HỘI NGHỊ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TUỔI TRẺ LẦN THỨ XIX THIẾT KẾ, TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ N-HYDROXYBENZAMID/PROPENAMID MANG KHUNG QUINAZOLIN-4(3H)-ON HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ Báo cáo viên: Dương Tiến Anh Trường Đại học Dược Hà Nội NỘI DUNG CHÍNH Đặt vấn đề Nội dung phương pháp nghiên cứu Thực nghiệm, kết bàn luận Kết luận ĐẶT VẤN ĐỀ Hoạt động enzym HDAC HAT [1] [1] Blackbum C., Barrett C., Chin J., et al (2013), “Potent histone deacetylase inhibitors derived from 4-(aminomethyl)-N-hydroxybenzamide with high selectivity for the HDAC6 isoform”, Journal of Medicinal Chemistry, 56, pp 7201-7211 CÁC CẤU TRÚC KHUNG CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ 1.1 Hợp phần acid hydroxamic Hình Cấu trúc số chất ức chế HDAC Định hướng thiết kế chứa hợp phần acid hydroxamic CÁC CẤU TRÚC KHUNG CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ 1.2 Hợp phần Quinazolin-4(3H)-on Hình Cấu trúc số chất có hoạt tính sinh học mang khung quinazolin-4(3H)-on Định hướng thiết kế chứa hợp phần Quinazolin-4(3H)-on Thiết kế công thức chất hướng ức chế HDAC Hình Thiết kế số dẫn chất N-hydroxybenzamid/propenamid Mục tiêu nghiên cứu 4a: R = H 4b: R = 7-CH3 4c: R = 6-CH3 4d: R = 7-OCH3 4e: R = 6,7-(OCH3)2 4f: R = 7-F 4g: R = 6-F 4h: R = 6-Cl 8a: R = H 8b: R = 7-CH3 8c: R = 6-CH3 8d: R = 6-Cl 10a: R = H 10b: R = 7-CH3 10c: R = 6-CH3 10d: R = 6-Cl Thiết kế sàng lọc sơ dẫn chất tiềm Tổng hợp 16 dẫn chất N-hydroxybenzamid/propenamid Thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào chất tổng hợp NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu docking Hóa học - Tổng hợp hóa học Kiểm tra độ tinh khiết Khẳng định cấu trúc Thử tác dụng sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nghiên cứu docking Hóa học - Tổng hợp hóa học Kiểm tra độ tinh khiết Khẳng định cấu trúc Thử tác dụng sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Nghiên cứu Docking Kết Docking 16 dẫn chất N-hydroxybenzamid/propenamid với HDAC-2 Chất 4a R Ái lực liên kết (kcal/mol) - 6,69 4b -H 7-CH3 4c 6-CH3 - 6,76 4d 7-OCH3 - 7,44 4e 6,7-(OCH3)2 4f 4g 4h 7-F 6-F 6-Cl SAHA Chất R Ái lực liên kết (kcal/mol) 8a -H - 7,72 8b 7-CH3 - 7,87 - 6,85 8c 6-CH3 - 7,49 - 7,54 - 6,73 - 6,76 - 7,07 8d 6-Cl - 7,79 10a -H - 8,85 10b 7-CH3 - 8,28 10c 10d 6-CH3 7-F - 9,66 - 9,29 SAHA - 7,07 - 6,81 Dự đốn: 16 dẫn chất có hoạt tính tương đương SAHA 10 Có phổ 12C-NMR D-NMR? - Khơng có phổ 12C-NMR hạt nhân ngun tử 12C khơng có từ tính (A, Z, N chẵn, I = 0) - Có phổ D-NMR hạt nhân ngun tử D có từ tính (A chẵn, Z N lẻ, I = 1) Tuy nhiên phổ khơng phổ biến hàm lượng tự nhiên nghèo nàn so với H => độ nhạy Nó dùng trường hợp kiểm tra độ nhạy trình làm giàu D 63 Phản ứng alkyl hóa - Phản ứng alkyl hóa q trình thay nhiều nguyên tử H hợp chất hữu nhiều nhóm alkyl [9] - Các yếu tố ảnh hưởng: + Nhiệt độ: cần nhiệt độ cao + Tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng + Phản ứng thực pha lỏng => không chịu ảnh hưởng áp suất [9] PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, (2014), “Kỹ thuật hóa dược tập I”, Nhà xuất Y học 64 Tăng hiệu suất phản ứng tạo acid hydroxamic - Dùng dư hydroxylamin - Điều chỉnh pH môi trường kiềm (pH = 12) - Thực nhiệt độ thấp 65 Vai trò KI - Do I có bán kính ngun tử lớn Br, đồng thời có độ âm điện thấp Br  Liên kết C-I dễ đứt liên kết C-Br  KI cho vào để giảm lượng hoạt hóa, làm nhóm dễ dàng Phản ứng dễ xảy 66 Nhóm đẳng cấu điện tử - Đẳng cấu sinh học [5] Đẳng cấu điện tử nguyên tử nhóm nguyên tử (ion hay phân tử) mà lớp điện tử ngồi coi giống Một số định nghĩa bổ sung nhóm ĐCĐT nhóm có số điện tử π Đẳng cấu sinh học: nhóm thỏa mãn định nghĩa nhóm đẳng cấu điện tử theo nghĩa rộng cho loại hoạt tính sinh học Hiện nay, ĐCSH nhóm, chất có tính chất vật lý hóa học tương tự có loại hoạt tính tương tự có vai trò định tạo loại hoạt tính sinh học tương tự [5] GS.TS Nguyễn Hải Nam (2010), “Nghiên cứu phát triển thuốc mới’’ 67 Docking? - Docking phương pháp để dự đoán định hướng tốt phân tử với phân tử khác để gắn lại chúng tạo thành phức hợp ổn định - Sự hiểu biết định hướng tốt sử dụng để dự đoán độ lớn liên kết hay lực liên kết hai phân tử cách sử dụng trường lực - Trọng tâm docking phân tử mơ có tính tốn q trình tương tác phân tử Mục đích cuối đạt cấu hình tối ưu hóa cho protein, phối tử (ligand) định hướng tương đối protein phối tử cho lượng tự hệ thống cực tiểu 68 Tại thử HDAC-2 Chúng lựa chọn HDAC-2 + Hoạt động deacetyl hóa số “key” protein histon quy định HDAC-2 HDAC-3 Điều chứng minh qua nghiên cứu rõ ràng [8] + Hơn nữa, HDAC-2 có vai trò quan trọng việc thúc đẩy chu trình tế bào ức chế chết theo chương trình tế bào [8] Pelzel H.R., Schlamp C.L., Nickells R.W (2010) “Histone H4 deacetylation plays a critical role in early gene silencing during neuronal apoptosis”, BMC Neuroscience 11, pp 62 69 IC50? - Theo FDA, IC50 định nghĩa nồng độ thuốc cần thiết để gây 50% tác dụng ức chế phép thử in vitro - FDA: “IC50 represents the concentration of a drug that is required for 50% inhibition in vitro’’ 70 Nhiệt độ sôi số dung môi thông thường Dung môi DCM MeOH EtOH Nhiệt độ sôi (oC) 39,6 64,7 78,4 MeCN DMF Ethyl acetat 82 153 77,1 71 Chất chưa công bố tài liệu nào? - Bộ môn nhờ sử dụng ChemFinder, database cập nhật chất giới để xác định - Một số khung chất môn đăng ký quyền 72 Thử tác dụng ức chế HDAC + Bước 1: Enzym HDAC ủ với dẫn chất thử nhiều nồng độ khác 37oC 30 phút với có mặt chất HDAC có gắn huỳnh quang Thí nghiệm tiến hành lần + Bước 2: Thêm 50 µL HDAC assay developer (tạo chất phát huỳnh quang hỗn hợp phản ứng) (2x) vào lô Để nhiệt độ phòng 15 phút + Bước 3: Đọc kết độ hấp thụ máy đo hấp thụ huỳnh quang, bước sóng kích thích 350-360 nm bước sóng phát quang 440-460 nm (độ hấp thụ đo lần bước sóng) - Kết độ hấp thụ đưa vào phần mềm excel tính tốn thu phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Phần trăm chuyển sang phần mềm GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính tốn IC50 Độ lệch chuẩn tương đối không 10% 73 Thử tác dụng kháng TB ung thư - Dựa khả gắn thuốc nhuộm với acid amin protein tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ suy số lượng tế bào - Giá trị IC50 nồng độ mẫu thử mà độ hấp thụ giảm 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính giếng thêm mơi trường ni cấy), kết cuối giá trị trung bình lần đo độc lập với độ khác không 5% 74 Dòng TB HeLa - Tế bào HeLa loại tế bào thuộc dòng tế bào bất tử, phân lập từ tế bào ung thư cổ tử cung ngày tháng năm 1951 từ Henrietta Lacks, bệnh nhân qua đời ung thư vào ngày tháng 10 năm 1951.  - Dòng tế bào HeLa ổn định tăng sinh mạnh - dòng tế bào “bất tử” theo nghĩa chúng phân chia khơng giới hạn q trình ni cấy tế bào phòng thí nghiệm đảm bảo điều kiện cho tế bào sống (tức trì ổn định môi trường nuôi phù hợp).  - Các tế bào tăng sinh nhanh chóng lạ thường chí so sánh với dòng tế bào ung thư khác Cũng giống dòng tế bào ung thư khác, tế bào HeLa có dạng hoạt động enzym telomerase trình phân chia tế bào, điều ngăn chặn việc bị làm ngắn lại đầu telomere mà nguyên nhân gây trình lão hóa cuối chết tế bào Bằng cách này, tế bào ung thư tránh giới hạn Hayflick, điểm giới hạn số lần tế bào phân chia mà hầu hết tế bào trải qua trước trở nên lão hóa Tác dụng chất ức chế HDAC (HDACi) ROS HDAC HDACi 76 Vai trò HDAC HDACi 77 ... TRÚC KHUNG CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ 1.1 Hợp phần acid hydroxamic Hình Cấu trúc số chất ức chế HDAC Định hướng thiết kế chứa hợp phần acid hydroxamic CÁC CẤU TRÚC KHUNG CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ... Hóa học - Tổng hợp hóa học Kiểm tra độ tinh khiết Khẳng định cấu trúc Thử tác dụng sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN... QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nghiên cứu docking Hóa học  Tổng hợp hóa học  Kiểm tra độ tinh khiết - Khẳng định cấu trúc Thử tác dụng sinh học - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư