BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐỖ TÔ HOA MAI Niên khóa: 2008 - 2012 Tháng năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC **************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE, CELLULASE, PROTEASE, LIPASE, PHYTASE CỦA BACILLUS SUBTILIS, THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS TRƢƠNG PHƢỚC THIÊN HỒNG ĐỖ TƠ HOA MAI Tháng năm 2012 LỜI CÁM ƠN Với tất lịng kính trọng, tơi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trƣờng Cám ơn thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học thầy ngồi trƣờng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu cho tơi suốt q trình học trƣờng Xin gửi lời tri ân sâu sắc đến ThS Trƣơng Phƣớc Thiên Hồng tận tình hƣớng dẫn, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hồn thành khóa luận Xin cảm ơn thầy anh chị làm việc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trƣờng trƣờng Đại học Nông Lâm hỗ trợ, giúp đỡ trình thực tập Viện Cám ơn anh chị bạn thực tập Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trƣờng trƣờng Đại học Nơng Lâm khuyến khích, ủng hộ giúp đỡ tơi thực tốt khóa luận Gửi lời cám ơn đến bạn bè thân yêu lớp DH08SH ngƣời bạn thân yêu khác tôi, bạn bên cạnh, động viên, giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt thời gian qua Con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cha mẹ thành viên gia đình quan tâm, chăm sóc, ln làm chỗ dựa vững cho vƣợt qua khó khăn Sinh viên thực Đỗ Tơ Hoa Mai i TĨM TẮT Ngày giới nƣớc, chế phẩm sinh học đƣợc ngành chăn nuôi, trồng trọt quan tâm nhiều, chúng giúp hạn chế việc sử dụng thuốc kháng sinh, tăng khả tiêu hóa hấp thụ thức ăn vật nuôi, giảm bớt phần thuốc trừ sâu chất hóa học sử dụng trồng trọt, giúp tận dụng phế phẩm sản xuất nông nghiệp, biến đổi chúng thành sản phẩm có giá trị sử dụng cao Ngoài ra, chế phẩm sinh học giúp nhà sản xuất thu lợi nhuận cao với chi phí đầu tƣ thấp, ngƣời nơng dân không cần kiến thức chuyên sâu sinh học dễ dàng sử dụng Nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày tăng, đa dạng hóa sản phẩm chế phẩm sinh học, nâng cao chất lƣợng tính an tồn sản phẩm, nghiên cứu “Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase vi khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi” đƣợc thực Các nội dung đƣợc thực nghiên cứu định tính định lƣợng enzyme, khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho sinh tổng hợp enzyme B subtilis nhƣ thời gian nuôi cấy mật độ giống nuôi cấy, kiểm tra chất lƣợng chế phẩm vừa sản xuất sau thời gian bảo quản Ở enzyme, chủng Bacillus subtilis cho khả sinh enzyme cao chủng Ba 82 (enzyme lipase), chủng Ba 71 (enzyme cellulase), chủng Ba 58 (enzyme protease, phytase, protease) Thời gian nuôi cấy tối ƣu 36 enzyme lipase phytase, 42 enzyme cellulase protease, 66 enzyme amylase Mật độ giống nuôi cấy tối ƣu 108 cfu/g (enzyme lipase, phytase amylase), 106 cfu/g (enzyme cellulase), 109 cfu/g (enzyme protease) Trong thí nghiệm nuôi cấy thu nhận chế phẩm, dạng nuôi cấy 500 g cho hoạt độ enzyme thấp Thời gian bảo quản 15 ngày ngắn, không thấy đƣợc thay đổi hoạt độ enzyme mật số vi khuẩn ii SUMMARY Currently, bio-products in livestock, crops are very much interested, because they help limit the use of antibiotics, increasing digestibility and food intake in animals, reduce a pesticide and chemical use in farming, which make use of waste in agricultural products and transform them into products with higher value uses To meet the demand for increasing diversification of biological products, improving quality and safety of the product, conduct research project "Survey ability biosynthesis enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase of Bacillus subtilis and experimental production of biological products used in animal husbandry " Aim of the study were qualitation and quantitation of enzymes from Bacillus subtilis, surveying the optimal culture conditions for the biosynthesis enzyme of B subtilis such as culture time and the bacteria density, quality control and storage for the product In each enzyme, Bacillus subtilis strains capable of high enzyme synthesis are strain Ba 82 (enzyme lipase), strain Ba 71 (cellulase enzyme), strain Ba 58 (protease enzyme, phytase, and protease), optimal culture time was 36 h for lipase and phytase enzyme, 42 h for cellulase and protease enzyme, 66 hours for the enzyme amylase Density of optimal bacterial culture is 108 CFU/g (enzyme lipase, phytase, and amylase), 106 CFU/g (enzyme cellulase), 109 CFU/g (protease) Type culture pilot (500 g) always has low enzyme activity Shelf life of products in 15 days is too short, not affect enzyme activity and bacterial density Keyword: Amylase, Bacillus subtilis, cellulase, lipase, phytase, protease iii MỤC LỤC Trang Lời cám ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng .viii Danh sách hình, biểu đồ viii Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát triển 2.1.2 Phân loại khoa học đặc điểm 2.1.2.1 Phân loại khoa học 2.1.2.2 Đặc điểm Bacillus subtilis 2.2 Khái quát chung enzyme 2.2.1 Enyme amylase 2.2.1.1 Nguồn thu nhận enzyme amylase 2.2.1.2 Đăc tính enzyme amylase 2.2.1.3 Ứng dụng enzyme amylase 2.2.2 Enzyme cellulase 2.2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme cellulase 2.2.2.2 Đặc tính enzyme cellulase 2.2.2.3 Cơ chế tác dụng celllulase 2.2.2.4 Ứng dụng enzyme cellulase 2.2.3 Enzyme protease 2.2.3.1 Nguồn thu nhận enzyme protease 2.2.3.2 Đặc điểm enzyme protease iv 2.2.3.3 Ứng dụng enzyme protease 2.2.4 Enzyme lipase 2.2.4.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase 2.2.4.2 Ứng dụng enzyme lipase 2.2.5 Enzyme phytase 2.2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme phytase 2.2.5.2 Ứng dụng enzyme phytase 10 2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc 10 2.3.1 Nghiên cứu nƣớc 10 2.3.2 Nghiên cứu nƣớc 11 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 12 3.2 Vật liệu 12 3.2.1 Đối tƣợng khảo sát 12 3.2.2 Các môi trƣờng dùng thí nghiệm 12 3.2.3 Dụng cụ, thiết bị hoá chất sử dụng thí nghiệm 13 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 14 3.3.1 Các bƣớc thực thí nghiệm 14 3.3.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào 15 3.3.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 15 3.3.3.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme protease (Anson, 1938) 15 3.3.3.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme α-amylase (Heinkel, 1956) 15 3.3.3.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase (Miller, 1959) 15 3.3.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme phytase (Fiske Subbarow, 1925) 15 3.3.3.5 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 16 3.3.4 Phƣơng pháp định tính enzyme 16 3.3.5 Phƣơng pháp chọn chủng có khả sinh tổng hợp enzyme cao 16 3.3.6 Phƣơng pháp khảo sát số điều kiện ảnh hƣởng 16 3.3.6.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 16 3.3.6.2 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ giống cho vào nuôi cấy 16 3.3.6 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis, kiểm tra chất lƣợng chế phẩm 17 3.3.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 17 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 4.1 Định tính enzyme chủng Bacillus subtilis 18 v 4.2 Định lƣợng hoạt độ enzyme chủng Bacillus subtilis 19 4.2.1 Định lƣợng hoạt độ enzyme lipase 19 4.2.2 Định lƣợng hoạt độ enzyme amylase 20 4.2.3 Định lƣợng hoạt độ enzyme cellulase 20 4.2.4 Định lƣợng hoạt độ enzyme phytase 21 4.2.5 Định lƣợng hoạt độ enzyme protease 21 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố lên khả sinh tổng hợp enzyme 22 4.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 22 4.3.1.1 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme lipase 22 4.3.1.2 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme amylase 23 4.3.1.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 24 4.3.1.4 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme phytase 25 4.3.1.5 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzyme protease 26 4.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng mật độ giống cho vào nuôi cấy 27 4.3.2.1 Ảnh hƣởng mật độ giống lên khả sinh tổng hợp enzyme lipase 27 4.3.2.2 Ảnh hƣởng mật độ giống lên khả sinh tổng hợp enzyme amylase 28 4.3.2.3 Ảnh hƣởng mật độ giống lên khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 28 4.3.2.4 Ảnh hƣởng mật độ giống lên khả sinh tổng hợp enzyme phytase 29 4.3.2.5 Ảnh hƣởng mật độ giống lên khả sinh tổng hợp enzyme protease 29 4.4 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau sản xuất sau thời gian bảo quản 30 4.4.1 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau sản xuất 31 4.4.2 Kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản 32 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B.subtilis Bacillus subtilis DAP Diammonium phosphate CMC Carboxymethyl cellulose Cfu Colony forming unit ctv Cộng tác viên TCA Tricloroacetic acid Tb tế bào UI Đơn vị hoạt độ quốc tế vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Biến thiên đƣờng kính vịng phân giải chất enzyme 18 Bảng 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase 19 Bảng 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase 20 Bảng 4.4 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase 20 Bảng 4.5 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase 21 Bảng 4.6 Biến thiên hoạt độ enzyme protease 21 Bảng 4.7 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo thời gian nuôi cấy 23 Bảng 4.8 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo thời gian nuôi cấy 23 Bảng 4.9 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo thời gian nuôi cấy 25 Bảng 4.10 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo thời gian nuôi cấy 26 Bảng 4.11 Biến thiên hoạt độ enzyme lipase theo mật độ giống 27 Bảng 4.12 Biến thiên hoạt độ enzyme phytase theo mật độ giống 29 Bảng 4.13 Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo mật độ giống 30 Bảng 4.14 Hoạt độ enzyme chế phẩm sau sản xuất 31 Bảng 4.15 Mật số vi khuẩn chế phẩm sau sản xuất 31 Bảng 4.16 Hoạt độ enzyme, mật số vi khuẩn chế phẩm sau 15 ngày bảo quản 32 DANH SÁCH CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 3.1 Sơ đồ thực thí nghiệm 14 Biểu đồ 4.1 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo thời gian nuôi cấy 24 Biểu đồ 4.2 Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo mật độ giống nuôi cấy 28 Biểu đồ 4.3 Biến thiên hoạt độ enzyme cellulase theo mật độ giống nuôi cấy 28 viii Bảng 23 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm định lƣợng hoạt độ phytase Lần lặp lại Ký hiệu chủng Trung bình Ba 02 – rd2 140,00 176,70 158,35 Ba 82 160,00 133,30 146,65 Ba 43 33,30 66,70 50,00 Ba 58 200,00 196,65 198,33 Ba 69 146,70 193,35 170,03 Bảng 24 Bảng ANOVA thí nghiệm định lƣợng hoạt độ phytase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 25350.414 6337.603 11.818 0.0092 Within 2681.393 536.279 Total 28031.806 Coefficient of Variation = 16.01% Bảng 25 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm định lƣợng hoạt độ phytase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 93.38 s_ = 16.37 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 158.4 146.7 50.00 198.3 170.0 A A B A A Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = 198.3 170.0 158.4 146.7 50.00 A A A A B Bảng 26 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm định lƣợng hoạt độ protease Ký hiệu chủng Lần lặp lại Trung bình Ba 02 – rd2 8,48 10,97 9,73 Ba80 12,96 11,29 12,13 Ba71 5,13 5,88 5,51 Bảng 26 (tt) Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm định lƣợng hoạt độ protease Lần lặp lại Ký hiệu chủng Trung bình Ba74 16,48 17,79 17,14 Ba58 20,07 19,45 19,76 Bảng 27 Bảng ANOVA thí nghiệm định lƣợng hoạt độ protease A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 260.714 65.178 56.098 0.0002 Within 5.809 1.162 Total 266.523 Coefficient of Variation = 8.39% Bảng 28 Bảng trắc nghiệm phân hoạng thí nghiệm hoạt độ protease Duncan's Multiple Range Test LSD value = 4.347 s_ = 0.7622 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 9.730 12.12 5.510 17.14 19.76 BC B C A A Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = 19.76 17.14 12.12 9.730 5.510 A A B BC C Bảng 29 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme lipase Lần lặp lại Thời gian ni Trung bình cấy (giờ) 24 45,0 45,0 45,0 30 45,0 45,0 45,0 36 97,5 82,5 90,0 42 37,5 37,5 37,5 48 15,0 15,0 15,0 54 15,0 15,0 15,0 Bảng 29 (tt) Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme lipase Lần lặp lại Thời gian nuôi Trung bình cấy (giờ) 60 15,0 15,0 15,0 66 15,0 15,0 15,0 72 15,0 15,0 15,0 78 0,0 15,0 7,5 Bảng 30 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy enzyme lipase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 11475.000 1275.000 56.667 0.0000 Within 10 225.000 22.500 Total 19 11700.000 Coefficient of Variation = 15.81% Bảng 31 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme lipase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 15.03 s_ = 3.354 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 45.00 45.00 90.00 37.50 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 7.500 B B A B C C C C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order 10 = = = = = = = = = = 90.00 45.00 45.00 37.50 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 7.500 A B B B C C C C C C Bảng 32 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy enzyme amylase Lần lặp lại Thời gian ni Trung bình cấy (giờ) 24 55,30 58,83 56,92 30 83,87 67,74 75,81 36 77,42 79,72 78,57 42 101,38 73,73 87,56 48 113,82 108,76 111,29 54 112,44 112,44 112,44 60 126,27 100,00 113,14 66 116,13 131,34 123,74 72 126,67 110,60 118,64 78 101,38 89,86 95,62 Bảng 33 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy enzyme amylase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8718.193 968.688 8.139 0.0015 Within 10 1190.233 119.023 Total 19 9908.426 Coefficient of Variation = 11.20% Bảng 34 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme amylase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 34.58 s_ = 7.714 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = 57.07 75.81 78.57 87.56 111.3 C BC BC ABC AB Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = 123.7 118.6 113.1 112.4 111.3 A A AB AB AB Bảng 34 (tt) Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme amylase Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = 112.4 113.1 123.7 118.6 95.62 AB AB A A AB Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = 95.62 87.56 78.57 75.81 57.07 AB ABC BC BC C Bảng 35 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme cellulase Lần lặp lại Thời gian ni cấy (giờ) Trung bình 24 405,95 405,95 405,95 30 608,93 405,05 507,44 36 1217,86 1623,82 1420,84 42 3450,61 4059,54 3755,08 48 3044,65 2435,72 2740,19 54 1014,88 1623,82 1319,35 60 608,93 1420,84 1014,89 66 405,95 1014,88 710,42 72 811,91 608,93 710,42 78 202,98 405,95 304,47 Bảng 36 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme cellulase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 22364534.959 2484948.329 19.498 0.0000 Within 10 1274440.258 127444.026 Total 19 23638975.217 Coefficient of Variation = 27.80% Bảng 37 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme cellulase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 1131 s_ = 252.4 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 406.0 507.0 1421 3755 2695 1319 1015 710.4 710.4 304.5 B B B A A B B B B B Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 3755 2695 1421 1319 1015 710.4 710.4 507.0 406.0 304.5 A A B B B B B B B B Bảng 38 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme phytase Lần lặp lại Thời gian nuôi Trung bình cấy (giờ) 24 13,3 33,3 23,30 30 53,3 46,7 50,00 36 126,7 166,7 146,70 42 126,7 133,3 130,00 48 46,7 26,7 36,70 54 20,0 20,0 20,00 60 20,0 20,0 20,00 66 20,0 20,0 20,00 72 6,7 33,3 20,00 78 13,3 20,0 16,65 Bảng 39 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme phytase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 42650.339 4738.927 29.257 0.0000 Within 10 1619.785 161.978 Total 19 44270.124 Coefficient of Variation = 26.33% Bảng 40 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme phytase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 40.34 s_ = 8.999 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 23.30 50.00 146.7 130.0 36.70 20.00 20.00 20.00 20.00 16.65 B B A A B B B B B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order 10 = = = = = = = = = = 146.7 130.0 50.00 36.70 23.30 20.00 20.00 20.00 20.00 16.65 A A B B B B B B B B Bảng 41 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme protease Lần lặp lại Thời gian nuôi Trung bình cấy (giờ) 24 1,04 1,52 1,28 30 1,45 1,66 1,56 36 6,44 7,06 6,75 42 10,04 6,99 8,52 48 4,64 5,61 5,13 54 5,40 4,15 4,78 60 3,46 5,26 4,36 Bảng 41 (tt) Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme protease Lần lặp lại Thời gian ni Trung bình cấy (giờ) 66 3,05 4,85 3,95 72 2,56 5,26 3,91 78 4,36 2,42 3,39 Bảng 42 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy enzyme protease A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 84.799 9.422 6.282 0.0041 Within 10 14.999 1.500 Total 19 99.798 Coefficient of Variation = 28.08% Bảng 43 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme protease Duncan's Multiple Range Test LSD value = 3.882 s_ = 0.8660 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 1.280 1.560 6.750 8.520 5.130 4.780 4.360 3.950 3.910 3.390 Ranked Order C C AB A ABC ABC ABC BC BC BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean 10 = = = = = = = = = = 8.520 6.750 5.130 4.780 4.360 3.950 3.910 3.390 1.560 1.280 A AB ABC ABC ABC BC BC BC C C Bảng 44 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme lipase Lần lặp lại Mật độ (cfu/g) Trung bình 104 15,0 15,0 15,00 105 15,0 30,0 22,50 106 15,0 37,5 26,25 107 45,0 52,5 48,75 108 45,0 67,5 56,25 109 52,5 45,0 48,75 1010 30,0 22,5 26,25 Bảng 45 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme lipase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 3077.679 512.946 5.107 0.0252 Within 703.125 100.446 Total 13 3780.804 Coefficient of Variation = 28.78% Bảng 46 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát thời gian enzyme lipase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 23.70 s_ = 7.087 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 15.00 22.50 26.25 48.75 56.25 48.75 26.25 C C BC AB A AB BC Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = 56.25 48.75 48.75 26.25 26.25 22.50 15.00 A AB AB BC BC C C Bảng 47 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme amylase Lần lặp lại Mật độ (cfu/g) Trung bình 104 48,85 41,47 45,16 105 43,32 48,39 45,86 106 54,84 47 50,92 107 67,28 61,29 64,29 108 143,78 189,86 166,82 109 105,99 117,51 111,75 1010 100,92 108,76 104,84 Bảng 48 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme amylase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 25019.390 4169.898 23.398 0.0003 Within 1247.529 178.218 Total 13 26266.919 Coefficient of Variation = 15.85% Bảng 49 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme amylase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 46.72 s_ = 9.440 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 45.16 45.86 50.92 64.29 166.8 111.8 104.8 C C C BC A B B Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = 166.8 111.8 104.8 64.29 50.92 45.86 45.16 A B B BC C C C Bảng 50 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme cellulase Lần lặp lại Mật độ (cfu/g) Trung bình 104 1014,88 1014,88 1014,88 105 2029,77 1826,79 1928,28 106 2841,68 2435,72 2638,70 107 1217,86 405,95 811,91 108 405,95 608,93 507,44 109 608,93 405,95 507,44 1010 405,95 202,98 304,47 Bảng 51 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme cellulase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 8957991.136 1492998.523 21.139 0.0004 Within 494400.370 70628.624 Total 13 9452391.506 Coefficient of Variation = 24.12% Bảng 52 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme cellulase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 930.0 s_ = 187.9 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 1015 1928 2639 811.9 507.4 507.4 304.4 BC AB A C C C C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = 2639 1928 1015 811.9 507.4 507.4 304.4 A AB BC C C C C Bảng 53 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme phytase Lần lặp lại Mật độ (cfu/g) Trung bình 104 40,0 40,0 40,00 105 53,3 46,7 50,00 106 53,3 60,0 56,65 107 53,3 60,0 56,65 108 10,0 86,7 93,35 109 86,7 66,7 76,70 1010 33,3 60,0 46,65 Bảng 54 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme phytase A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 4183.560 697.260 6.859 0.0114 Within 711.560 101.651 Total 13 4895.120 Coefficient of Variation = 16.80% Bảng 55 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme phytase Duncan's Multiple Range Test LSD value = 23.84 s_ = 7.129 at alpha = 0.050 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = = 40.00 50.00 56.65 56.65 93.35 76.70 46.65 C C BC BC A AB C Mean Mean Mean Mean Mean Mean Mean Ranked Order = = = = = = = 93.35 76.70 56.65 56.65 50.00 46.65 40.00 A AB BC BC C C C Bảng 56 Số liệu dùng xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy enzyme protease Mật độ (cfu/g) Lần lặp lại Trung bình 104 4,91 3,46 4,19 105 4,36 7,68 6,02 106 6,02 6,85 6,44 107 5,33 8,03 6,68 108 9,14 4,57 6,86 109 5,12 9,00 7,06 1010 3,32 5,75 4,54 Bảng 57 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát mật độ giống cho vào ni cấy enzyme protease A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 15.879 2.647 0.589 Within 31.474 4.496 Total 13 47.353 Coefficient of Variation = 35.54% Phụ lục Hình Vịng phân giải tinh bột chủng Ba 43 Hình Vịng phân giải CMC chủng Ba 69 Hình Vịng phân giải lipid chủng Ba 80 Hình Vịng phân giải casein chủng Ba 58 Hình Vịng phân giải acid phytic chủng Ba 69 Hình Chế phẩm enzyme thơ (a) Protease, (b) Amylase, (c) Phytase, (d) Cellulase ... phẩm sinh học, nâng cao chất lƣợng tính an tồn sản phẩm, nghiên cứu ? ?Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme amylase, cellulase, protease, lipase, phytase vi khuẩn Bacillus subtilis, thử nghiệm sản xuất. .. học sử dụng trồng trọt, giúp tận dụng phế phẩm sản xuất nông nghiệp, biến đổi chúng thành sản phẩm có giá trị sử dụng cao Từ vấn đề lợi ích chế phẩm sinh học, đề tài ? ?Khảo sát khả sinh tổng hợp. .. thu sinh khối enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học Bùi Thị Phi (2007), phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học tìm hiểu khả sinh enzyme vi khuẩn Bacillus