the studied isolates are belonged to B theobromae species The identical sequences in rDNA-ITS region implied high conservation of this region in the genome of the studied isolates ISSR analysis using 16 primers produced a total of 214 DNA bands, of which the polymorphic DNA bands was accounted for 76.6% The phylogenetic tree produced from UPGMA analysis based on DICE coefficient divided 20 isolates into two main genetic clusters Analysis of these genetic clusters showed the relationship between genetic groups and geographical origins at low levels and no relationship between genetic groups and the host origins (rubber clones) from which B theobromae was isolated Keywords : B theobromae, rDNA-ITS, ISSR markers, genetic diversity iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH .viii CHƢƠNG MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc cao su Hevea brasiliensis 2.1.1 Nguồn gốc cao su Việt Nam 2.1.2 Bệnh hại cao su 2.2 Sơ lƣợc nấm B theobromae 2.2.1 Phân loại học 2.2.2 Lịch sử phát nấm B theobromae 2.2.3 Phạm vi phân bố, phổ kí chủ khả gây bệnh 2.2.4 Đặc điểm hình thái 2.2.5 Đặc điểm sinh lý 2.2.6 Sự xâm nhiễm, lây lan khả tồn 2.3 Nấm B theobromae cao su 2.3.1 Tình hình tác hại bệnh 2.3.2 Triệu chứng bệnh 10 2.3.3 Biện pháp phòng trừ 13 2.4 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 13 2.4.1 Khái niệm đa dạng di truyền 13 2.4.2 Trình tự ribosomal DNA – Internal Transcribed Spacer (rDNA – ITS) 13 2.4.3 Chỉ thị phân tử phân tích đa dạng di truyền 17 2.5 Những nghiên cứu B theobromae nƣớc 21 iv 2.5.1 Trong nƣớc 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Vật liệu 23 3.2.1 Các MPL nấm B theobromae 23 3.2.2 Hóa chất 24 3.2.3 Máy móc thiết bị 26 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 3.3.1 Phƣơng pháp tách đơn bào tử nấm B theobromae 26 3.3.2 So sánh quy trình ly trích DNA từ MPL nấm B theobromae 27 3.3.3 Phân tích đa dạng di truyền từ kết giải trình tự vùng rDNA-ITS 27 3.3.4 Phân tích đa dạng di truyền thị ISSR 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết 30 4.1.1 So sánh quy trình ly trích DNA từ MPL nấm B theobromae 30 4.1.2 Nhận diện phân tích đa dạng di truyền MPL nấm B theobromae dựa phƣơng pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS 31 4.1.3 Kết sàng lọc mồi ISSR 33 4.1.4 Phân tích đa dạng di truyền mẫu phân lập nấm B theobromae dựa thị ISSR 35 4.2 Thảo luận 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism BLAST : Basic Local Alignment Search Tool CTAB : Hexacetyltrimethyl ammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic acid dNTPs : Deoxynucleotides EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid ISSR : Inter Simple Sequence Repeat ITS : Internal Transcribed Spacer mM : Milimolar MW : Molecular weight MPL : Mẫu phân lập NCBI : National Center for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction PDA : Potato Dextrose Agar RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA rDNA : Ribosomal deoxyribonucleotide acid RFLPs : Restriction Fragment Length Polymorphisms RNA : Ribonucleic acid RNase A : Ribonuclease A RRIM : Rubber Research Institute of Malaysia RRIV : Rubber Research Institute of Vietnam SAHN : Sequential Agglomerative Hierarical Nested cluster analysis SNPs : Single Nucleotide Polymorphism SSR : Simple Sequence Repeat SSU : Small subunit TAE : Tris acetate EDTA TE : Tris – EDTA UBC : University of British Columbia UPGMA : Unweighted Paired Group Method with Arithmetic Mean vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Danh sách mẫu nấm phân lập từ vùng địa lý khác 23 Bảng 3.2 Danh sách mồi, trình tự nhiệt độ bắt cặp 25 Bảng 4.1 Tổng số băng khuếch đại tỉ lệ đa hình mồi ISSR đƣợc sàng lọc MPL nấm B theobromae 34 Bảng 4.2 Tổng số băng DNA đƣợc khuếch đại tỉ lệ băng đa hình 16 mồi ISSR dùng phân tích đa dạng di truyền cho 20 MPL nấm B theobromae 35 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Hình thái nấm B theobromae Hình 2.2 Triệu chứng bệnh vƣờn stump 12 Hình 2.3 Triệu chứng bệnh vỏ xanh 12 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh có vỏ hóa nâu 12 Hình 2.5 Cấu trúc đơn vị rDNA 14 Hình 2.6 Vị trí bắt cặp mồi ITS) 15 Hình 4.1 Kết ly trích MPL nấm B theobromae sử dụng phƣơng pháp CTAB Dneasy Plant Mini Kit (Quiagen) 30 Hình 4.2 Kết định tính 21 mẫu DNA 21 MPL nấm B theobromae 31 Hình 4.3 Gel điện di sản phẩm PCR 20 MPL B theobromae dùng mồi ITS1 ITS4 32 Hình 4.4 Kết so sánh trình tự nucleotide vùng ITS1 20 MPL B theobromae 32 Hình 4.5 Kết BLAST trình tự rDNA-ITS 20 MPL GenBank (NCBI) 33 Hình 4.6 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA MPL nấm B theobromae với mồi ISSR Mj 3, Mj 4, Mj 33 Hình 4.7 Gel điện di sản phẩm khuếch đại DNA nấm B theobromae với mồi Mj5, T39, UBC 826, T27 theo thứ tự thị ISSR 36 Hình 4.8 Cây phân nhóm di truyền thu đƣợc từ phân tích UPGMA, sử dụng hệ số tƣơng đồng DICE dựa 214 băng ISSR, mối quan hệ di truyền 20 MPL nấm B theobromae 37 viii 80 0.4 1 0 0 0 0 0 1 0 81 0.38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 82 0.35 0 0 0 0 0 0 1 0 MJ MJ SIZE BoLK01 BoLK02 BoTN04 BoDN05 BoDN06 BoDN10 BoDN11 BoDN13 BoDN14 BoDN15 BoDN16 BoDN19 BoDN20 BoDN21 BoDN22 BoGL23 BoKT24 BoGL25 BoTN26 BoBP27 UB C 857 Band MỒI Phụ Lục Ma trận nhị phân 214 băng DNA tổng hợp từ 20 MPL nấm B theobromae sử dụng 16 mồi ISSR 83 0.25 0 0 0 0 0 0 0 84 0.24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 85 3.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 86 2.5 0 1 1 1 1 1 1 87 0 1 1 0 0 0 0 0 0 88 1.9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 89 1.6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 1.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 91 1.4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 92 1.2 0 1 0 1 1 0 1 93 1.1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 94 1.05 0 0 0 0 0 0 0 0 95 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 96 0.9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 97 0.75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 98 0.65 1 0 1 1 1 1 1 1 0 99 0.55 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 100 0.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 101 0.48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 102 0.4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 103 0.35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 104 0.3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 105 1.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 106 1.25 1 1 1 0 1 0 107 0.9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 108 0.8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 109 2.8 0 1 0 0 0 1 0 0 0 110 2.5 0 1 0 0 0 1 0 0 0 111 1.8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 112 1.55 1 1 1 1 1 1 1 1 1 113 1.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 114 1.2 0 0 0 0 0 0 115 1.1 0 0 0 0 0 1 0 0 116 1 1 1 0 0 1 0 1 117 0.8 1 0 0 0 1 0 0 1 118 0.76 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 119 0.7 0 0 0 0 0 0 0 120 0.55 0 1 1 0 0 1 0 0 121 0.45 1 0 0 0 0 0 1 122 0.4 1 1 1 0 0 0 0 123 0.35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 BoTN04 BoDN05 BoDN06 BoDN10 BoDN11 BoDN13 BoDN14 BoDN15 BoDN16 BoDN19 BoDN20 BoDN21 BoDN22 BoGL23 BoKT24 BoGL25 BoTN26 BoBP27 UBC 825 BoLK02 T37 BoLK01 T36 SIZE MJ3 band MỒI Phụ Lục (tt) Ma trận nhị phân 214 băng DNA tổng hợp từ 20 MPL nấm B theobromae sử dụng 16 mồi ISSR 124 0.3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 125 2.5 1 0 0 0 0 0 0 0 1 126 1.8 0 1 1 1 1 1 1 1 1 127 1.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 128 0 0 0 0 0 0 1 1 129 0.9 0 0 0 0 0 0 0 0 130 0.85 1 1 1 1 1 1 1 1 1 131 0.75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 132 0.7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 133 0.53 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 134 0.45 1 1 1 1 1 1 1 1 1 135 0.28 1 1 1 0 0 1 1 1 1 136 0.24 1 1 1 1 1 1 1 1 1 137 3.5 1 1 1 1 1 1 1 138 1.75 1 1 1 1 1 1 1 1 139 1.5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 140 1.25 1 1 1 1 1 1 1 1 141 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 142 0.75 0 1 1 1 0 1 0 0 143 0.65 0 1 0 0 0 0 0 0 144 0.55 0 1 1 0 1 0 0 1 145 0.48 1 1 1 1 1 1 1 1 1 146 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 147 0 1 1 1 1 1 1 1 148 1.7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 149 1.5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 150 1.25 0 0 1 1 0 1 0 0 0 151 1.1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 152 0.85 1 1 0 0 1 1 0 1 153 0.8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 154 0.75 0 0 0 1 0 0 0 0 155 0.45 1 0 1 1 0 0 0 0 0 156 0.32 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 157 3.5 0 0 1 1 0 0 1 158 2.8 0 0 1 1 0 1 0 159 1.8 0 0 0 0 0 0 0 0 160 1.7 0 0 0 0 0 0 0 1 161 1.5 0 0 1 0 0 0 0 0 0 162 1.4 0 0 0 0 1 0 0 0 0 163 1.35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 164 1.25 1 1 0 1 0 0 1 1 BoLK01 BoLK02 BoTN04 BoDN05 BoDN06 BoDN10 BoDN11 BoDN13 BoDN14 BoDN15 BoDN16 BoDN19 BoDN20 BoDN21 BoDN22 BoGL23 BoKT24 BoGL25 BoTN26 BoBP27 T33 SIZE T27 band MỒI Phụ Lục (tt) Ma trận nhị phân 214 băng DNA tổng hợp từ 20 MPL nấm B theobromae sử dụng 16 mồi ISSR 165 1.2 0 1 0 0 0 0 0 0 166 1.15 0 0 0 0 0 0 0 0 167 1.1 0 0 0 0 0 0 0 0 168 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 169 0.95 0 1 1 1 1 1 1 1 170 0.85 0 0 0 0 0 0 0 0 0 171 0.8 1 1 1 0 1 1 1 172 0.75 0 0 0 0 0 0 0 0 0 173 0.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 174 0.65 0 0 0 0 0 0 1 0 175 0.55 0 0 0 0 0 0 0 0 176 0.48 1 1 1 1 1 1 1 1 1 177 1.2 1 1 1 1 1 1 1 1 178 0 0 0 1 0 0 0 179 0.87 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 180 0.65 1 1 1 1 1 1 1 1 1 181 0.6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 182 0.55 1 1 1 1 1 1 1 1 183 0.43 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 184 0.3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 185 0.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 186 2.35 1 1 1 1 1 1 1 1 1 187 1.75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 188 0.9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 189 0.8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 190 0.75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 191 0.7 1 1 1 1 1 1 1 0 0 192 0.6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 193 0.4 1 1 1 0 1 1 0 1 194 0.35 1 0 0 0 0 1 1 0 0 195 0.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 196 0.2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 T31 197 1 0 1 1 1 0 1 198 1.7 0 0 0 0 1 0 0 1 1 199 1.6 1 0 0 1 1 1 1 1 1 200 1.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 201 1.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 202 0 1 0 1 0 1 1 0 0 203 0.9 0 1 1 1 1 1 1 0 1 204 0.85 1 0 0 0 1 1 1 1 1 205 0.75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 band SIZE BoLK01 BoLK02 BoTN04 BoDN05 BoDN06 BoDN10 BoDN11 BoDN13 BoDN14 BoDN15 BoDN16 BoDN19 BoDN20 BoDN21 BoDN22 BoGL23 BoKT24 BoGL25 BoTN26 BoBP27 MỒI Phụ Lục (tt) Ma trận nhị phân 214 băng DNA tổng hợp từ 20 MPL nấm B theobromae sử dụng 16 mồi ISSR 206 0.65 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 207 0.62 1 1 1 1 1 1 1 1 208 0.6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 209 0.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 210 0.4 1 1 1 1 1 1 1 0 211 0.32 1 1 1 1 1 1 1 1 1 212 0.3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 213 0.27 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 214 0.2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Phụ lục Khảo sát tính đa hình 34 mồi ISSR với MPL nấm B theobromae Kí hiệu M thang DNA chuẩn 1kb (Promega) DC đối chứng âm 1, 14, 24, 26 mẫu BoLK01, BoDN14, BoKT24, BoTN26 Phụ lục (tt)Khảo sát tính đa hình 34 mồi ISSR với MPL nấm B theobromae Kí hiệu M thang DNA chuẩn 1kb (Promega) DC đối chứng âm 1, 14, 24, 26 mẫu BoLK01, BoDN14, BoKT24, BoTN26 Phụ lục (tt) Khảo sát tính đa hình 34 mồi ISSR với MPL nấm B theobromae Kí hiệu M thang DNA chuẩn 1kb (Promega) DC đối chứng âm 1, 14, 24, 26 mẫu BoLK01, BoDN14, BoKT24, BoTN26 Phụ lục Khảo sát tính đa hình 16 mồi ISSR với 20 MPL nấm B theobromae Kí hiệu M thang DNA chuẩn 1kb (Promega) DC đối chứng âm 1-21 kí hiệu MPL theo thứ tự bảng 3.1 ... truyền số mẫu phân lập nấm Botryodiplodia theobromae cao su phƣơng pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS thị phân tử ISSR? ?? đƣợc thực 1.2.Yêu cầu đề tài  Xác định quy trình ly trích DNA nấm B theobromae. .. tính đa dạng mối quan hệ di truyền số MPL nấm B theobromae đƣợc thu thập số vùng trồng cao su Việt Nam phƣơng pháp giải trình tự vùng rDNA – ITS thị phân tử ISSR 1.3 Nội dung thực  Phân lập lƣu... số thứ tự từ 1-16 chọn để đánh giá đa dạng di truyền cho 20 MPL nấm B .theobromae 34 4.1.4 Phân tích đa dạng di truyền mẫu phân lập nấm B theobromae dựa thị ISSR Mối quan hệ di truyền 20 MPL nấm