ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ******** BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu điều chế thử tác dụng hạ đường huyết cao dược liệu Mướp đắng, Râu mèo Mắc cỡ” CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS DƯƠNG THỊ MỘNG NGỌC CƠ QUAN QUẢN LÝ: SỞ KHOA HỌC& CÔNG NGHỆ TP.HCM CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM SÂM & DƯỢC LIỆU TP.HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 6/2016 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Bệnh đái tháo đường bệnh mạn tính có xu hướng gia tăng tồn giới, hậu biến chứng thường nặng nề, để lại cho gia đình người bệnh gánh nặng chi phí, đồng thời ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sống đặc biệt hàng năm giới nguồn lao động đáng kể giảm 510 năm tuổi thọ Theo thống kê Tổ chức y tế giới (WHO), chi phí việc khám, điều trị phòng chống bệnh đái tháo đường lớn, khoảng 232-430 tỷ USD/năm Hiện nay, để điều trị bệnh đái tháo đường, dược phẩm tây y thường để lại tác dụng phụ đáng kể ảnh hưởng đến thể trạng chung cho người bệnh, đặc biệt gây tổn hại gan thận, quan lọc chất độc cho thể Chính thế, xu hướng trở với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc từ thảo dược giới Việt Nam ngày tăng Theo kinh nghiêm dân gian, Việt Nam có nhiều thuốc điều trị bệnh đái tháo đường hiệu quả, số có thuốc từ dược liệu Râu mèo, dây non Mướp đắng Mắc cỡ lương y Đinh Bá Luyện, nhiên, tác dụng chống đái tháo đường điều trị theo kinh nghiệm sử dụng dạng thuốc thang Chính thế, việc đại hóa thuốc để thành dược phẩm an toàn hiệu cần phải nghiên cứu cách khoa học thực nghiệm tiền lâm sàng vấn đề cần thiết hồn tồn phù hợp với “Chương trình mục tiêu quốc gia phòng, chống bệnh đái tháo đường” mà nhà nước Việt Nam thực Dựa vào tính cấp thiết nêu trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế thử nghiệm tác dụng hạ đường huyết cao dược liệu từ Râu mèo, Mướp đắng Mắc cỡ” thực Báo cáo trình bày kết nghiên cứu thời gian từ tháng 6/ 2014-6/2016 với nội dung là: Nội dung 1:Nghiên cứu công thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi cơng nghệ, có hiệu kinh tế có tác dụng dược lý hạ đường huyết Nôi dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tính an tồn có tác dụng dược lý tốt Các kết thu sau: I Nội dung 1:Nghiên cứu cơng thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi cơng nghệ, có hiệu kinh tế có tác dụng dược lý hạ đường huyết Đã kiểm định chất lượng nguồn nguyên liệu có chuyên luận Dược điển Việt Nam IV Râu mèo xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn sở nguyên liệu chưa có chuyên luận Dược Điển Việt Nam IV Mướp đắng Mắc cỡ Đã nghiên cứu quy trình chiết xuất với dung môi khác nhau: cồn nước thu sản phẩm sau: - Cao chiết cồn hỗn hợp dược liệu (ký hiệu Cao HHA) - Cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (Ký hiệu Cao HHB) - Cao chiết cồn Mắc cỡ (ký hiệu Cao PUD) - Cao chiết cồn Mướp đắng (ký hiệu Cao CHA) - Cao chiết cồn Râu mèo (ký hiệu Cao STA) Đã khảo sát độc tính cấp mẫu cao dược liệu: - Đã xác định liều LD50 cao cồn Mướp đắng qua đường uống LD50= 26,29 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng - Đã xác định liều LD0 cao cồn Râu mèo qua đường uống LD0= 20 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng - Đã xác định liều Dmax cao cồn Mắc cỡ qua đường uống Dmax= 44,4 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng - Đã xác định liều LD0 cao cồn hỗn hợp dược liệu qua đường uống LD0= 38,64 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng - Đã xác định LD0 cao nước hỗn hợp dược liệu qua đường uống LD0= 16,45 g/kg thể trọng chuột nhắt trắng Đã khảo sát tác dụng hạ glucose huyết loại cao dược liệu - Mẫu cao cồn Mướp đắng (CHA) liều 0,9 g/kg thể trọng, cho chuột uống 10 ngày liên tục, có tác dụng làm giảm nồng độ glucose huyết 32,28% , đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý - Mẫucao Râu mèo (STA) liều 0,7g 1,4 g/ kg thể trọng, cho chuột uống 10 ngày liên tục, có tác dụng giảm glucose huyết với giá trị giảm II 25,81% 27,53%, đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý - Mẫu cao Mắc cỡ (PUD) với liều 0,5g/kg 1,0g/kg thể trọng, cho chuột uống 10 ngày liên tục, nồng độ glucose huyết giảm 46,48% 40,53%, đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng bệnh lý - Mẫu cao chiết cồn hỗn hợp dược liệu (HHA), liều 0,72g 1,44 g/ kg thể trọng, cho chuột uống 10 ngày liên tục, chưa thể tác dụng hạ glucose huyết mô hình chuột đái tháo đường gây streptozocin với liều 160 mg/kg thể trọng chuột - Mẫu cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (HHB) liều 1,44 g/kg thể trọng, cho chuột uống 10 ngày liên tục, nồng độ glucose huyết giảm 33,15%, đạt ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm chứng bệnh lý Nhận xét: Như vậy, nhóm tác giả hồn thành nội dung theo hợp đồng kết chọn đuợc công thức chế phẩm đảm bảo tính khả thi cơng nghệ chiết với dung mơi nước, kỹ thuật công ty dược phẩm sử dụng, có hiệu kinh tế đặc biệt có tác dụng dược lý hạ glucose huyết, với thành phần công thức sau: o Quả Mướp đắngkhô: 840 g o Râu mèokhô: 1660 g o Mắc cỡ khô: 1250 g Nôi dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tính an tồn có tác dụng dược lý tốt Đã chiết xuất mẫu cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (HHB2, HHB3) có cơng thức có tác dụng hạ đường huyết tốt theo quy trình chọn Đã xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (cao HHB) với số yêu cầu có chuyên luận Dược điển Việt Nam IV như: độ ẩm, độ tro nhóm nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn sở số tiêu định tính, định lượng III Đã khảo sát chất lượng mẫu chiết cao nước hỗn hợp dược liệu quy mơ phòng theo yêu cầu tiêu chuẩn sở xây dựng độ ẩm, định tính, định lượng, thử giới hạn nhiễm khuẩn Sau chọn đuợc công thức cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (cao HHB), có tác dụng hạ glucose huyết, nhóm nghiên cứu khảo sát mẫu cao chiết nước khác (cao HHB2 cao HHB3) tác dụng hạ đường huyết mơ hình gây tăng đường huyết thực nghiệm Kết thu mẫu cao chiết nước hỗn hợp dược liệu, có cơng thức, có tác dụng hạ đường huyết mơ hình gây tăng đường huyết thực nghiệm Đã theo dõi thay đổi mẫu cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (HHB) có tác dụng dược lý theo thời gian điều kiện tự nhiên 12 tháng, chất lượng khảo sát mặt định tính, định lượng năm khoảng cho phép theo tiêu chẩn sở mà nhóm xây dựng Các kết làm tiền đề cho việc khảo sát tính ổn định sản phẩm dạng viên nang, trà hay cốm từ cao chiết nước hỗn hợp dược liệutrong điều kiện tự nhiên IV MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU I MỤC LỤC V NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII DANH MỤC CÁC BẢNG X DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ XII PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tình hình bệnh đái tháo đường 1.2 Tổng quan dược liệu nghiên cứu 1.2.1 Cây Mướp đắng .8 1.2.2 Cây Râu mèo .11 1.2.3 Mắc cỡ 14 1.3 Tổng quan phương pháp gây ĐTĐ thực nghiệm 17 1.4 Tính cấp thiết cần nghiên cứu đề tài 18 1.5 Mục tiêu đề tài .19 CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu .20 2.1.1 Đặc điểm vi học 20 2.1.2 Khảo sát độ tinh khiết 21 2.1.3 Định tính 24 2.1.4 Định lượng 28 2.2 Chiết cao dược liệu 35 2.2.1 Cao chiết cồn dược liệu riêng rẽ (Quả Mướp đắng, Râu mèo, Mắc cỡ) hỗn hợp dược liệu 35 2.2.2 Cao chiết nước dược liệu phối trộn (Quả Mướp đắng, Râu mèo, Mắc cỡ) 38 2.3 Tiêu chuẩn hóa cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (cao HHB) 39 2.3.1 Xác định độ ẩm 39 2.3.2 Độ tro toàn phần 39 2.3.3 Định tính 39 2.3.4 Định lượng 43 2.4 Thử nghiệm dược lý 45 V 2.5 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 47 2.6 Theo dõi độ ổn định cao hỗn hợp dược liệu chiết nước HHB 47 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .49 3.1 Nội dung 49 3.1.1 Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu 49 3.1.2 Kết chiết xuất loại cao dược liệu 80 3.1.3 Kết thử nghiệm dược lý 82 3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tính an tồn có tác dụng dược lý tốt 94 3.2.1 Chiết xuất mẫu cao nước hỗn hợp dược liệu có cơng thức có tác dụng hạ đường huyết tốt theo quy trình chọn 94 3.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao dược liệu có tác dụng dược lý cao HHB 96 3.2.3 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 108 3.2.4 Khảo sát mẫu cao hỗn hợp dược liệu chiết nước HHB, HHB2, HHB3 108 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 114 4.1 Kết luận 114 4.2 Đề nghị .116 TÀI LIỆU THAM KHẢO TK VI NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường dd dung dịch đđ đậm đặc TP toàn phần TT thuốc thử SKLM sắc ký lớp mỏng MeOH methanol EtOAc ethyl acetat CHCl3 cloroform HCl acid chlohydric H2SO4 acid sulfuric DĐVN Dược Điển Việt Nam TCCS Tiêu chuẩn sở HHA Cao chiết cồn hỗn hợp dược liệu HHB Cao chiết nước hỗn hợp dược liệu CHA Cao chiết cồn Mướp đắng STA Cao chiết cồn Râu mèo PUD Cao chiết cồn Mắc cỡ HHA Cao chiết cồn hỗn hợp dược liệu HHB Cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (mẫu 1) HHB2 Cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (mẫu 2) HHB3 Cao chiết nước hỗn hợp dược liệu (mẫu 3) VII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Quả hạt Mướp đắng tươi 49 Hình Đặc điểm giải phẫu Mướp đắng xem vật kính 40X 50 Hình Thành phần bột Mướp đắng xem vật kính 40X 50 Hình Sắc ký đồ kiểm tra charantin nguyên liệu 52 Hình Sắc ký đồ mẫu trắng .53 Hình Sắc ký đồ mẫu chuẩn 53 Hình Sắc ký đồ mẫu thử 53 Hình Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn .54 Hình Đường biểu diển quan hệ tuyến tính diện tích peak nồng độ 55 Hình 10 Cây Râu mèo 58 Hình 11 Toàn vi phẫucủa Râu mèo .59 Hình 12 Đặc điểm vi phẫu Râu mèo 60 Hình 13 Tồn vi phẫu cuống Râu mèo 61 Hình 14 Đặc điểm vi phẫu cuống Râu mèo 61 Hình 15 Các cấu tử bột dược liệu Râu mèo .62 Hình 16 Sắc ký đồ nguyên liệu so với dược liệu đối chiếu 64 Hình 17 Sắc ký đồ diện sinensetin nguyên liệu Râu mèo 66 Hình 18 Sắc ký đồ diện acid oleanolic nguyên liệu 66 Hình 19 Sắc ký đồ mẫu trắng 67 Hình 20 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 67 Hình 21 Sắc ký đồ mẫu thử 68 Hình 22 Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn sinensetin .68 Hình 23 Đường biểu diển quan hệ tuyến tính diện tích peak nồng độ 69 Hình 24 Vi phẫu Mắc cỡ 72 Hình 25 Các cấu tử bột dược liệu Mắc cỡ 73 Hình 26 Sắc ký đồ nguyên liệu so với dược liệu đối chiếu .75 Hình 27 Sắc ký đồ mẫu trắng 75 Hình 28 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 76 Hình 29 Sắc ký đồ mẫu thử 76 VIII Hình 30 Sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn .76 Hình 31 Đường biểu diển quan hệ tuyến tính diện tích peak nồng độ 78 Hình 32 Tác dụng hạ glucose huyết cao cồn Mướp đắng 87 Hình 33.Tác dụng hạ glucose huyết cao cồn Râu mèo 89 Hình 34.Tác dụng hạ glucose huyết cao cồn Mắc cỡ 90 Hình 35 Tác dụng hạ glucose huyết cao cồn hỗn hợp dược liệu HHA .91 Hình 36 Nồng độ glucose huyết (mmol/ L) sau TN 92 Hình 37 Sắc ký đồ diện Mướp đắng cao HHB 97 Hình 38 Sắc ký đồ diện Mướp đắng cao HHB 97 Hình 39 Sắc ký đồ diện Mướp đắng cao HHB 98 Hình 40 Sắc ký đồ diện Râu mèo cao HHB 98 Hình 41 Sắc ký đồ diện Râu mèo cao HHB 99 Hình 42 Sắc ký đồ diện Râu mèo cao HHB 99 Hình 43 Sắc ký đồ diện Mắc cỡ cao HHB 100 Hình 44 Sắc ký đồ diện Mắc cỡ cao HHB 100 Hình 45 Sắc ký đồ diện Mắc cỡ cao HHB 101 Hình 46 Sắc ký đồ diện sinensetin cao HHB 102 Hình 47 Sắc ký đồ diện sinensetin cao HHB 102 Hình 48 Sắc ký đồ diện sinensetin cao HHB 103 Hình 49 Sắc ký đồ diện charantin cao HHB .104 Hình 50 Sắc ký đồ diện charantin cao HHB .104 Hình 51 Sắc ký đồ diện charantin cao HHB .105 Hình 52 Sắc ký đồ mẫu chuẩn 106 Hình 53 Sắc ký đồ charantin cao 106 Hình 54 Sắc ký đồ mẫu sinensetin chuẩn 107 Hình 55 Sắc ký đồ sinensetin cao HHB 107 IX 3.2.3 Thử giới hạn nhiễm khuẩn Kết thử giới hạn nhiễm khuẩn mẫu cao HHB trình bày bảng 47 Bảng 47 Kết thử giới hạn nhiễm khuẩn mẫu cao HHB Giới hạn phải đạt Kết Kết luận