Header Page of 128 Xây dựng phương pháp định lượng số hoạt chất kháng HIV thuốc phương pháp Điện di mao quản Nguyễn Thị Thùy Linh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chun ngành: Hóa Phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Giới thiệu thuốc điều trị (virus gây suy giảm miễn dịch người) HIV; tình hình sử dụng thuốc HIV Việt Nam giới nay; phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV; Giới thiệu chung phương pháp điện di mao quản Nghiên cứu tài liệu (điện di mao quản) CE đặc tính lý hóa hoạt chất cần phân tích Khảo sát điều kiện điện di nhằm tìm điều tối ưu để tách định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin Nevirapin chế phẩm viên nén Tiến hành kiểm tra chất lượng thuốc có hoạt chất sử dụng thị trường Keywords: Hóa phân tích; Định lượng thuốc; Phương pháp điện di mao quản Content MỞ ĐẦU Theo phân tích chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV tiếp tục trì sống ngày tăng cao hệ hai tác động chủ yếu Một số người nhiễm HIV hàng năm toàn cầu mức cao Chỉ tính riêng năm 2008, giới có khoảng 2,7 triệu người nhiễm HIV Hai kết tích cực liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sống cho người bệnh Đến tháng 12/2008 ước tính khoảng triệu người nhiễm HIV nước có thu nhập thấp trung bình điều trị thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần vòng năm Trong vòng năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết AIDS giảm 10% [12] luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 HIV/AIDS vấn đề lớn giới Việt Nam Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS (Sau Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, ) Chúng ta không ngăn chặn lây lan bệnh mà điều trị hiệu để giảm nguy tử vong kéo dài cải thiện chất lượng sống cho người HIV/AIDS Trong điều trị kháng Retrovirut đóng vai trò lớn Trước nước ta chưa đầy đủ loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa phối hợp hai loại thuốc điều trị HIV/AIDS Giờ kết hợp loại thuốc trường hợp lâm sàng nặng Hiện nay, nước ta sản xuất thuốc chống HIV Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg) Tuy nhiên phần lớn sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia cấp [12] Để đảm bảo điều trị, an toàn sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV cần thiết Vì cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV Cho tới sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích hóa lý đa số sử dụng để định lượng loại thuốc Ưu điểm phương pháp độ lặp lại, độ xác khả tách tốt Đồng thời thiết bị HPLC tích hợp với hầu hết kỹ thuật hóa lý có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy hạ thấp giới hạn phát phương pháp Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung mơi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây nhiễm mơi trường Đó xuất phát điểm việc lựa chọn phát triển phương pháp định lượng thuốc dựa kỹ thuật hóa lý khác thay cho HPLC mà thực nghiên cứu Kỹ thuật tách mà lựa chọn làm sở cho nghiên cứu điện di mao quản (CE) [15] CE phương pháp phát triển, nhiên có nhiều ưu điểm vượt trội hiệu lực tách cao, kinh tế đặc biệt thời gian phân tích nhanh đáp ứng khơng cho phân tích phòng thí nghiệm mà phục vụ cho phân tích lâm sàng sản xuất Vì kỹ thuật hữu hiệu để thay hay hỗ trợ HPLC nhiều lĩnh vực phân tích, có nghiên cứu Dược Hơn nữa, chuyên luận chung CE quy định Dược điển số nước Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên Việt Nam, CE chưa ứng dụng nhiều kinh luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 nghiệm ứng dụng phân tích dược phẩm hạn chế Do chúng tơi nhận định hướng nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc nước ta Từ phân tích trên, tiến hành nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng số hoạt chất kháng HIV thuốc phương pháp điện di mao quản” CHƢƠNG - TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu thuốc điều trị HIV Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin Nevirapin điều trị Lamivudin Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm HIV-1 HIV-2 ức chế enzym phiên mã ngược virus Hai thuốc sử dụng phối hợp liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine tháng cho kết khả quan Các số đánh giá tình trạng bệnh nhân cải thiện rõ rệt có ý nghĩa thống kê Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm3 lên 1547/mm3 ), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm3 lên 145/mm3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP khống chế phát triển virus Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót người bệnh có số lượng tế bào CD4 500 1mm3 Liệu pháp dùng cho người bệnh có mật độ virus HIV 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, mật độ HIV yếu tố tiên lượng tiến triển bệnh [12] * Lamivudin: (3TC) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 Công thức phân tử: C8H11N3O3 S Phân tử lượng 229,3 Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 1600-1620C Dễ tan nước, tan cồn, khó tan dung môi hữu Năng suất quay cực: [α]21D = - 1350 ( C = 0,38 % methanol ) Hằng số pKa= 3,31 Lamivudin hấp thụ UV bước sóng hấp thụ cực đại 278nm; A1%1cm H+ 1M ~ 600 *Zidovudin: (AZT) Công thức phân tử C10H13N5O4 Phân tử lượng 267.242 g/mol Tên khoa học: 1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Tính chất : Tinh thể trắng nâu Nhiệt độ nóng chảy: ~ 1240C Khó tan nước, tan cồn Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% EtOH) ; + 99 (C = 0,5% nước) Hằng số pKa= 9,36 *Nevirapin (NVP) Công thức phân tử C15H14N4O Phân tử lượng 266.888 g/mol Tên khoa học: luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6-one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng gần trắng Thực tế khơng tan nước, tan CH3Cl Năng suất quay cực + 60,50 → + 63,00 ( C = 1% EtOH) ; + 990 (C = 0,5% nước) Hằng số pKa= 2,42 1.2 Tình hình sử dụng thuốc HIV Việt Nam giới Tính đến 31/5/2012, tồn quốc có 66.191 người nhiễm HIV có 62.654 người lớn 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012 Kết báo cáo 10 tỉnh có số người điều trị cao 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV điều trị tồn quốc Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục thành phố dẫn đầu nước số lượng người nhiễm HIV điều trị Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân điều trị toàn quốc[10] Kể từ ca nhiễm HIV phát Mỹ từ năm 1981, lồi người trải qua 30 năm đối phó với đại dịch quy mơ lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV nhóm tuổi 15-49 0,8% Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm HIV 1,8 triệu người tử vong AIDS So sánh với năm 1999, số người nhiễm HIV giảm 21% Báo cáo UNAIDS ghi nhận tính cuối năm 2009 có 33 nước có số ca nhiễm giảm, 22 nước khu vực cận Saharan, Châu Phi Tuy nhiên nước tỷ lệ nhiễm tăng 25% so sánh năm 1999 2009[11] 1.3 Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV 1.3.1 Các phƣơng pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong năm gần đây, phương pháp HPLC đóng vai trò vơ quan trọng việc tách phân tích chất lĩnh vực khác nhau, việc tách phân tích lượng vết chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo sử dụng rộng rãi để xác định thuốc HIV loại mẫu khác có nhiều ưu so với phương pháp khác có độ xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối máy HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Hiện có nhiều loại detector sử dụng cho mục đích mở rộng khả phân tích nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng, detector khối luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 phổ (MS) lựa chọn ưu tiên phát phân tích chất đối tượng phức tạp Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động 20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh acid photphoric Pha tĩnh Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm) Thời gian lưu chất Stavudine 2,85 phút, Lamivudine 4,33 phút Nevirapine 8,39 phút.[26] Xác định Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao với dung môi pha động chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh mỏng Silicagen 60F254 định lượng chất bước song hấp thụ 265nm Hệ số lưu giữ Stavudine, Lamivudine Nevirapine 0.21-0.27, 0.62-0.72 0.82-0.93.[26] Xác định thuốc HIV huyết tương phương pháp LC-MS/MS với metaxalone chất chuẩn nội với giai đoạn Chiết pha rắn, sau sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động 0.5% acetic băng nước : axetolnitril (20:80,v/v) Các ion tách theo dõi máy phổ khối tứ cực.[21] 1.3.2 Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE sử dụng rộng rãi tính chất ưu việt hiệu tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn Phương pháp ứng dụng để tách xác định thuốc HIV nhiều đối tượng mẫu khác Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) Nevirapin (NVP) phương pháp MEKC Tác giả sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính 75µm Dung dịch điện li bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) 15%(v/v) 2-propanol Áp 20kV.Bơm mẫu áp suất 50mbar 9s Tất chất tách vòng 14 phút Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r2= 0,9996) cho 3TC; 5-50 µg/ml (r2= 0,9985) cho d4T 25-250 µg/ml (r2= 0,9987) cho NVP[24] Nhóm nghiên cứu tách lamivudin tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện 15 kV, bước sóng phát 270 nm… Về định lượng lamivudin chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) diện chất hoạt động bề mặt SDS (sodium dodecyl sulfat) luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 phân tích đồng thời lamivudin chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu 39,5 cm, nhiệt độ cột 250C, điện 15 kV, bước sóng phát 270 nm, dung dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9] Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách định lượng đồng thời lamivudine zidovudine dược phẩm phát triển Các yếu tố ảnh hưởng đến tách, chẳng hạn pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu điện áp áp dụng tối ưu hóa Dung dịch điện ly bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium 15 mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile (ACN) khảo sát phù hợp cho việc tách loại thuốc p-aminobenzoic acid (PABA) sử dụng chất chuẩn nội (IS) Phát chất phân tích IS thực bước sóng 210 nm Điện di đồ quan sát thấy hai loại thuốc IS di chuyển vòng 20 phút điện áp 10 kV Đánh giá phương pháp thực tính xác, độ tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát (LOD) định lượng (LOQ) Khoảng tuyến tính từ 10-80 mg / ml cho Lamivudine 10-100 mg / ml cho Zidovudine Các giới hạn phát cho Lamivudine Zidovudine tìm thấy 2,5 2,0 mg / ml, tương ứng Phương pháp áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine Zidovudine huyết tương Độ thu hồi hai thuốc dạng bào chế viên thuốc huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25] CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 ĐIỀU KIỆN NGHIÊN CỨU 2.1.1.1 Các chất chuẩn đối chiếu - Chuẩn quốc gia Lamivudine (200mg/ lọ) hàm lượng 99,45 % C8H11N3 O3S tính theo nguyên trạng, SKS 031214603, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 - Chuẩn quốc gia Zidovudin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,64 % C10H13N5 O4 (HPLC) tính theo nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản nhiệt độ 50C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế - Chuẩn quốc gia Nevirapin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,49 % C15H14N 4O tính theo nguyên trạng, SKS WS 0109263, bảo quản nhiệt độ 20C – 80C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế 2.1.1.2 Hóa chất: - Nước cất deion: nước cất hai lần mới, lọc qua lọc tinh khiết có cột trao đổi anion cation, sau lọc qua màng lọc 0,2µm - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7 10H2O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH2 PO4.2H2O, Na2HPO4… hãng MERCK KGaA Germany 2.1.1.3 Thiết bị dụng cụ - Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 điều khiển phần mềm Chemstation 100001 (sản xuất hãng Hewlett Packard, Đức) mơn Hóa phân tích- Độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội - Máy lọc nước tinh khiết Sartorius arium 611: model SARTORIUS AG GOTYINGEN, áp suất tối đa 100psi/ 6,9bar - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H ( sản xuất hãng Elma, Đức) - Máy đo pH EUTECH Instrument - Cân phân tích Sartorius TE214S - Giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm- Trung Quốc - Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm - Bộ lọc hút chân khơng màng lọc cenlulose với kích thước lỗ lọc 0,45 µm - Các dụng cụ xác: bình định mức, pipet xác với thể tích khác - Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày cối 2.1.2 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.2.1 Chế phẩm làm việc - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg, Nevirapine 200mg & Zidovudine 300mg công ty Ranbaxy laboratories Limited Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 9/ 2013 luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page of 128 - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg công ty Matrix Laboratories Limited Ấn Độ sản xuất Ngày sản xuất 9/2011 Hạn sử dụng 10/2013 2.1.2.2 Chuẩn bị mẫu * Pha dung dịch chuẩn dung dịch thử: - Dung dịch gốc chuẩn: cân xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin 59,6 mg Zidovudin vào cốc có mỏ Thêm vào 10,0 ml MeOH hòa tan, sau thêm nước cất deion hòa tan Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước deion đến thể tích vừa đủ lắc - Dung dịch chuẩn: hút xác 5,0ml dung dịch gốc chuẩn pha vào bình định mức 10ml, thêm nước deion vừa đủ thể tích lắc Lọc qua màng lọc 0,2µm - Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình viên nghiền thành bột mịn Cân lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg Nevirapin 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm 70 ml nước deion siêu âm cho tan hết, thêm nước deion đến vừa đủ thể tích, lắc Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm Bỏ 20 ml dịch lọc đầu Dịch lọc tiếp tục lọc qua lọc hút chân không màng lọc 0,45µm Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu Dịch lọc lọc qua màng lọc 0,2µm trước tiêm vào lọ đựng mẫu -Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị mẫu chuẩn khơng có chất phân tích *Chuẩn bị dung dịch điện ly nền: - Dung dịch điện ly Na2B4O7 10mM: Cân xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm hòa tan hồn tồn Điều chỉnh nước tới vạch lắc - Dung dịch điện ly Na2B4O7 10mM + SDS 50mM : Cân xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 0,7210 g SDS vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí hòa tan hồn tồn Điều chỉnh nước tới vạch lắc Dung dịch điện ly điều chỉnh pH đến pH 8,5 ; pH 9,2 pH 10 - Dung dịch điện ly Na2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM: Cân xác khoảng 0,1906 g Na2B4O7 0,4820g β-cyclodextrin vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí hòa tan hồn tồn Điều chỉnh nước tới vạch lắc 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page of 128 Header Page 10 of 128 2.2.1 Nội dung nghiên cứu Tham khảo nghiên cứu tài liệu CE đặc tính lý hóa hoạt chất cần phân tích Trên sở khảo sát điều kiện điện di nhằm tìm điều tối ưu để tách định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin Nevirapin chế phẩm viên nén Từ phương pháp xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng thuốc có hoạt chất sử dụng thị trường 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu Hai kỹ thuật lựa chọn CZE, MEKC xem kiểu điện di tách tốt hoạt chất Sau tiến hành khảo sát điều kiện để chọn chương trình điện di thích hợp, cụ thể là: - Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp - Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách hoạt chất định lượng đồng thời như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ… - Đánh giá thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích số mẫu thuốc - Đánh giá ưu khuyết điểm phương pháp CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC, AZT NVP 3.1.1 Chọn bƣớc sóng phát chất Để khảo sát phổ 3TC,AZT NVP, detector chọn DAD Do hoạt chất hợp chất khơng có mầu, hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại nên sử dụng máy điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ 190 – 400 nm để xác định bước sóng hấp thụ tối ưu chất Các chất pha với nồng độ 120µg/ml 10 mM đệm Borat, 50 mM SDS, pH=9,3 Phổ thu thể hình 3.1 Kết quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao 270,5nm, Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao 264,5nm Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao 268,5nm.Chúng tơi chọn bước sóng hấp thụ cực đại cho chất phép định luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 10 of 128 Header Page 11 of 128 lượng kết xác Detector sử dụng máy điện di detector DAD hãng HP 3.1.2 Mao quản xử lý mao quản Để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tơi sử dụng nghiên cứu có đường kính 75 µm Thời điểm bắt đầu : rửa nước deion phút, dung dịch NaOH 1M 10 phút , dung dịch NaOH 0,1 M phút rửa lại nước deion 10 phút (tất dung dịch trước chạy lọc qua màng lọc 0,2µm) Giữa lần chạy: phút nước cất deion- phút NaOH 0,1 M – phút nước cất deion– phút dung dịch đệm Thời điểm kết thúc: rửa nước cất deion phút, dung dịch NaOH 0,1M phút, nước cất deion 10 phút 3.1.3 Chọn phƣơng pháp bơm mẫu Phương pháp bơm mẫu áp suất dùng áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu tạo chân không phía đầu mao quản thời gian định Do lực áp suất đẩy hút mà lượng mẫu bơm vào đầu mao quản Áp suất hay dùng từ 50 – 300 mbar Mẫu bơm vào có nồng độ giống với nồng độ chất tan mẫu phân tích Trong phương pháp chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất 50 mbar cách bơm mẫu dùng suốt q trình thí nghiệm 3.1.4 Độ điện di độ điện di hiệu dụng Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò quan trọng, định đến độ phân giải trình tách Các hạt Mixen hình thành dung dịch điện di đóng vai trò pha tĩnh giả Trong nghiên cứu này, sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức Mixen hình thành phân tử SDS 3.1.5 Lựa chọn chế tách Tiến hành chạy điện di hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ Lamivudin 150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml Zidovudin 300 µg/ml loại dung dịch điện li dung dịch Na2B4O7 10mM; Na2B4O7 10mM + SDS 50mM ; Na 2B4O7 10mM + β-cyclodextrin 10mM Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 11 of 128 Header Page 12 of 128 Nhận thấy dùng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) khơng tách chất khỏi Vì pKa Lamivudin (pKa= 3,31 ) Nevirapin (pKa= 2,42) gần Trong dung dịch điện ly với khoảng pH định chất bị ion hóa giống nhau, chất khỏi mao quản thời điểm nên điện di đồ xuất pic mà Thêm vào dung dịch điện li Na2 B4O7 10mM chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm (SDS) độ phân giải chất tăng rõ rệt Cả chất tách rõ ràng điện di đồ Vì chất có phân bố vào Pha tĩnh giả SDS khác nên tách khỏi Như hoạt chất tách theo chế MEKC Còn thêm vào dung dịch điện li Na2B4O7 10mM chất chọn lọc đối quang β- CD điện di đồ xuất pic có nghĩa yếu tố không gian chất không ảnh hưởng tới trình tách Chất hoạt động bề mặt β- CD không lựa chọn Chọn phương pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt SDS khảo sát lại cho hoạt chất 3.1.6 Ảnh hƣởng pH dung dịch điện li Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di khảo sát với dung dịch điện di với giá trị pH thay đổi pH = 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17 Từ hình 3.3, pH =8,76 đến 9,06 chất tách tốt, thời gian phân tích dài hơn, đường dốc Nhận thấy tăng pH từ 9,62 đến 10,17 khả tách tốt hơn, pic nhọn hơn, ảnh hưởng có hấp thụ UV chất phân tích hấp thụ UV giảm dẫn đến diện tích pic giảm Ở pH= 9,30 chất tách tốt, độ hấp thụ tốt, giảm hấp thụ đường thời gian phân tích hợp lý.Vì chúng tơi chọn pH= 9,30 cho nghiên cứu 3.1.7 Ảnh hƣởng thành phần dung dịch đệm Cùng với pH dung dịch đệm, chất điện ly pha động có vai trò quan trọng phải có nồng độ phù hợp Thực nghiệm nhận thấy, chạy điện di dung dịch điện li Na2HPO4 10mM Natricitrat 10mM chưa xuất pic trước thời gian 15 phút, mặt khác cường độ dòng điện khơng ổn định Vì định chọn dung dịch điện li Natritetraborat cho khảo sát 3.1.8 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ chất tạo mixen SDS luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 12 of 128 Header Page 13 of 128 Chất hoạt động bề mặt SDS xem pha tĩnh giả trình tách thực chất chuyển động với dòng điện di Nồng độ SDS dung dịch đệm điện di có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng chất liên quan đến hình thành hạt Mixen nồng độ Mixen dung dịch đệm điện di Để khảo sát ảnh hưởng SDS đến trình điện di, nồng độ SDS bị thay đổi ba giá trị 25 mM; 50 mM 75 mM Tại nồng độ 75 mM nhận thấy thời gian phân tích dài so với nồng độ 50 mM 25 mM,chiều cao pic giảm Nồng độ SDS 25 mM hiệu tách tốt chiều cao pic không 50 mM, gây ảnh hưởng độ nhạy Vì chúng tơi chọn nồng độ SDS = 50 mM tối ưu để khảo sát thí nghiệm 3.1.9 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ đệm Cùng với pH dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) pha động có vai trò quan trọng phải có nồng độ phù hợp Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH đồng thời chất điện giải điện di Như vậy, pha động khơng phức tạp, khơng gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu tách Ở chọn Natri tetraborat vừa chất đệm pH vừa chất điện giải Chúng tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch điện ly Na2B4O7 bốn gía trị mM; 10 mM; 20 mM; 30 mM Nồng độ đệm mM, lực ion thấp hơn, giảm cường độ dòng điện I, tăng hấp phụ mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển chất tan nhanh chiều cao, diện tích pic giảm Còn nồng độ đệm 20mM độ phân giải tăng thời gian phân tích dài Do chúng tơi chọn nồng độ 10 mM đệm Borat điều kiện tối ưu 3.1.10 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu Chúng tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu ba gía trị 3s, 5s 7s Hình 3.6 thể mối quan hệ chiều cao pic thời gian bơm mẫu, tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên không đáng kể Trong điều kiện, tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu chất không thay đổi thay đổi ít, có chiều cao pic thay đổi Vì chúng tơi chọn thời gian bơm mẫu 5s điều kiện tối ưu 3.1.11 Khảo sát ảnh hƣởng điện di Khảo sát điện di ba gía trị 15 kV, 20 kV 22 kV Khi tăng điện từ 15kV đến 22kV, thời gian di chuyển chất giảm Tại 15kV 20kV đạt hiệu tách tốt, thời gian di chuyển cấc chất 15kV lớn gần 14 phút xuất pic chất thứ luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 13 of 128 Header Page 14 of 128 Với 22kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn so với 15kV, 20kV kết tách kém, độ phân giải pic thứ pic thứ không cao chiều cao pic thứ giảm Vì tăng V, dòng điện I lớn gây hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản gây doãng pic Tức làm giảm hiệu tách Vì chúng tơi chọn 20kV phù hợp 3.1.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ mao quản Sự khác nhiệt độ ảnh hưởng không lớn tới hiệu tách nên để bảo vệ cột hệ thống CE, làm mát Cột để Cột hệ thống điều nhiệt Cột Cột giữ ổn định nhiệt độ phòng 250C 3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu Bảng 3.1 Tổng kết điều kiện tối ưu Các yếu tố Điều kiện Detector DAD Số đo bước sóng chung Lamivudin 270nm, Zidovudine 264,5 nm Nevirapin 268,5nm Kích thước mao quản Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 60 cm, đường kính 75µm, loại bubble cell Chất tạo mixen SDS Phương pháp bơm mẫu Thủy động hoc : 5s; 50 mbar Thế điện di 20 kV Dung dịch điện ly Na2B4O7 10mM + SDS 50mM, pH = 9,30 Nhiệt độ 250C Hình 3.8 Điện di đồ 3TC, AZT, NVP điều kiện tối ưu 3.1.14 Định tính Lamivudin, Nevirapin Zidovudin điều kiện điện di thiết lập luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 14 of 128 Header Page 15 of 128 Chúng tơi định tính 3TC, NVP AZT theo phương pháp thêm chuẩn Tiến hành chạy điện di mẫu: chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP AZT;chuẩn hỗn hợp sau thêm chuẩn 3TC; chuẩn hỗn hợp sau thêm chuẩn NVP; chuẩn hỗn hợp sau thêm AZT Kết điện di đồ hình cho thấy pic di chuyển tới detector thứ có đáp ứng (diện tích pic) tăng vọt lên (từ 47,42 lên 83,28) thêm 3TC chuẩn nên chất di chuyển đến Detector sớm Lamivudin Tương tự chất di chuyển đến Detector thứ hai Zidovudin chất di chuyển đến Detector cuối Nevirapin 3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 3.2.1 Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống Tiêm lặp lại lần mẫu chuẩn Kết phân tích trình bày bảng 3.2 Nhận xét: kết thống kê cho thấy sau lần điện di thông số thời gian di chuyển diện tích pic có RSD < 2%, giá trị độ phân giải lớn 1,5 Vậy phương pháp đạt tính tương thích hệ thống ( Thẩm định phương pháp theo ICH) 3.2.2 Tính đặc hiệu Chúng tơi tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thử theo điều kiện điện di tối ưu( theo ICH) Kết thu hình bên Nhận xét: mẫu trắng khơng có pic trùng với pic chất phân tích Điện di đồ mẫu chuẩn mẫu thử giống Khi thêm chất chuẩn Lamivudin, Zidovudin Nevirapin vào mẫu thử diện tích pic tăng lên Vậy phương pháp có tính đặc hiệu 3.2.3 Khảo sát khoảng tuyến tính lập đƣờng chuẩn Chúng tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính điều kiện tối ưu mục 3.1.14 3TC, AZT NVP Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch chuẩn có chứa 3TC nồng độ từ 77,25 µg/ml đến 231,7µg/ml, NVP nồng độ từ 99,25 µg/ml đến 297,7 µg/ml AZT nồng độ từ 149,0 µg/ml đến 447,0 µg/ml , nồng độ đo lặp lại lần sau: Bảng 3.3: Diện tích pic điện di đồ nồng độ 3TC tương ứng Nồng độ (µg/ml) 77,25 123,6 154,5 169,95 185,4 231,7 Diện tích pic 29,85 47,60 62,10 70,70 78,76 97,80 (mAU.s) Phương trình hồi quy tuyến tính : S = (-6,10 ±5,79) + (0,449 ±0,036)C luan van thac si - luan van kinh te - khoa luan - tai lieu -Footer Page 15 of 128 Header Page 16 of 128 Hệ số tương quan : r = 0,996 Bảng 3.4 Diện tích pic điện di đồ nồng độ AZT tương ứng Nồng độ (µg/ml) 149,0 238,4 298,0 327,8 357,6 447,0 Diện tích pic (mAU.s) 57,4 94,8 120,6 138,7 149,4 186,5 Phương trình hồi quy tuyến tính : S = (-8,29 ±8,22) + (0,439 ±0,025)C Hệ số tương quan : r = 0,998 Bảng 3.5 Diện tích pic điện di đồ nồng độ NVP tương ứng Nồng độ (µg/ml) 99,25 158,8 198,5 218,3 238,2 297,7 Diện tích pic 58,6 93,7 119,48 136,7 148,6 188,4 (mAU.s) Phương trình hồi quy tuyến tính : S= (-9,05 ±8,36) + (0,661 ±0,039)C Hệ số tương quan : r = 0,998 3.2.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) Bảng 3.6.Giới hạn phát hiện(LOD) giới hạn định lượng (LOQ) đường chuẩn Chất Phương trình đường phân chuẩn Hệ số góc (b) Độ lệch LOD LOQ chuẩn (Sy) (µg/ml) (µg/ml) tích 3TC S= -6,10 +0,449.C 0,449 1,50 10.02 33,41 AZT S= -8,29 + 0,439.C 0,439 2,13 14,55 48,52 NVP S= -9,05 + 0,661.C 0,661 2,17 9,85 32,83 3.2.5 Độ lặp lại phƣơng pháp Một phương pháp phân tích tốt ngồi việc có sai số nhỏ u cầu có độ lặp lại cao Để đánh giá độ lặp lại phương pháp, tiến hành khảo sát độ lặp lại nồng độ 3TC (77,25; 154,5 231,7 µg/ml), AZT (149; 298,0 447 µg/ml), NVP (99,25; 198,5 297,7 µg/ml) Mỗi mức nồng độ tiến hành với mẫu độc lập Nhận xét: Từ bảng kết cho thấy mức nồng độ thấp, trung bình cao khoảng nồng độ tuyến tính Lamivudin, Zidovudin Nevirapin có RSD