SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CƠ BẢN VÀ SỬ DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÂN LOẠI ĐẾN LỒI CỦA CHỦNG VI KHUẨN TÍA QUANG HỢP CĨ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ACID BÉO KHÔNG NO (DẠNG OMEGA 6,7,9) Sinh viên thực : Trần Thị Diệp Lớp : 1302 Giáo viên hướng dẫn : TS Hoàng Thị Yến Hà Nội – 2017 SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Thị Yến cán Phòng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi dạy bảo em thời gian em thực hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Bùi Văn Ngọc – Nhóm trưởng cụm gen trực thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen chị Trần Thị Thu Quỳnh, chị Trịnh Thị Thùy Linh cán kỹ thuật viên Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen, tận tình bảo, giúp đỡ, cho em ý kiến đóng góp bổ ích cơng việc sống Em trân trọng tình cảm giúp đỡ quý báu Bên cạnh em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện giới thiệu em làm khóa luận tốt nghiệp Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học Cuối em xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên khuyến khích giúp đỡ em thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên thực Trần Thị Diệp SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TÓM TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài nghiên cứu 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lipid acid béo 2.1.1 Giới thiệu lipid 2.1.2 Giới thiệu acid béo 2.2 Vi khuẩn tía quang hợp 11 2.2.1 Định nghĩa 11 2.2.2 Phân loại vi khuẩn tía quang hợp 12 2.2.3 Đặc điểm sinh học VKTQH 13 3.1 Vật liệu 26 3.1.1 Hóa chất 26 3.1.2 Thiết bị máy móc 26 3.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.2 Các môi trường nghiên cứu 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 28 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy VKTQH: 28 3.3.2 Phương pháp đánh giá sinh trưởng VKTQH 28 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào 28 3.3.4 Phương pháp nghiên cứu hệ sắc tố VKTQH 29 SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến 3.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm dinh dưỡng carbon nitơ 29 3.3.6 Phương pháp xác định khả sử dụng muối cho sinh trưởng 29 3.3.7 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH ban đầu 30 3.3.8 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng oxy đến khả tổng hợp sắc tố quang hợp 30 3.3.9 Phương pháp xác định trình tự gen 16S- rRNA 30 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 Bảng 4.1 Khả sinh trưởng, tích lũy sinh khối, lipid tổng hợp acid béo không no chủng VK VTB.8 35 4.1 Kết nghiên cứu đặc điểm sinh học 36 4.1.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào 36 4.1.2 Đường cong sinh trưởng 37 4.1.3 Đặc điểm hệ sắc tố quang hợp 38 4.1.5 Đặc điểm dinh dưỡng carbon nitơ 40 4.1.6 Ảnh hưởng nồng độ muối cho sinh trưởng 42 4.1.7 Ảnh hưởng pH ban đầu 43 4.2 Xác định trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 55 SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AGL Axit linolenic-γ ATP Adenosine triphosphate ARN Ribonucleic acid C18:1 Oleic Bchl Bacteriochlorophyll DHA Docosahexaenoic acid DSMZ Douth samlung microoganisms zentrum ED Entner-Doudoroff OD Optical Density C16:0 Palmitic C18:0 Steric EMF Embden-Meyerhof EPA Eicosa Pentaenoic Acid GS Glutamine synthetase ICL Isocitrate lyase KDG 2-keto-3-deoxygluconate MUFAs Monounsaturated fatty acids OAA Oxaloaxetic PCR Polymerase chain reaction PEP Phosphat enol pyruvat PEPCK PEP – carboxykinase SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến PUFAs Polyunsaturated fatty acids RubisCo Ribulozo Biphosphate Carboxylase/Oxygenase Taq Thermus aquaticus VKQH Vi khuẩn quang hợp SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hồng Thị Yến TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, sử dụng chủng VKTQH lấy từ tập đoàn chủng giống VKTQH Phòng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học Chủng VKTQH lựa chọn (ký hiệu VTB.8) có khả sinh trưởng mạnh (tính theo ∆OD660: 1.534 ± 0.012; hàm lượng sinh khối khô: 0.821 ± 0.075), chứa hàm lượng lipid cao: 27.88 ± 3.227 % trọng lượng khơ đặc biệt có khả tổng hợp omega 6,7,9 Qua nghiên cứu đặc điểm sinh học bản, xác định khuẩn lạc chủng VTB.8 có hình dạng tròn, lồi, bề mặt xù xì, màu nâu đỏ, đường kính d = 1,5- mm Tế bào chủng có hình bầu dục, đường kính 0,7- 1,8 µm, vi khuẩn gram (-), chứa bacteriochlorophyll a (Bchl a) Chủng VK nghiên cứu có khả sinh trưởng tốt khoảng pH từ 5,5 – 6,5 (tối ưu pH = 5,5), sinh trưởng nồng độ muối (NaCl) từ 0-5% (tối ưu khoảng nồng độ từ 0,5 – 2,5%) sinh trưởng tốt điều kiện kỵ khí - sáng Khi nghiên cứu khả sử dụng nguồn carbon nitơ cho sinh trưởng, chủng VK có khả sử dụng nhiều nguồn carbon nitơ Sinh trưởng tối ưu môi trường chứa nguồn carbon: glucose, acetate, succinate, nguồn nitơ như: L glutamine, alanine, threonine, NH4Cl Sử dụng cặp mồi: forward 16SF có trình tự: 5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ reverse 16SR có trình tự: 5’ACGGCTATTACGACT-3’ với enzyme Taq polymerase để nhân gen 16S rRNA chủng VKTQH VTB.8 tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA Bằng phần mềm BLAST, chuỗi trình tự nucleotit nhận được so sánh với chuỗi liệu khác công bố Ngân hàng gen Quốc tế NCBI Kết cho thấy, chủng VTB.8 có độ tương đồng cao trình tự nucleotit gen 16S SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến rRNA so với lồi Rhodobacter sphaeroides có mã số đăng kí Ngân hàng gen D16425 đến 99% Từ kết đặc điểm sinh học kết hợp với xác định trình tự gen 16S rRNA, chúng tơi cho chủng VTB.8 thuộc loài Rhodobacter sphaeroides SVTH: Trần Thị Diệp GVHD: Hoàng Thị Yến DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 So sánh hấp thụ cực đại hai dạng bacteriochlorophyll a b VKTQH (trong tế bào nguyên dịch chiết ete) 15 Bảng 2.2 Các nhóm carotenoid có mặt tế bào VKTQH 17 Bảng 4.1 Khả sinh trưởng, tích lũy sinh khối, lipid tổng hợp acid béo không no chủng VK VTB.8 35 Bảng 4.2 Mức độ tích lũy thu sinh khối (OD660) chủng VTB.8 37 Bảng 4.3 Khả sinh trưởng nguồn carbon nitơ khác chủng VKTQH VTB.8 41 Bảng 4.4 Kêt ∆OD660 sau ngày nuôi cấy chủng VKTQH VTB.8 môi trường DSMZ-27 42 Bảng 4.5 Kết ∆OD660 sau ngày nuôi cấy chủng VKTQH VTB.8 môi trường DSMZ-27 pH ban đầu khác 44 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình dạng tế bào số đại diện VKTQH khơng lưu huỳnh 14 Hình 2.2 Cấu tạo hóa học vòng porphyry 16 Hình 2.3 Cấu trúc số Carotenoid có VKTQH 17 Hình 2.4 Sơ đồ cấu tạo dạng chromotophor VKTQH 18 Hình 2.5 Sơ đồ định vị thành phần máy quang hợp sơ cấp VKTQH 18 Hình 2.6 Mạch truyền điện tử tảo vi khuẩn bậc cao VKTQH 19 Hình 2.7 Chuỗi truyền điện tử hệ thống hô hấp quang hợp VKTQH 24 Hình 4.1 Kết phân tích GC-MS chủng VTB.8 36 Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc, tế bào chủng VTB.8 36 Hình 4.3 Đường cong sinh trưởng VTB.8 38 Hình 4.4 Phổ hấp phụ dịch huyền phù tế bào chủng VTB.8 39 Hình 4.5 Đĩa petri ria cấy chủng VKTQH VTB.8 40 Hình 4.6 Mức độ tích lũy sinh khối chủng VTB.8 nồng độ muối khác (OD ban đầu ̴ 0,1) 43 Hình 4.7 Mức độ tích lũy sinh khối chủng VTB.8 mơi trường có pH ban đầu khác 44 Hình 4.8 Điện di đồ DNA tổng số 45 Hình 4.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 46 Hình 4.10 Cây phát sinh chủng loại số loài VKTQH 48 Bảng 4.5 Kết ∆OD660 sau ngày nuôi cấy chủng VKTQH VTB.8 môi trường DSMZ-27 pH ban đầu khác pH 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10 ∆OD660 1,089 ± 0,04 1,746 ± 0,06 2,183 ± 0,03 2,165 ± 0,07 2,106 ± 0,08 1,973 ± 0,05 1,752 ± 0,02 1,532 ± 0,08 1,155 ± 0,07 0,911 ± 0,05 0,674 ± 0,06 0,413 ± 0,03 Hình 4.7 Mức độ tích lũy sinh khối chủng VTB.8 mơi trường có pH ban đầu khác Từ Bảng 4.5 Hình 4.7 ta thấy, chủng VTB.8 có khả sinh trưởng mạnh dải pH rộng từ đến 7,5 Điều có ý nghĩa lớn việc nhân ni chủng VKTQH VTB.8 quy mô lớn (tiết kiệm nhân công chi phí chuẩn pH ban đầu sau ni cấy) 4.2 Xác định trình tự gen chủng vi khuẩn nghiên cứu 44 Tách chiết làm DNA tổng số vi khuẩn khâu quan trọng chất lượng DNA ảnh hưởng đến hiệu thí nghiệm Vì để xác định trình tự gen 16S rRNA chủng VTB.8, trước tiên tiến hành tách chiết DNA tổng số sử dụng GeneJET Genomic DNA purification Kit Sản phẩm tách DNA tổng số điện di kiểm tra gel agarose 1% hình 4.8 M Hình 4.8 Điện di đồ DNA tổng số 1: DNA tổng số chủng VTB.8 ; M: thị phân tử DNA 1kb marker Kết kiểm tra DNA tổng số gel điện di cho thấy băng DNA sắc nét, sáng rõ gọn khơng đứt gãy Điều chứng tỏ DNA tổng số tách thành cơng, có độ tinh cao, hàm lượng đủ lớn đạt chất lượng làm khuôn phản ứng PCR Nhân phần vùng gen 16S rRNA kỹ thuật PCR sử dụng enzyme Taq DNA polymerase cặp mồi 16SF có trình tự 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 16SR có trình tự 5'- ACGGCTACCTTGTTACGACT-3' Chu trình nhiệt phản ứng sau: 95oC - phút; 30 chu kỳ 95oC – phút, 50oC - phút, 72oC – phút 30 giây; 72oC - 10 phút Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% đệm TBE, nhuộm Ethidium Bromide hiển thị kết Hình 4.9 M 45 bp M 3000 1500 1000 500 Hình 4.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 1: đối chứng âm; 2: sản phẩm PCR với khuôn DNA tách từ chủng VTB.8; M: thị phân tử DNA 1kb marker Kết điện di kiểm tra hình 4.9 cho thấy, sản phẩm PCR đường chạy cho băng nhất, đối chiếu với thang DNA chuẩn, kích thước sản phẩm PCR khoảng 1500 bp phù hợp với độ lớn gen 16S rRNA vi sinh vật tiền nhân Trong đường chạy mẫu đối chứng âm khơng có băng Từ kết khẳng định đoạn gen mong muốn nhân lên Để xác định xác trình tự đoạn gen khuếch đại, tiến hành gửi mẫu xác định trình tự Để xác định xác chúng có phải đoạn gen cần nhân lên hay khơng, chúng tơi tiến hành xác định trình tự máy giải trình tự gen thu kết sau: Trình tự gen 16S rRNA chủng VTB.8: GAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTTCGGAATAGCCCCGGGAAACT GGGAGTAATACCGAATGTGCCCTACGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGG CCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCAT AGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGC CATGCCGCGTGATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGATCTTTCAGGTGGGAAG ATAATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTATTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTA 46 GGCGGATCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCCTGGAACTGCCTT TGAAACTCCCGATCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGG TGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTC GATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTG ACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAA CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCG AAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATGGCGATCGCGGTTCCAGAGAT GGTTCCTTCAGTTCGGCTGGATCGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTC GTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTT GCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGAAAG GTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTA CAATGGCAGTGACAATGGGTTAATCCCAAAAAGCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGT CTGCACTCCACCCCCTGAAGTCGGAATCCCNAGTAATCCCGTAAACCCTGACCCG GTGAAAACTTTCCCGGGCCTTGTACACCCCCCCCGNNCCACCGGGGAATTGGTTT ACCCGAAGGCGGTGCGCCAACCTCGCAAGAGGAGGCAGCCGACCNCGG Sau có kết giải trình tự gen, chúng tơi tiến hành so sánh trình tự gen thu với trình tự lồi công bố Ngân hàng gen Quốc tế Và để làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền chủng VTB.8, xây dựng phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn nghiên cứu với loài gần gũi dựa sở so sánh trình tự nucleotit gen 16S rRNA chủng với số loài biết phầm mềm ClustalX Megablast Kết trình bày Hình 4.10 47 Hình 4.10 Cây phát sinh chủng loại số loài VKTQH Từ phát sinh chủng loại (Hình 4.10) ta thấy, chủng VTB.8 có tỉ lệ tương đồng cao so với lồi Rhodobacter sphaeroides có mã số đăng kí Ngân hàng gen D16425 (99%) Vì chúng tơi cho chủng VTB.8 thuộc lồi Rhodobacter sphaeroides Như vậy, từ đặc điểm sinh học như: hình dạng tế bào, hình thức sinh sản, sắc tố quang hợp, khả sử dụng nguồn carbon nitơ, khả sử dụng muối kết phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA, xác định chủng VTB.8 thuộc loài Rhodobacter sphaeroides 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết thí nghiệm nghiên cứu nêu rút kết luận sau: Về đặc điểm sinh học chủng VTB.8 • Khuẩn lạc có dạng hình tròn, mép căng, màu nâu đỏ, đường kính khoảng 1,5 – mm, dịch huyền phù tế bào có màu nâu đỏ Tế bào dạng hình bầu dục, đường kính 0,7 1,8 àm, sinh sn bng cỏch nhõn ụi Sinh trưởng tối ưu sau ngày (96h) nuôi cấy • Chứa Bchl a • Có khả sử dụng nhiều nguồn carbon nitơ cho sinh trưởng Chủng sinh trưởng mạnh nguồn carbon như: succinate, glucose, acetate; nguồn nitơ như: threonine, L Glutamine, NH4Cl, alanine • Sinh trưởng dải nồng độ muối, pH rộng, sinh trưởng tối ưu pH = 5,5 nồng độ muối 2,5 % Từ đặc điểm sinh học kết hợp với kết phân tích trình tự gen 16S rRNA xác định chủng VTB.8 thuộc loài Rhodobacter sphaeroides KIẾN NGHỊ Nhằm cung cấp đủ nguồn nguyên liệu cho tách chiết acid béo không no (omega 6, 7, 9) cần nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất sinh khối chủng VTB.8 quy mơ phòng thí nghiệm quy mơ pilot như: - Lựa chọn nguồn chất thích hợp - Ảnh hưởng điều kiện ngoại cảnh đến khả tích lũy sinh khối nhiệt độ, cường độ ánh sáng, oxy đến sinh trưởng chúng - Cách thu sinh khối lượng lớn - Tách chiết tinh omega (6, 7, 9) 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Trần Dụ Chi, Đỗ Hoài Thu, Dương Đức Tiến, Trần Hải Linh, “Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng quang hợp chủng vi tảo biển Isochrysis sp, Chroomonas sp”, Tạp chí khoa học Đại Học Quốc Gia Hà Nội, tr 87-93, 2004 Nguyễn Thành Đạt, Cơ sở sinh học vi sinh vật (Tập 2), NXB Đại học Sư phạm, 2007 Trần Văn Nhị, Đỗ Thị Tố Uyên, “Nghiên cứu vi khuẩn quang hợp tía để sử dụng xử lý nước thải ô nhiễm nặng hữu cơ”, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1996, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 201-206, 1997 Lê Tất Thành, “Nghiên cứu sàng lọc, phân lập nhận dạng hoạt chất axit béo, axit arachidonic prostaglandin từ rong đỏ biển”, Luận án Tiến sĩ hóa học, 2016 Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất ubiquinone từ sinh khối vi khuẩn quang hợp tía”, Báo cáo khoa học Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, định hướng y dược học; Hội nghị Quốc Gia, Đại học Y Hà Nội, tr 846-849, 2005 Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, “Nghiên cứu tổng hợp ngoại tiết 5-aminolevulinic acid số chủng vi khuẩn quang hợp tía phân lập Việt Nam”, Tạp chí Cơng Nghệ sinh học 4(1), tr 73-80, 2006 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, “ Sinh lý học thực vật” NXB Giáo dục, 2001 Đặng Đình Kim, Đặng Hồng Phước Hiền,” Công nghệ sinh học vi tảo”, NXB Nông Nghiệp tr: 203, 1999 Hoàng Thị Yến, “Nghiên cứu vi khuẩn tía quang hợp khơng lưu huỳnh phân lập Việt Nam làm thức ăn tươi sống cho giống động vật hai mảnh vỏ” Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nôi, tr: 12- 66, 2010 Tài liệu Tiếng Anh 10 Alef K., Arp D J., and Zumpt W G., “Nitrogenase switch-off by ammonia in Rhodopseudomonas palustris: loss under nitrogen deficiency and independence from adenylylation state of glutamin synthetase”, Arch Microbiol., 130, pp 138-142, 1981 11 Blasco R., Cardenas J., and Castillo F., Acetate metabolism in purple non sulfur bacteria, FEMS Microbio Lett 58,pp 129-132, 1989 12 Burris R H., and Robert G P., “Biological Nitrogen Fixation”, Annu Rev Nutr., 13, pp 317- 335, 1993 50 13 Buchanan B B., Evans M C W., and Arnon D I., “Feredoxindependent carbon assimilation in Rhodospirillum rubrum”, Arch Microbiol., 59, pp 32- 40, 1967 14 Chamorro G., Salazar m., and Araujo K.G Update on pharmacology of Spirulina (Arthrospira), an unconventional food Arch Lationam 52(3), pp 232-240, 2002 15 Condrad R., and Schlegel H G., “Different pathways for fructose and glucose utilization in Rhodopseudomonas capsulata and demonstration of 1-phpsphate fructokinase in phototrophic bacteria”, Biochem Biophys Acta 358, pp 221-225, 1974 16 Condrad R., and Schlegel H G., “Different degradation pathways for glucose and fructose in Rhodoseudomonas capsulatus”, Arch, Microbiol., 112, pp 38-48, 1977b 17 Fuller R C., “The photosynthetic carbon metabolism in the green and purple bacteria” In Clayton R.K., and Sistrom WR (eds) “The phototrophic bacteria”, Plenum Press New York, pp 691-705, 1978 18 Guillard R.R.L., Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, In Smith, W.L and Chanle, Y.M.H (eds), Culture of Marine Invertebrate Animals, Plenum Press New York USA, pp 26-60, 1975 19 Gunstone F.D., Fatty acid and lipid chemistry, Blackie Acedemic, London, 1996 20 Hiraishi A Ueda Y., Isolation and characterization of Rhodovulum strictum sp.nov and some other purple nonsulfur bacteria from colored blooms in tidal and seawater pools, Int j Syst Bacteriol 45, pp 319-326, 1995 21 Hirotani H., Ohigashi H., Kobayashi M., Koshimizu K., Takasi E., Inactivation of T5 phage by cis-vaccenic acid and antivirus substances from Rhodopseudomonas capsulata, and by unsaturated fatty acids and related alcohols FEMS Microbiol Lett 77: pp 13-18, 1991 22 Kim D.H., Son H.N., Kim M.S., Effect of substrate concentration on continouss photo- fermentative hydrogen production from lactate using Rhodobacter sphaeroides Int J Hydrogen Energ 37, pp 15483-15488, 2012 23 Kleiner D., Ammonium uptake and ammonium excretion by 51 bacteria – a review, Recent Res Devel Microbiology 4, pp 57- 63, 2000 24 Klemme, J H., “Modulation by fumarate of pi-insensitive pyruvate kinase from Rhodopseudomonas capsulata”, Arch Microbiol.,100, pp 5763, 1974 25 Kondratieva E N., and Gogotov I N., “Molecular hydrogen in microbial metabolism”, Nauka Moscow, pp 343, 1981 26 Kornberg H.L., and Lascelles J., The formation of the isocitrate by the Athiorhodaceae J Gen Microbiol 23, pp 511-517, 1960 27 Lavens P Sorgeloo P., Mannual of the production and use of live food for aquaculture, Ghent, Belgium, Rom FAO 361, pp 295, 1996 28 Lucking D., Pike L., and Sojka G., “Glycerol utilization by a mutant of Rhodopseudomonas capsulata”, J Bacteriol 125, pp 750-752, 1976 29 Li Y., Xu B., and Xu X.H., Isolation, identificatin and growth codition of Rhodopseudomonas J Ocean Uni Qing dao 25, pp 345-359, 1995 30 Loo P.L., Chong V.C., and Vikineswary S., Rhodobacter sulfidophilum, a phototrophic bacerium grown in palm oil mill efuent improves the larval survival ò marble goby Oxyeleotris marmorata (Bleeker), Aquac Res 44, pp 495-507, 2013 31 Merrick M.J., Edwards R.A., Nitrogen control in bacteria Microbiological reviews 59(4), pp 604- 622, 1995 32 Mochida K., Ohsaki T., Kobayashi T., Kimura R., Coenzym Q production by Rhodopseudomonas Jpn Kokai Tokyo Koho JP 73/21: 519, 1973 33 Madigan M T., “Microbiology, physiology and ecology of phototrophic bacteria”, In: Zehnder A.J.B (ed.), Biology of anaerobic microorganism, John Willey and Sons, Inc New York,pp 59-111, 1988 34 Quadri S M H., and Hoare S., Pyruvate decacboxylase in photosynthytic bacteria, Biochim Biopys Acta 148, pp 304-306, 1967 35 Quayle J R and Pfennig N., “Utilization of methanol by Rhodospirillaceae”, Arch Microbiol., 102, pp 193-198, 1975 36 Rai P.S., Ramaprasad E.V.V., Vaseef S., Sasikala Ch., and Ramana Ch.V Rhodobacter viri sp.nov., a phototrophic bacterium isolated from mud of a stream, Int J Syst Evol Microbiol 63, pp 181-186, 2013 52 37 Sasikala C., Ramana C.V Biotechnological potentials of photosynthetic bacteria I: Production of single cell protein, vitamins, ubiquinone, hormones, and enzymes and use in waste treatment Adv Appl Microbiol 41: 173-225, 1995a 38 Sasaki K., Noparatnaraporn N., Nagai S., Use of photosynthetic bacteria for the production of SCP and chemicals from agro-industrial wastes In Bio-conversion of waste materials to industrial products, ed Martin AM: 225-263, 1991 39 Sasaki K., Takana T., Nishizawa Y., and Hayzashi M, Identification herbicide 5- aminolevulinic acid by Rhodobacter sphaeroides using the effluent of swine waste from an anaerobic degestor, Appl Microbiol Biotechnol 32, pp 731- 737, 1990 40 Sijtsma L and de Swaaf M.E., Biotechnological production and application of the ω-3 polyunsaturated fatty aciddocosahexaenoic acid Appl Microbiol Biotechnol 64, pp 146-153, 2004 41 Schon G., and Voelskow H., “Pyruvate fermentation in Rhodospirillum rubrum after transfer from aerobic to anaerobic conditions in the dark”, Adv Appl Microbiol., 107, pp.82-92, 1976 42 Simopoulos A.P., The importance off the omega-3 fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic disease Exp Biol Med 233, pp 674-688, 2008 43 Jolliet P., Simon N., Barre J., Pons J.Y., Boukef M., Paniel B.J., Tillement J.P., Plasma coenzyme Q10 concentrainons in breast cancer: prognosis and therapeutic consequences Int Clin Pharmamacol Ther 36(9): 506-509, 1998 44 Tabita F R., “The biochemistry and metabolic regulation of carbon metabolism and CO2 fixation in purple bacteria In Anoxygenic phototrophic bacteria” Robert E Blankenship (ed).Kluwer academic Publishers, pp 885-914, 1995 45 Wraight C A., “Current researchs on photosynthesis”, In Godvindjee (ed), Photosynthesis, vol I, Academic Press New York, London 1, pp 17- 61, 1982 46 Willison J C., “Pyruvate and acetate metabolism in the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus”, J Gen Microbiol.134, pp 2429-2439, 1988 47 Yap C.Y and Chen F., Poly-unsaturated fatty acids: biological significance, biosynthesis, and production by mcroalgae organisms, In, Cen 53 F and Jiang Y (eds), Algae and their botechnological potential, Kluwer Acadmeic Publishers Dordrecht, The Netherlands, 2001 Tài liệu Internet 48 http://www.seabuckwonders.com/products/sea-buckthorn-omega-7complete/ 49 http://www.dsmz.de/media/med027.htm 50 http://www.sibu.com/product/omega_7_pure/ 51 www.viendinhduong.com/ 52 http://abipha.com.vn/ 54 PHỤ LỤC Kết thí nghiệm khả sinh trưởng Chủng VTB.8 Ngày OD660 lần1 OD660 lần OD 660 lần 0.3 0.278 0.312 0.703 0.801 0.724 1.491 1.421 1.465 2.176 2.073 2.143 2.478 2.413 2.468 2.25 2.19 2.257 Kết đo OD660 chủng VTB.8 thời gian nuôi cấy ảnh hưởng nồng độ muối khác Nồng độ muối 0% 0.50% 1% 1.50% 2% OD660 (ngày 1) OD660 (ngày 4) ∆OD660 0.162 2.49 2.328 0.124 2.023 1.899 0.103 2.125 2.022 0.135 1.924 1.789 0.182 2.491 2.309 0.125 2.381 2.256 0.128 1.922 1.794 0.162 2.363 2.201 0.158 2.523 2.365 0.158 2.369 2.211 0.123 2.101 1.978 0.141 2.342 2.201 0.152 2.17 2.018 0.193 2.179 1.986 55 2.50% 3% 3.50% 4% 5% 6% 7% 8% 9% 10% 0.125 2.514 2.389 0.115 2.111 1.996 0.194 2.224 2.03 0.145 2.68 2.535 0.149 2.025 1.876 0.173 2.371 2.198 0.143 2.471 2.328 0.101 1.863 1.762 0.184 2.571 2.387 0.126 2.307 2.181 0.167 2.021 1.854 0.201 2.409 2.208 0.167 2.153 1.986 0.117 1.771 1.654 0.152 2.125 1.973 0.11 2.042 1.932 0.142 1.44 1.298 0.172 1.628 1.456 0.12 1.458 1.338 0.166 1.066 0.9 0.123 0.884 0.761 0.168 1.213 1.045 0.153 0.631 0.478 0.142 0.743 0.601 0.168 0.778 0.61 0.161 0.459 0.298 0.182 0.484 0.302 0.174 0.6 0.426 0.14 0.263 0.123 0.183 0.384 0.201 0.16 0.28 0.12 Kết đo OD660 chủng VTB.8 thời gian nuôi cấy ảnh hưởng pH ban đầu 56 pH 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 Lần đo OD660 (ngày 1) OD660 (ngày 4) ∆OD660 3 3 3 3 3 3 0.189 0.276 0.345 0.187 0.307 0.318 0.165 0.292 0.31 0.305 0.335 0.377 0.165 0.385 0.377 0.231 0.276 0.326 0.216 0.302 0.346 0.194 0.282 0.347 0.166 0.304 0.384 0.246 0.289 0.364 0.23 0.293 0.306 0.245 0.302 0.329 0.974 1.154 1.631 1.585 2.004 1.951 1.921 2.281 2.475 2.29 2.336 2.25 1.863 2.366 2.413 1.799 2.077 2.159 1.699 1.904 2.004 1.597 1.58 1.795 1.345 1.283 1.352 1.094 1.086 1.188 0.708 0.835 1.11 0.514 0.603 0.878 0.785 0.878 1.286 1.398 1.697 1.633 1.756 1.989 2.165 1.985 2.001 1.873 1.698 1.981 2.036 1.568 1.801 1.833 1.483 1.602 1.658 1.403 1.298 1.448 1.179 0.979 0.968 0.848 0.797 0.824 0.478 0.542 0.804 0.269 0.301 0.549 Trình tự gen 16S r RNA chủng VTB.8 57 GAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTTCGGAATAGCCCCGG GAAACTGGGAGTAATACCGAATGTGCCCTACGGGGGAAAGATTTATC GGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGG CCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTG ATCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGATCTTTCAGGTGGGAAGATA ATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTATTCGGAATTACTGGGCGT AAAGCGCACGTAGGCGGATCGGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGG CTCAACCCTGGAACTGCCTTTGAAACTCCCGATCTTGAGGTCGAGAG AGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGG AGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCT GAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG TCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTC GGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCG CAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCT TGACATGGCGATCGCGGTTCCAGAGATGGTTCCTTCAGTTCGGCTGG ATCGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCA GCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAAACTGCCGGTGATAAGCCGGAGA AAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTA CACACGTGCTACAATGGCAGTGACAATGGGTTAATCCCAAAAAGCTG TCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCACTCCACCCCCTGAAGTCGGAATC CCNAGTAATCCCGTAAACCCTGACCCGGTGAAAACTTTCCCGGGCCT TGTACACCCCCCCCGNNCCACCGGGGAATTGGTTTACCCGAAGGCGG TGCGCCAACCTCGCAAGAGGAGGCAGCCGACCNCGG 58 ... tài Nghiên cứu đặc điểm sinh học sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân loại đến lồi chủng vi khuẩn tía quang hợp có khả tổng hợp axit béo không no (dạng omega 6,7,9) 1.2 Mục đích Nghiên cứu. .. Trong loại dinh dưỡng mà người thường sử dụng khơng thể khơng kể đến acid béo mà đặc biệt acid béo không no (dạng omega 3 ,6,7,9) Các acid béo không no nhiều người tiêu dùng giới Vi t Nam sử dụng Omega. .. vòng, chứa nhóm chức hydroxyl 2.1.2.2 Phân loại acid béo Acid béo chia làm loại: acid béo no acid béo không no Acid béo no • Các acid béo no thường gặp: acid palmitic, stearic, caprilic, chiếm