BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘ KIT RT-LAMP PHÁT HIỆN VIRUS PRRS GÂY HỘI CHỨNG L Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : CAO THỊ MỸ HẠNH Niên khóa : 2008 – 2012 Tháng 7/2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘ KIT RT-LAMP PHÁT HIỆN VIRUS PRRS GÂY HỘI CHỨNG L Hƣớng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI CAO THỊ MỸ HẠNH KS VÕ KHÁNH HƢNG Tháng 7/2012 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin đƣợc cám ơn cha mẹ ngƣời thân gia đình ln tạo điều kiện động viên cho suốt trình học tập Xin chân thành cảm ơn : Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học quý thầy cô tận tình giúp đỡ dạy bảo suốt thời gian học tập trƣờng PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt trình nghiên cứu thực khóa luận Em chân thành cảm ơn thầy tận tình giải đáp thắc mắc cho em hiểu rõ, cám ơn thầy ln theo dõi giúp em vƣợt qua khó khăn để hòan thành tốt đề tài KS Võ Khánh Hƣng tận tình dẫn suốt trình thực đề tài KS Nguyễn Phan Thành tận tình giúp đỡ động viên trình nghiên cứu Các ơn bạn Thanh hồng, Tấn hùng Viết Học tận tình giúp đỡ, trao đổi kiến thức suốt trình thực đề tài Các thầy cô anh chị em viện Nghiên Cứu công Nghệ Sinh Học Và Môi Trƣờng- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt q trình thực tập Tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh Học khóa 2008 bạn bè đã giúp đỡ suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin chân thành cảm ơn đến bạn Thùy Dung, Kim Ngân, Thị Hoa Hòang Anh bên cạnh động viên giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu thực khóa luận tốt nghiệp Tp Hồ Chí minh, tháng năm 2012 Cao Thị Mỹ Hạnh i TÓM TẮT Đề tài đƣợc thực với mục đích nghiên cứu sản xuất thử nghiệm kit RTLAMP phát virút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo PRRSV RT-LAMP kỹ thuật đời vào năm 2000 nhƣng có nhiều ƣu điểm nhƣ độ nhạy cao, nhanh khơng đòi hỏi trang thiết bị máy móc đại Do đó, việc nghiên cứu sản suất thử nghiệm kit RT-LAMP nhằm phát vi-rút PRRS nhanh chóng, tiện lợi có hiệu cao Chèn đoạn gen ORF6 vào plasmid pGEM T Easy xây dựng đối chứng dƣơng cho kit RT-LAMP Nghiên cứu khảo sát kit RT-LAMP A (bao gồm tất thành phần hóa chất trộn chung tube trừ RNA mẫu ), RT-LAMP B (bao gồm Master Mix, Enzyme mix, primer mix) Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu, tính ổn định, thời gian sử dụng thời gian bảo quản hai kit Quá trình thực đề tài đạt đƣợc kết sau: Bộ kit RT-LAMP có độ nhạy cao, phát đƣợc DNA plasmid hỗn hợp phản ứng Đặc biệt, kit RT-LAMP đặc hiệu vùng gen ORF6 PRRSV Sau 14 tuần nghiên cứu khảo sát, kit RT-LAMP cho thấy kit hoạt động RNA mẫu Tuy nhiên đối chứng dƣơng (1 sao) không cho kết dƣơng tính Khơng có khác biệt đáng kể hiệu khuếch đại kit RT-LAMP A RT-LAMP B thời gian khảo sát ii SUMMARY Thesis title “ Study on the RT-LAMP kit for diagnosing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus “ RT-LAMP was discovered in 2000 which is a highly sensitive, rapid and inexpensive technique Therefore, the aim of this study was to produce the RT-LAMP kit for diagnosing the porcine reproductive and respiratory syndrome virus Plasmid pGMT- PRRSV was used as the positive control of the RT-LAMP kit for detection the PRRS virus Two types of the RT-LAMP Kit were studied The RTLAMP A kit contains Master Mix ( including Enzyme Mix, Primer Mix, Reation Mix) and the control DNA plasmid The RT-LAMP B kit included Master Mix , Enzyme Mix, Primer Mix and the control DNA Plasmid The sensitivity and specificity of two Kit were evaluted by detection of 10-fold dilutions of the plasmid pGMT- PRRSV On the other hand, evaluation of the duration for the storage and the usage was carried out The results showed that both of RT-LAMP Kit A and B could detect at least one copy of the ORF6 Plasmid The RT-LAMP kit amplifies gen ORF6 with high specificity After 14 weeks, the RT-LAM A and B still operate normally There was no considerable difference of efficacity in detecting ORF6 between the RT-LAMP A Kit and RT-LAMP B Kit Keyword: the RT-LAMP kit, porcine reproductive and respiratory syndrome virus iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT .ii SUMMARY iii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu-Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2 Đặc điểm virus gây rối loạn sinh sản hô hấp heo 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Cấu trúc phân tử PRRSV 2.2.2.1 Cấu trúc virion 2.2.2.2 Tổ bọ gen PRRSV 2.2.3 Phân bố bệnh PRRS 2.3 Một số phƣơng pháp chẩn đốn PRRSV phòng thí nghiệm 10 2.3.1 Chẩn đốn mơi trƣờng nuôi cấy tế bào 10 2.3.2 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase lớp (IMA) 11 2.3.3 Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp 11 2.3.4 Kỹ thuật PCR 11 2.4 Phƣơng pháp RT-LAMP 11 2.4.1 Khái niệm phƣơng pháp RT-LAMP 11 2.4.2 Thành phần phản ứng RT-LAMP 12 2.4.3 Các bƣớc phản ứng RT-LAMP 13 iv 2.4.4 Nhận biết kết phản ứng RT-LAMP 15 2.5 Nguyên tắc chế tạo kit 16 2.5.1 Kit 16 2.5.2 Nguyên tắc chế tạo kit 16 2.5.3 Kit thực phản ứng RT-LAMP 17 2.5.4 Tình hình sản xuất kit giới 17 2.5.4.1 Trên giới 17 2.5.4.2 Trong nƣớc 18 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Vật liệu hóa chất 19 3.2.1 Vật liệu 19 3.2.2 Hóa chất 19 3.2.3 Thiết bị dụng cụ 20 3.3 Phƣơng pháp tiến hành 20 3.3.1 Xây dựng đối chứng dƣơng 20 3.3.1.1 Thực phản ứng RT-PCR khuếch đại gen ORF6 PRRSV 22 3.3.1.2 Chèn đoạn ORF6 vào plasmid xây dựng đối chứng dƣơng 24 3.3.2 Xác định số lƣơng plasmid tái tổ hợp 24 3.3.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm kit RT-LAMP 25 3.3.3.1 Trình tự mồi thành phần hóa chất phản ứng RT-LAMP 25 3.3.3.2 Nghiên cứu sản xuất kít RT-LAMP 26 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Xây dựng đối chứng dƣơng cho kit RT-LAMP 29 4.1.1 Khuếch đại vùng gen ORF6 PRRSV RT-PCR 29 4.1.2 Kiểm tra plasmid chèn đoạn ORF6 30 4.2 Kết nghiên cứu thử nghiệm kit RT-LAMP 32 4.2.1 Kết khẳng định tính đặc hiệu kit RT-LAMP 32 4.2.2 Kết khảo sát độ nhạy tính ổn định kit RT-LAMP 33 4.2.3 Kết khảo sát thời gian sử dụng kit RT-LAMP A, RT-LAMP B 36 4.2.4 Kết khảo sát thời gian bảo quản kit RT-LAMP A, RT-LAMP B 38 v 4.2.5 Hiệu kinh tế kit RT-LAMP chẩn đoán PRRSV 41 4.3 Thảo luận 42 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT 5‟NTR 5‟Nontranslated Region aa Acid amin AMV Avian Myeloblastosis Virus BIP Backward Inner Primer cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid Ct Threshold cycle DNA Deoxyribonucleotide Acid dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EU European F Forward FA Fluorescent Assay FIP Forward Inner Primer FMDV Foot Mouth Disease Virus GP Glycoprotein IFA Indirect Immunoflourescence Assay IPMA Immunoperoxidase monolayer assay KD Kilo Dalton LOD Limit of Detection M protein MembranE protein MSD Mystery Swine Disease N protein Nucleocapside protein NA North American Nsp Non-structural protein ORF Open Reading Frame PAMs Porcine alveolar macrophage PCR Polymerase Chain Reaction PPV Porcine Parvovirus vii PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus PRV Pseudorabies Virus R Reverse RNA Ribonucleotide acid RT-LAMP ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermalAmplification RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction TBE Tris borate EDTA TE Tris EDTA TGEV Replication of Transmissible Gastroenteritis Coronavirus UTR Untranlated region viii 4.3 Thảo luận Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát khả phát PRRSV hai kit : kit RT-LAMP A kit RT-LAMP B Sử dụng plasmid chèn đoạn gen ORF6 pha lỗng có nồng độ từ 108 đến 100 để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu kit RT-LAMP Kết ngƣỡng phát hai kit RT-LAMP DNA plasmid Điều cho thấy kit RT-LAMP nhạy phát PRRSV Mặt khác, kit RT-LAMP đặc hiệu với vùng gen ORF6 Sau 14 tuần khảo sát thời gian sử dụng niệt độ -20oC, kit RT-LAMP A RT-LAMP B hoạt động RNA Tuy nhiên tuần thứ 14 hai kit cho kết âm tính với đối chứng duơng có Điều q trình bảo quản, plasmid bị phân hủy hay giảm hoạt tính hóa chất phản ứng RT-LAMP mà đặc biệt giảm hoạt tính enzyme Bst polymerase Mục đích việc khảo sát hai khác nhằm so sánh tìm kitcó ƣu điểm Sau 14 tuần khảo sát, không ghi nhận có thay đổi đáng kể kit Do tùy vào mục đích sử dụng nhƣ tính tiện lợi mà chọn kit thích hợp Bộ Kit RT-LAMP A có ƣu điểm nhanh, cần thao tác hút có tất thành phần phản ứng tube Còn với Kit RT-LAMP B thay đổi primer sử dụng để chẩn đoán đối tƣợng khác 42 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bộ kit RT-LAMP PRRSV đặc hiệu vùng gen ORF6, có độ nhạy cao, phát hiên DNA plasmid chứa mẫu Sau 14 tuần bảo quản nhiệt độ -20, kit RT-LAMP hoạt động với mẫu RNA nhƣng khơng khả phát hỗn hợp phản ứng Không có khác biệt đáng kể hiệu khuếch đại kit RT-LAMP A (Master Mix, đối chứng duơng) RT-LAMP B (Master Mix, Enzyme Mix, Primer Mix đối chứng dƣơng) sau 14 tuần khảo sát 5.2 Đề nghị Khảo sát kit RT-LAMP khoảng thời gian dài để đánh giá thay đổi kit RT-LAMP Ứng dụng kit RT-LAMP PRRSV vào thực tế sản xuất 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễ Nhà xuất Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tồn.2007 Chẩn đoán virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRS) kỹ thuật RT-PCR Tạp chí khoa học tập XIV, số 5: 5-12 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đồn Thị Thanh Hƣơng, Trần Quang Vui, Ph5m Công Hoạt Nguyễn Bá Hiền 2009 Phân tích gen M mã hóa protein màng virus gây bệnh “tai xanh “ Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc Thế Giới Tạp chí khoa học phát triển tập 7, số : 282-290 Tiếng Anh An T., Zhou Y., Liu G., Tian Z., Li L., Qiu H., and Tong G 2007 Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein of PRRSV isolates in mainland China from 1996 to 2006: Coexistence of two NA-subgeneotypes with great diversity Vet Microbiology 123: 43–52 Bautista E.M., Suarez P., and Molitor T.W 1999 T cell responses to the structural polypeptides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Arch Virol 144: 117-134 Benfield D.A., Zimmerman J., Murtaugh M.P., Osorio F., Stevenson G.W., and Torremorell M 2006 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Porcine Arterivirus) In Diseases of swine, 9th edition (B.E Straw., J.J Zimmerman., S D‟Allaire , D.J Taylor.,) Blackwell Publishing: 387 - 417 Casal J.I., Rodriguez M.J., Sarraseca J., Garcia J., Plana-Duran J., and Sanz A 1998 Identification of a common antigenic site in the nucleocapsid protein of European and North American isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Adv Exp Med Biol 440: 469-77 Changmu Chen, Shangjin Cui, Chaofan Zhang, Jun Li and Jinbao Wang 2009 Development and validation of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for detection of PRRSV Virus genes 40: 76 – 83 Chen J., Liu T., Zhu C.G., Jin Y.F., and Zhang Y.Z 2006 Genetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based on ORF5 Sequence Biochem Genet 44: 421–431 10 Christianson W.T., Collins J.E., Benfield D.A., Harris L., Gorcyca D.E., Chladek D.W., Morrison RB., and Joo HS 1992 Experimental reproduction of swine infertility and respiratory syndrome in pregnant sows Am J Vet Res 53: 485-8 11 Conzelmann K.K., Visser N., Van Woensel P., and Thiel H.J 1993 Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group Virology 193: 329-39 12 Dea S., Gagnon C.A., Mardassi H., Pirzadeh B., and Rogan D 2000 Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates Arch Virol 145: 659–688 13 Feng Y., Zhao T., Tung Nguyen, Innui K., Ma Y., Hoa Nguyen, Cam Nguyen, Liu D., Anh Bui, Thanh To, Wang C., Tian K., and Gao G F 2008 porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007 Emer Infect Diseases 14 (11): 1774-1776 14 Gao Z.Q., Guo X., and Yang H.C 2004 Geneomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus Arch Virol 149: 1341–1351 15 Gerard D.R., and Henegariu L.M 1997 Adjuvand in PCR reactions Biotechniques 23:504-511 16 Lee C., and Yoo D 2005 Cysteine residues of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus small envelope protein are non-essential for virus infectivity Journal of General Virology 86: 3091-6 17 Madsen, K G., Hansen, C M., Madsen, E S., Strandbygaard, B., Botner, A and Sorensen K J 1998 Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds Archives of Virology 143: 1683–1700 18 Mardassi H., Gonin P., Gagnon C.A., Massie B., and Dea S 1998 A subset of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP3 glycoprotein is released into the culture medium of cells as a non-virion-associated and membrane-free (soluble) form J Virol 72: 6298-306 19 Meulenberg J.J., de Meijer E.J., and Moormann R.J 1993 Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence J Gen Virol 74 (Pt 8): 1697-701 20 Meulenberg J.J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van Nieuwstadt A., Wensvoort G., and Moormann R.J 1997 Molecular characterization of Lelystad virus Vet Microbiol 55: 197-202 21 Meulenberg, J.J, van Nieuwstadt, A.P., van Essen Zandbergenl, A., Bos de Ruijter, J.N., Langeveld, J.P., Meloen, R.H 1998 Localization andfine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies Virology 252, 106–114 22 Mori Notomi 2009 Loop-mediated isothermal amplification(LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases J Infect Chemother 2009, 15:62–69 23 Nelson E.A., Christopher-Hennings J., and Benfield D.A 1995 Structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) Adv Exp Med Biol 380: 321–323 24 Nelson E.A., Christopher-Hennings J., Drew T., Wensvoort G., Collins J.E., et al 1993 Differentiation of U.S and European isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by monoclonal antibodies Journal Clinical Microbiol 31: 3184–3189 25 Ropp S L., Wees C E., Fang Y., Nelson E A., Rossow K D., Bien M., Arndt B., and S., Steen, P 2004 Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States J Virol 78: 3684–3703 26 Rowland R.R.R Schneider P., Fang Y., Wootton S Yoo D., and Benfield D.A 2003 Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus Virology 316: 135-45 27 Snijder E.J., and Meulenberg J.J (1998) The molecular biology of arteriviruses J Gen Virol 79: 961-79 28 Snijder E.J., van Tol H., Pedersen K.W., Raamsman M.J., and de Vries A.A 1999 Identification of a novel structural protein of arteriviruses J Virol., 73 (8): 63356345 29 Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., et al 2007 Emergenece of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark PloS ONE (6): 526 30 Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Tung Nguyen, Ken nui, Ying Ma, Thi Hoa Nguyen, Van Cam NguyenDi Liu, Quang Anh Bui, Long Thanh To, Chuanbin Wang, Kegong Tian and George F Gao 2007 Porcine Respiratoryand ReproductiveSyndrome Virus Variants, Vietnam and China, 2007 Emerging Infectious Disease vol 14: 1774 - 1776 31 Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R., ChristopherHennings J., and Nelson E 2001 A 10 kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b Virology 287: 183-191 Tài liệu internet 32 http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/rt_index.html Ngày truy cập 21/12/2011 33 http://www.impe-qn.org.vn/ /InfoPreview.jsp?ID=3566 34 http://khoahoc.aodatviet.vn/Home/KHCN/Kit-LAMP-chan-doan-nhanh-benh-yrentom/0113?134698.datviet Ngày truy cập 21/12/2011 35 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Ngày truy cập 8/2/2012 36 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp Ngày truy cập 27/12/2011 37 http://www.roche-applied-scienc.com Ngày truy cập 21/12/2011 PHỤ LỤC Phụ lục : Các bƣớc chèn ORF6 vào plasmid xây dựng đối chứng dƣơng 1.1 Thực phản ứng gắn vùng ORF6 vào plasmid pGEM-T Easy Sử dụng sản phẩm RT-PCR vừa khuếch đại thành công gắn vào plasmid pGEM-T Easy Vector System phƣơng pháp TA-Cloning chọn khuẩn lạc dƣơng cách phân biệt màu sắc khuẩn lạc ( khuẩn lạc xanh/trắng) Tag polymerase thêm 3‟-A overhang vào đầu sản phẩm PCR, tạo điều kiện nhân sản phẩm PCR trực tiếp vào cloning vector thẳng với 3‟- T overhang Sản phẩm PCR với dA overhang đƣợc trộn với vector Over hang T vector sản phẩm PCR đƣợc nối với tác động T4 DNA ligase Plasmid pGEM-T Easy Vector System (Promega) Quy trình thực phản ứng nối: Ly tâm nhẹ ống pGEM®-T Easy Vector thu phần đáy ống Vortex ống 2X Rapid Ligation Buffer kỹ trƣớc sử dụng Mix thành phần hóa chất Ủ khoảng điều kiện nhiệt độ phòng Bảng -PCR tạo sản phẩm gắn vào plasmid Thành phần Thể tích (µl) 2X Rapid ligation Buffer, T4 DNA Ligase pGEM-T Easy Vector (50 ng) Sản phẩm PCR T4 DNA Ligase Nƣớc khử Ion 1.2 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp phƣơng pháp calcium chloride Bƣớc : Hút 100 µl dịch vi khuẩn vào bình tam giác chứa 50 ml môi trƣờng LB lỏng Bƣớc : Nuôi cấy lắc vòng – 37 oC Bƣớc : Chuyển bình tam giác chứa vi khuẩn vào thùng đá giữ lạnh 30 phút Bƣớc : Hút 1.5 ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5 ml, ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút oC Bƣớc : Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới Lập lại từ bƣớc thêm lần Bƣớc : Cho ml CaCl2 100 mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc Dùng pipette trộn nhẹ để hòa tan phần sinh khối Bƣớc : Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút 0C Bƣớc : Đổ bỏ phần dịch bên Bƣớc : Cho 100 µl dung dịch (85% CaCl2 100 mM, 15% glycerol) lạnh vào hòa tan phần sinh khối trữ -70 0C 1.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt Hút 10 µl phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp Búng nhẹ tube vài lần Thực đồng thời với mẫu âm nƣớc Lập tức giữ tube đá 10 phút Sốc nhiệt tế bào 45 – 50 giây bồn nƣớc 42 oC Không lắc tube Lập tức chuyển tube lên đá phút Thêm 900 µl mơi trƣờng SOC lạnh vào phản ứng biến nạp Ủ 37 o C (lắc 225 rpm) Ly tâm tube thu cặn 4000 rpm 10 phút Hòa cặn 200 µl mơi trƣờng SOC trải 100 µl lên đĩa Ủ đĩa qua đêm 37oC (16 – 24 giờ) 1.4 Chọn lọc tế bào mang vector tái tổ hợp PCR khuẩn lạc Bảng Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) 10X PCR Buffer MgCl2 dNTP Primer F6 Primer R6 Taq DNA pol 0,5 Nƣớc khử ion 38,5 Bàng Chu trình nhiệt phản ứng PCR o Quá trình C) 95 30 giây 60 30 giây 72 phút 72 phút 25 Khuẩn lạc vi khuẩn đƣợc cho vào hỗn hợp phản ứng PCR cách dùng đầu típ vơ trùng chạm vào khuẩn lạc sàng lọc chuyển vào hỗn hợp phản ứng Thực phản ứng PCR đồng thời với mẫu chứng âm nƣớc Sản phẩm PCR sau đƣợc điện di gel 1,5 % để kiểm tra 1.5 Tăng sinh khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp ly trích plasmid Sau chọn lọc đƣợc khuẩn lạc mang lasmid tái tổ hợp cách PCR khuẩn lạc với cặp primer F6, R6 tiến hành tăng sinh khuẩn lạc ly trích plasmid để làm nguyên liệu cho trình nghiên cứu sản xuất kit RT-LAMP Khuẩn lạc đƣợc tăng sinh môi trƣờng LB lỏng (theo tỉ lệ 1:20) vòng 16 tiến hành ly trích plasmid DNA AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Quy trình ly trích plasmid DNA AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad): Bƣớc 1: Chuyển dịch vi khuẩn nuôi cấy vào ống eppendorf (1,5 - 2,0ml) Ly tâm phút 13000 vòng/phút 4oC Loại bỏ dịch việc gạn hay hút Bƣớc 2: Thêm 250 μl dung dịch resuspension vortex hút lên hút xuống đến cặn tế bào tan hoàn toàn Bƣớc 3: Thêm 250 μl dung dịch lysis trộn cách đảo ngƣợc eppendorf nhanh, mạnh - lần Không vortex lắc mạnh Dung dịch trở nên nhớt mỏng Bƣớc 4: Thêm tiếp 350μl dung dịch neutralization trộn cách đảo ngƣợc eppendorf - lần Không vortex lắc mạnh Kết tủa đƣợc hình thành Bƣớc 5: Ly tâm vòng phút 13000 vòng/phút 4oC hỗn hợp Cặn đặc trắng hình thành dọc theo cạnh dƣới đáy ống eppendorf Dịch chứa DNA plasmid Bƣớc 6: Trong li tâm, chèn cột plasmid mini column vào ống capless wash 2ml Bƣớc 7: Bằng việc hút hay gạn, chuyển dịch từ bƣớc vào cột plasmid mini column Li tâm phút 13000 vòng/phút 40 oC Bƣớc 8: Dung dịch wash solution đƣợc cung cấp nồng độ 5X Thêm vào thể tích (100 ml) ethanol 95 - 100% trƣớc sử dụng Bƣớc 9: Lấy cột plasmid mini column khỏi ồng wash tube Bỏ phần nƣớc lọc từ ống tube, chuyển plasmid mini column vào ống wash tube khác Thêm vào 750μl dung dịch wash solution li tâm phút 13000 vòng/phút 40C Bƣớc 10: Bỏ dung dịch wash solution từ ống tube, chuyển cột plasmid mini column vào ống wash tube khác Li tâm thêm phút để loại bỏ dung dịch wash solution lại Bƣớc 11: Chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf Thêm 50μl dung dịch elution vào màng đế cột cho phép phút để dung dịch bão hòa màng Li tâm phút 13000 vòng/phút 40 oC để tách rửa plasmid Bƣớc 12: Bỏ cột mini column trữ DNA tinh 4oC Plasmid sau ly trích đƣợc đo OD để xác định nồng độ Phụ lục Tính số pha lõang plasmid Bảng 3.4 Khối lƣợng plasmid chứa quan tâm Số Khối lƣợng (g) 108 4,15417.10-10 107 4,15417.10-11 106 4,15417.10-12 105 4,15417.10-13 104 4,15417.10-14 103 4,15417.10-15 102 4,15417.10-16 101 4,15417.10-17 100 4,15417.10-18 Bảng 3.5 Nồng độ DNA plasmid cân đạt đƣợc phản ứng Số Khối lƣợng plasmid cần Nồng độ cuối thêm vào(g) plasmid (g/µl) 108 4,12644.10-10 2,07709.10-10 107 4,12644.10-11 2,07709.10-11 106 4,12644.10-12 2,07709.10-12 105 4,12644.10-13 2,07709.10-13 104 4,12644.10-14 2,07709.10-14 103 4,12644.10-15 2,07709.10-15 102 4,12644.10-16 2,07709.10-16 101 4,12644.10-17 2,07709.10-17 100 4,12644.10-18 2,07709.10-18 Thực pha lỗng : sử dụng cơng thức để tính tốn thể tích cần thiết để chuẩn bị độ pha lỗng 108 Ta có : C1V1 = C2V2 190.10-11*V1 = 2.07709.10-10* 100 V1 = 10,93 ul => V nƣớc = 89,07 µl Bảng 3.6 Kết pha loãng từ 108 đến 100 Nguồn Nồng độ ban Thể Thể Thể tích Nồng độ cuối Số đầu tích tích cuối cuối plasm nƣớc 2µl id Stock 190.10-9 18 20 190.10-10 4.3621.1010 Pha loãng 190.10-10 18 20 190.10-11 4.3621.109 Pha loãng 190.10-11 10,93 89,07 100 2.07709.10-10 108 Pha loãng 2.07709.10-10 10 90 100 2.07709.10-11 107 Pha loãng 2.07709.10-11 10 90 100 2.07709.10-12 106 Pha loãng 2.07709.10-12 10 90 100 2.07709.10-13 105 Pha loãng 2.07709.10-13 10 90 100 2.07709.10-14 104 Pha loãng 2.07709.10-14 10 90 100 2.07709.10-15 103 Pha loãng 2.07709.10-15 10 90 100 2.07709.10-16 102 Pha loãng 2.07709.10-16 10 90 100 2.07709.10-17 101 Pha loãng 10 2.07709.10-17 10 90 100 2.07709.10-18 100 Pha loãng nồng độ theo hệ số 10 thu đƣợc nồng độ từ 108 đến 100 để kiểm tra độ nhạy kit RT-LAMP Đồng thời sử dụng 100 để làm đối chứng dƣơng cho trình khảo sát kit Phụ lục Hƣớng dẫn sử dụng kít Bƣớc : Chuẩn bị Master Mix Bộ kít đƣợc trữ -20 oC nên trƣớc sử dụng phải lấy hóa chất khỏi tủ trữ để nhiệt độ phòng Sau hóa chất tan đặt chúng lên đá gel để giữ lạnh Tiến hành pha Master Mix Chú ý phải trộn spin down tube Reation Mix, Primer mix enzyme mix trƣớc phân phối vào eppendorf Đối với kit RT-LAM A, cần thao tác, ta hút đƣợc master mix 18 µl Đối với kit RT-LAM B, thể tích thành phần cho phản ứng RTLAMP đƣợc thể sau : Thể tích thực phản ứng RT-LAMP Thành phần Reation Mix 1x thể tích µl 13,2 Primer Mix 3,6 Enzyme mix 1,2 Cho thành phần vào ống eppendorf, phải đảm bảo đủ 18 µl Nếu nhƣ cần thực với số lƣợng phản ứng nhiều ta pha Master Mix phân chia vào eppendorf Thêm µl RNA mẫu vào master mix ta đƣợc thể tich cuối 20 µl Đối với phản ứng đối chứng, sử dụng µl Free RNA Water cho đối chứng âm µl DNA plasmid ORF6 cho đối chứng dƣơng Sau cho đầy đủ thành phần tham gia phản ứng vào eppendorf, đảo nhẹ tube hay vortex để trộn thành phần Tiếp theo tube đƣợc ly tâm vài giây (spin down) để giọt nƣớc bám thành tube rơi xuống, đảm bảo thể tích phản ứng khơng bị thất Ở bƣớc cần lƣu ý tránh vortex mạnh điều làm bất hoạt enzyme bst polymerase Bƣớc : Thực phản ứng khuếch đại Sau có đƣợc tube phản ứng chứa tất thành phần tiến hành thực phản ứng khuếch đại : Cài đặt bồn ủ nhiệt 65oC tiến hành ủ 40 phút Bƣớc : Phát sản phẩm phản ứng RT-LAMP (1) Nhận biết sản phẩm RT-LAMP cách quan sát độ đục mắt thƣờng Phản ứng dƣơng tính hỗn hợp sau phản ứng bị đục màu trắng tạo thành gốc phosphate đƣợc giải phóng từ dNTP kết hợp với i-on Mg++ có thành phần phản ứng để tạo nên chất tủa vẩn đục Mg2P2O7 Phản ứng âm tính hỗn hợp suốt Tuy nhiên cách nhận biết thƣờng có độ xác khơng cao độ đục khó phân biệt mắt thƣờng Thƣờng ngƣời ta kết hợp với điện di gel hay sử dụng Sybr Green để nhận biết sản phẩm Nhƣ cho kết xác đáng tin cạnh (2) Nhận biết sản phẩm RT-LAMP thuốc thử SYBR Green Thêm 0.5µl SYRB Green 10X vào hỗn hợp sau phản ứng Phản ứng dƣơng tính làm đổi màu thuốc thử từ cam sang xanh Phản ứng với thuốc thử SYBR Green giúp việc nhận diện kết phản ứng RT-LAMP đơn giản, nhanh chóng tiết kiệm không cần thực bƣớc nhƣ điện di, quan sát mắt thƣờng Và SYBR Green phát sáng 1000 lần đƣợc chiếu UV, cho kết xác Do đó, sau thêm SYBR quan sát mắt thƣờng, tube phản ứng đƣợc đặt dƣới tia UV (3) Điện di gel agarose Điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP gel agarose 1,75% 100V 40 phút Nhuộm gel với ethidium bromide 15 phút Đọc kết điện di sản phẩm phản ứng RT-LAMP dƣới tia UV Một số ý cần thiết : Bộ kít phải đƣợc trữ -20 oC Do đƣợc trữ -20 oC , để tránh giảm chất lƣợng thành phần kit nên lấy lƣợng cần thiết để dử dụng trình rã đông đông lạnh nhiều lần ảnh hƣởng đến chất lƣợng kit Vì vậy, trƣớc sử dụng, tốt nên aliquot kít thành nhiều tube nhỏ Điều vừa tránh làm giảm chất lƣợng kit vừa có tránh nguy nhiễm cho tồn bộ kít Bởi chia nhỏ kit nhiều tube, chẳng may tube bị nhiễm sử dụng tube lại Khi hóa chất ra, phải để nhiệt độ phòng để hóa chất từ từ rã đơng, sau đặt lên túi đá gel tiến hành pha mix Trƣớc sử dụng, cần phải spin down để kéo giọt dung dịch bám thành hay nắp tube rơi xuống, sau trộn spin lần Chú ý tránh trộn mạnh điều làm ảnh hƣởng đến enzyme Bst polymerase Kiểm tra cẩn thận eppendort trƣớc sử dụng Tuyệt đối không sử dụng eppendorf bị rạn nứt hay thủng đáy khơng làm kết bị sai lệch mà làm tạp nhiễm sang thiết bị dụng cụ khác Điều làm cho kết thiếu xác kỹ thuật RT-LAMP kỹ thuật có độ nhạy cao (với100 copy/µl phản ứng RT-LAMP xảy ra) Và cần ý để ngăn chặn tạp nhiễm, tốt phải đóng chặt nắp sau pha mix xong ... điểm nhƣ độ nhạy cao, nhanh khơng đòi hỏi trang thi t bị máy móc đại Do đó, việc nghiên cứu sản suất thử nghiệm kit RT-LAMP nhằm phát vi-rút PRRS nhanh chóng, tiện lợi có hiệu cao Chèn đoạn gen... ứng đƣợc tiêu chí nhanh, tiện lợi, tiết kiệm thời gian, ổn định độ nhạy cao 1.3 Nội dung thực - Xây dựng đối chứng dƣơng cho kit RT-LAMP - Xác định số lƣợng plasmid - Nghiên cứu thi t lập kit RT-LAMP... xuất Trung Quốc từ 1995 nhanh chóng lan rộng khắp tỉnh thành gây thi t hại to lớn cho ngành chăn nuôi heo nƣớc (Chen ctv, 2006) Gần đây, chủng PRRSV Trung Quốc độc lực cao đƣợc nhắc đến nhiều