Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 ( Luận án tiến sĩ)
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC HỒNG THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2014 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hồng Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2013 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phòng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam- người thầy định hướng, truyền dạy kiến thức khoa học giúp đỡ vượt qua trở ngại khó khăn suốt thời gian thực luận án Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất giúp tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS TS Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS TS Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS Nguyễn Thị Hương-Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản 3, TS Đồn Lan Phương- Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên giúp đỡ số thử nghiệm động vật thực nghiệm, phân tích thành phần hàm lượng axít béo khơng bão hồ Bên cạnh đó, tơi nhận giúp đỡ, bảo tận tình chú, anh chị, bạn đồng nghiệp làm việc phòng Cơng nghệ Tảo: TS Hồng Thị Minh Hiền, ThS Ngơ Thị Hồi Thu, ThS Đinh Thị Ngọc Mai, KS Lê Thị Thơm, KS Nguyễn Cẩm Hà, KTV Đỗ Thị Là, ThS Đinh Đức Hồng, ThS Bùi Đình Lãm, ThS Hồng Sỹ Nam, ThS Nguyễn Đình Hưng Nhân dịp này, tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Luận án thực khn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) đề tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng Việt Nam nuôi sinh khối số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn ni trồng thuỷ sản” (20082010) thuộc chương trình cơng nghệ sinh học thủy sản Bộ NN PTNT PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Lan Anh ii Lời cam đoan Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Hoàng Thị Lan Anh iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Hệ thống phân loại, kĩ thuật phân lập định tên chi Schizochytrium 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Kĩ thuật phân lập định tên 1.1.2.1 Kĩ thuật phân lập 1.1.2.2 Các kĩ thuật định tên 1.2 Các axít béo khơng bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA) 1.2.1 Giới thiệu chung -3 PUFA 1.2.2 Vai trò -3 PUFA sức khoẻ người 1.2.3 Sản xuất ω-3 PUFA từ vi tảo 12 1.3 Đặc điểm sinh học chi Schizochytrium 14 1.3.1 Đặc điểm sinh thái 14 1.3.2 Ảnh hưởng số yếu tố lên sinh trưởng, tích lũy lipit -3 14 PUFA Schizochytrium 1.3.2.1 Ảnh hưởng nguồn C N 14 1.3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ muối 16 1.3.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 17 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp DHA chi Schizochytrium 20 1.4 Công nghệ ni trồng vi tảo biển dị dƣỡng nói chung chi 23 Schizochytrium nói riêng cho sản xuất -3 PUFA 1.4.1 Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng cho sản xuất -3 PUFA 23 1.4.2 Sản xuất DHA quy mô lớn chi Schizochytrium 25 iv 1.5 1.5.1 Những ứng dụng sinh khối chi Schizochytrium Ứng dụng nuôi trồng thủy sản 1.5.2 Sản xuất thức ăn cho gia súc, gia cầm 31 1.5.3 Sản xuất dầu sinh học giàu omega-3 32 1.5.4 Sản xuất nhiên liệu sinh học 33 1.6 Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dƣỡng Việt Nam 34 27 27 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu 37 2.1.1 Mẫu vật 37 2.1.2 Vi sinh vật 37 2.1.3 Các sinh phẩm 37 2.1.4 Động vật thí nghiệm 37 2.2 Hố chất 38 2.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 38 2.4 Mơi trƣờng 39 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.5.1 Phân lập chi Schizochytrium 40 2.5.2 Chụp ảnh hình thái tế bào kính hiển vi điện tử quét (SEM) 40 2.5.3 Các phương pháp sinh học phân tử 41 2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng Schizochytrium spp 41 2.5.3.2 Nhân gen kỹ thuật PCR 41 2.5.3.3 Tinh sản phẩm PCR 42 2.5.3.4 Tách dòng gen 42 2.5.3.5 Xác định trình tự gen 44 2.5.4 Xác định sinh trưởng chủng Schizochytrium spp 44 v 2.5.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng Schizochytrium spp 45 2.5.6 Xác định hàm lượng lipít sinh khối tảo 45 2.5.7 Phân tích thành phần hàm lượng axít béo sinh khối Schizochytrium spp 46 2.5.8 Phương pháp nhuộm lipít b ng ile ed 46 2.5.9 Phương pháp xác định đường khử b ng DNSA 46 2.5.10 Nghiên cứu tính an tồn viên Algal Omega -3 47 2.5.10.1 Nghiên cứu độc tính cấp Algal Omega -3 47 2.5.10.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 47 2.5.11 Nghiên cứu hiệu lực chế phẩm Algal Omega- 49 2.5.11.1 Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn mê lộ 49 2.5.11.2 Nghiên cứu mơ hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện 49 2.5.11.3 Nghiên cứu mơ hình gây suy giảm lực tâm thần kinh 51 2.5.12 Nghiên cứu sử dụng sinh khối tảo S mangrovei PQ6 làm giàu luân 51 trùng (Brachionus plicatilis) Artemia 2.5.12.1 Xác định lượng tảo thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng Artemia 51 2.5.12.2 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, khơ chất cường hố Golden Power việc làm giàu Artemia 52 2.5.12.3 So sánh việc sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì vi tảo biển quang tự dưỡng 52 2.5.12.4 Sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) 53 2.5.12.5 Nghiên cứu sử dụng sinh khối S mangrovei PQ6 làm giàu Artemia 56 làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 2.6 Xử lý số liệu 57 vi Chƣơng III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm sinh học đại diện thuộc chi vi tảo biển 58 58 Schizochytrium 3.1.1 Phân lập chủng Schizochytrium spp từ mẫu thu thập 58 vùng rừng ngập mặn Việt Nam 3.1.2 Tuyển chọn số chủng thuộc chi Schizochytrium tiềm cho việc sản xuất DHA 59 3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng thuộc chi 61 Schizochytrium tiềm 3.1.3.1 Một số đặc điểm hình thái điển hình 61 3.1.3.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng tiềm 63 3.1.3.3 Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số DHA chủng tiềm 68 3.1.3.4 Bảo quản giống 70 3.1.4 Phân loại chủng tiềm 72 3.1.4.1 So sánh số đặc điểm hình thái chủng tuyển chọn với số 72 lồi đại diện thuộc chi Schizochytrium 3.1.4.2 Phân tích trình tự nucleotide đoạn gen mã hóa 18S rRNA 74 3.2 Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 hệ thống lên men 79 3.2.1 Sinh trưởng chủng PQ6 bình lên men 10 lít 79 3.2.2 Sinh trưởng chủng PQ6 bình lên men 30 lít tự tạo 83 3.2.3 Xây dựng quy trình ni trồng chủng PQ6 bình lên men 30 lít tự tạo 87 3.2.4 Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu 89 3.3 Bƣớc đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 sản xuất viên thực phẩm chức nuôi trồng thủy sản 90 vii 3.3.1 Sản xuất viên Algal Omega- từ sinh khối khô chủng PQ6 90 3.3.1.1 Quy trình tạo viên Algal Omega-3 90 3.3.1.2 Nghiên cứu tính an tồn hiệu lực viên Algal Omega-3 (AO-3) 93 3.3.2 Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 nuôi trồng thủy sản 102 3.3.2.1 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia luân trùng 102 (Brachionus plicatilis) 3.3.2.2 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức 117 ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775) 3.3.2.3 Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng 119 Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790) Chƣơng IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 121 4.1 Đặc điểm sinh học chủng Schizochytrium phân lập 121 4.2 Nuôi trồng chủng tiềm PQ6 hệ thống lên men 127 4.3 Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức nuôi trồng thủy sản 135 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CĨ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 143 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ Tiếng Việt AA Arachidonic acid (C20:4-6) Axít arachidonic AO-3 Algal Omega- Algal Omega- ALT Alanine aminotransferase Alanine aminotransferase AST Aspartate aminotransferase Aspartate aminotransferase ASTM American Society for Testing and Hiệp hội vật liệu thử nghiệm Hoa Materials Kỳ CCT Chuột cống trắng Chuột cống trắng CNT Chuột nhắt trắng Chuột nhắt trắng DHA Docosahexaenoic acid (C22:6-3) Axít docosahexaenoic DNA Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic DO Dissolved oxygen Oxy hòa tan DPA Docosapentaeoic acid (C22:5-6) Axít docosapentaeoic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn E.coli EPA Eicosapentaenoic acid (C20:5-3) Axít eicosapentaenoic FAME Fatty acid methyl ester Các axít béo dạng methyl ester GPYc Glucose-Polypepton- Yeast Môi trường phân lập Schizochytrium extract- chloramphenicol gồm glucose-polypepton- cao nấm men- chloramphenicol IPTG isopropylthio-β-galactoside isopropylthio-β-galactoside KLCT Khối lượng thể Khối lượng thể KLK Khối lượng khô Khối lượng khô .. .VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hồng Thị Lan Anh NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI. .. chi Schizochytrium mới, hứa hẹn mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống người Chính vậy, chúng tơi thực đề tài: Nghiên cứu số đặc điểm sinh học khả ứng dụng chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium. .. tảo biển có nguồn gốc từ Vi t Nam; Có dẫn liệu khoa học đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa số lồi /chủng tiềm thuộc chi Schizochytrium phân lập; Chứng minh khả ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium