BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …… ***…… NGUYỄN LÊ DUẨN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011 – 2015 HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …….***…… NGUYỄN LÊ DUẨN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011 – 2015 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành khóa luận này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học, Trung tâm nghiên cứu Gen Protein trường Đại học Y Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới: PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung, người thầy tận tâm hướng dẫn, bảo động viên em trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Quỳnh Giao, người trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn giúp đỡ cung cấp cho em phương pháp thực hành suốt thời gian em thực đề tài Trung tâm Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô, anh chị làm việc Labo Trung tâm nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội dành cho em giúp đỡ quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em thực khoá luận tốt nghiệp Những lời cảm ơn cuối cùng, em xin gửi tới người thân bạn bè, động viên, giúp đỡ em trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Lê Duẩn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan u não 1.1.1 Tỷ lệ mắc u não 1.1.2 Nguyên nhân gây u não 1.1.3 Phân loại u não 1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) 1.1.5 Triệu chứng lâm sàng 10 1.1.6 Chẩn đoán cận lâm sàng 13 1.1.7 Điều trị u não 15 1.2 Gen mã hóa EGFR đường khuếch đại tín hiệu 16 1.2.1 Gen mã hóa EGFR 16 1.2.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) 17 1.2.3 Đột biến gen EGFR 19 1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen Glioblastoma 20 1.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen – PCR PCR lồng 20 1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen(Sequencing) 25 CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 27 2.3.1 Thiết bị phòng nghiên cứu 27 2.3.2 Dụng cụ 28 2.3.3 Hóa chất sử dụng 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5 Quy trình kỹ thuật 30 2.5.1 Lấy mẫu mô paraffin 30 2.5.2 Tách DNA từ mẫu mô 30 2.5.3 Kiểm tra độ tinh đo nồng độ DNA 32 2.5.4 PCR khuếch đại đoạn gen EGFR 33 2.5.5 Giải trình tự gen phát đột biến gen 36 2.6 Đạo đức nghiên cứu 38 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 3.1 Kết tách chiết DNA 39 3.1.1 Kết đo nồng độ mật độ quang 39 3.1.2 Kết điện di DNA tổng số 41 3.2 Kết PCR khuếch đại exon 21 gen EGFR 41 3.3 Kết giải trình tự gen 42 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 44 4.1 Kết tách chiết DNA 44 4.2 Kết PCR lồng khuếch đại exon 21 45 4.3 Kết giải trình tự exon 21 gen EGFR 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate Tm Melting temperature A Deoxyadenosine triphosphate T Thymidine triphosphate G Deoxyguanosine triphosphate C Deoxycytidine triphosphate Kb Kilobase kD Kilo Dalton GB Glioblastoma EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic TE Tris EDTA Nu Nucleotide PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 U nguyên bào thần kinh đệm độ IV Hình 1.2 U nguyên bào thần kinh đệm độ IV tiêu mô bệnh học Hình 1.3 Minh họa vị trí gen EGFR 16 Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể phát triển biểu mô hoạt hóa EGFR 17 Hình1.5 Con đường tín hiệu EGFR tế bào 18 Hình 1.6 Các bước phản ứng PCR 22 Hình3.1 Minh họa đo nồng độ kiểm tra độ tinh DNA máy Nanodrop 38 Hình3.2 Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel 0,8% 40 Hình3.3 Kết điện di sản phẩm PCR exon 21 gen EGFR 40 Hình3.4 Kết giải trình tự exon 21 gen EGFR bệnh nhân 41 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại khối u hệ thần kinh (WHO, 2000) Bảng 2.1 Các thành phần phản ứng PCR vòng khuếch đại exon 21gen EGFR 33 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR vòng hai 35 Bảng 2.3 Thành phần chất mastermix giải trình tự gen 36 Bảng 3.1 Kết độ tinh nồng độ DNA sau tách chiết từ mẫu mô đối tượng nghiên cứu 39 ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) khối u não phổ biến nhất, chiếm 18,5% tất khối u não Hoa Kỳ [1] Tổ chức Y tế Thế giới phân loại Glioblastoma u tế bào hình (Astrocytoma) cấp III IV với độ ác tính cao Glioblastoma multiforme xem u nguyên bào thần kinh đệm độ IV loại u sọ ác tính Tỷ lệ Glioblastoma khoảng 3,19/100.000 dân, độ tuổi trung bình phát 64 tuổi tỷ lệ mắc nam cao so với nữ [2] Glioblastoma loại u ác tính, thường hình thành chất trắng não, phát triển nhanh chóng thành khối u lớn trước xuất triệu chứng Do đó, biểu lâm sàng thường hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống thêm bệnh nhân sau mổ trung bình 15 tháng [2] [3] Hiện nay, việc chẩn đoán phân loại u dựa vào lâm sàng, chẩn đốn hình ảnh, mô bệnh học Các phương pháp hạn chế, thường phát khối u phát triển lớn, can thiệp hiệu Vấn đề cần thiết bệnh chẩn đốn sớm điều trị sớm Do đó, nhà khoa học giới nghiên cứu bệnh học phân tử GB Sự biến đổi gen biến đổi sớm nhất, biến đổi protein trước có biến đổi hình thái chức tế bào ung thư Điều giúp tìm nguyên, chế bệnh sinh trình bệnh học ung thư để can thiệp sớm hiệu Trong GB, nhiều nghiên cứu giới biến đổi số gen, EGFR gen có tỷ lệ đột biến cao với tỷ lệ khoảng 43% [4] Các nghiên cứu góp phần sáng tỏ nguyên nhân chế bệnh sinh GB, xác định nguy mắc thể ác tính hướng tới điều trị đích Do đó, việc sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen EGFR cần thiết, hỗ trợ bác sỹ lâm sàng phân loại, tiên lượng khả mắc thể GB bệnh nhân u não Bên cạnh đó, thị trường phát triển mạnh mẽ dòng thuốc ức chế ung thư qua EGFR chứng minh hiệu nhiều ung thư quan khác liên quan đến đột biến gen EGFR Do đó, xác định đột biến gen hỗ trợ định điều trị đích với trường hợp đột biến EGFR cách kết hợp sử dụng thuốc ức chế EGFR phương pháp điều trị khác Hiện nay, có nhiều kỹ thuật tiên tiến để xác định đột biến gen như: PCR–RFLP, giải trình tự gen, Scorpions ARMS, SMAP (Smart Amplification Process) Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen sử dụng phổ biến phòng thí nghiệm; Scorpion ARMS đắt tiền chưa áp dụng rộng rãi; SMAP q trình thử nghiệm hồn thiện Vì vậy, nghiên cứu tơi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến gen EGFR, với giá thành dịch vụ rẻ quy trình kỹ thuật khơng q phức tạp Với mục đích xây dựng quy trình xác định đột biến gen xác, phù hợp với điều kiện bệnh nhân kinh tế Việt Nam, nghiên cứu xây dựng với mục tiêu: Hồn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Bước đầu nghiên cứu xác định độ biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm 39 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết tách chiết DNA 3.1.1 Kết đo nồng độ mật độ quang Các mẫu mô bệnh nhân cạo phần ung thư tiến hành tách chiết DNA theo phương pháp phenol/chloroform Sau tách chiết xong, mẫu DNA kiểm tra độ tinh đo nồng độ phương pháp đo mật độ quang máy Nano-drop Hình3.1: Minh họa đo nồng độ kiểm tra độ tinh DNA máy Nano-drop Dưới kết đo nồng độ kiểm tra độ tinh DNA mẫu sau tách chiết: 40 Bảng3.1:Kết độ tinh nồng độ DNA sau tách chiết từ mẫu mô đối tượng nghiên cứu Mẫu bệnh Nồng độ (ng/µl) Độ tinh (A260/A280) 727,3 1,90 1575,4 1,97 900,8 1,96 1437,1 2,00 2008,4 1,92 1323,4 1,94 875,3 1,91 402,3 1,96 364,1 1,94 10 1248,5 2,02 11 206,0 1,93 12 1147,2 1,95 13 498,9 1,92 14 198,9 1,82 15 2026,1 1,99 16 2180,0 2,01 17 1537,5 1,86 18 871,7 1,99 19 243,4 1,94 20 685,0 1,96 41 Nhận xét: Các mẫu DNA tách chiết có số độ tinh dao động khoảng 1,90-2,02 với nồng độ lớn 50 ng/μl Chất lượng DNA tách chiết đảm bảo yêu cầu để tiến hành phản ứng PCR 3.1.2 Kết điện di DNA tổng số Sau tách chiết, mẫu DNA điện di gel agarose 0,8% điều kiện 90V – 40 phút để kiểm tra chất lượng Hình3.2: Kết điện di kiểm tra DNA tổng số gel 0,8% Chú thích: B1 – B12 mẫu DNA 12 bệnh nhân Nhận xét: Kết hình cho thấy có băng nhất, sáng rõ chứng tỏ mẫu DNA nguyên vẹn, không bị đứt gãy đủ điều kiện để PCR giải trình tự 3.2 Kết PCR khuếch đại exon 21 gen EGFR Các mẫu DNA sau tách chiết khuếch đại đoạn exon 21 gen EGFR với cặp mồi đặc hiệu phương pháp PCR lồng Sau đó, sản phẩm khuếch đại gen điện di kiểm tra gel 1,5% Sản phẩm khuếch đại có kích thước 374bp hình: 42 Hình3.3: Kết điện di sản phẩm PCR exon 21 gen EGFR Chú thích: B1-B5: mẫu sản phẩm PCR bệnh nhân Nhận xét: Trên hình điện di, sản phẩm khuếch đại exon 21 PCR lồng băng to, sáng rõ, kích thước Sản phẩm thu đặc hiệu, rõ nét, đạt yêu cầu cho phản ứng giải trình tự 3.3 Kết giải trình tự gen Cả 20 mẫu bệnh tham gia nghiên cứu, kỹ thuật giải trình tự gen cho kết không phát đột biến exon 21 gen EGFR Hình3.4: Kết giải trình tự exon 21 gen EGFR bệnh nhân 43 Chú thích: Hình ảnh đỉnh sóng màu xanh cây, màu đen, màu đỏ, màu xanh lam biểu thị trình tự nu: A, G, T, C Nhận xét: Hình ảnh giải trình tự rõ nét, đỉnh sóng rõ ràng, khơng có tín hiệu bị nhiễu hay sóng đè lên Các tín hiệu thu so sánh với trình tự chuẩn Gene Bank để xác định đột biến 44 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 4.1 Kết tách chiết DNA Khoa học kỹ thuật ngày phát triển, vai trò sinh học phân tử y học ngày to lớn, ngược lại kỳ vọng y học vào lớn Đặc biệt bệnh ung thư mà chưa có phương pháp điều trị hồn tồn, tiên lượng thường xấu vấn đề đặt chẩn đoán sớm liệu pháp điều trị mang tính định người bệnh Những người chẩn đốn GB, thời gian sống thêm trung bình 15 tháng; 2% bệnh nhân 65 tuổi 30% bệnh nhân 45 tuổi sống thêm năm [1] [2] Do đó, chẩn đốn sớm kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen có ý nghĩa quan trọng điều trị tiên lượng bệnh Các kỹ thuật sinh học phân tử gắn liền với DNA bước để có nguồn nguyên liệu DNA đảm bảo số lượng chất lượng Vì vậy, tách chiết DNA khâu đầu tiên, quan trọng định đến kết kỹ thuật thao tác DNA Một mẫu DNA tách chiết có nồng độ, độ tinh cao, không bị đứt gãy, tạp nhiễm đảm bảo bước đầu có kết xác Trong nghiên cứu này, phương pháp Phenol-cloroform lựa chọn để tách chiết DNA Tách chiết DNA theo phương pháp cần nhiều thời gian so với phương tách chiết DNA sử dụng kit thường quy sử dụng sản phẩm DNA thu có nồng độ, độ tinh cao giá thành rẻ Tất DNA mẫu mô bệnh nhân sau tách chiết xác định nồng độ kiểm tra độ tinh cách đo mật độ quang máy Nanodrop 1000 Nguyên tắc phương pháp dựa vào hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại base purin pyrimydine, hai gốc đơn phân cấu tạo 45 nên DNA Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm Giá trị đo mật độ quang bước sóng λ = 260nm mẫu cho phép xác định nồng độ DNA mẫu Ngồi ra, máy Nanodrop cho phép kiểm tra độ tinh mẫu DNA tách chiết giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 280nm Ở bước sóng này, protein có mức hấp thụ cao Mặt khác, protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm acid nucleic khác nên làm sai lệch giá trị thật nồng độ DNA Một mẫu DNA xem tỷ số A260/A280 nằm khoảng 1.8- 2.0 Có thể kiểm tra độ tinh mẫu DNA hình ảnh điện di gel agarose 0,8% DNA tổng số lên sáng rõ nét có băng Các thông số nồng độ độ tinh mẫu DNA từ bảng số liệu (Bảng 3.1), ta thấy: - Tất mẫu đạt nồng độ 50 ng/μl đảm bảo đủ nồng độ để thực phản ứng PCR thành công - Tỷ số A260/A280 nằm khoảng từ 1,9 - 2,0 cho biết DNA tách tương đối tinh sạch, hồn tồn cho kết PCR tốt Để khẳng định kết tách chiết lần nữa, thực điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% hình ảnh điện di cho thấy DNA băng sáng nhất, không bị đứt gãy, đảm bảo độ nguyên vẹn đạt điều kiện cho phản ứng PCR (Hình 3.2) 4.2 Kết PCR lồng khuếch đại exon 21 Trong nghiên cứu này, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm khuếch đại đoạn exon 21 gen EGFR Sản phẩm PCR kiểm tra độ nguyên vẹn, độ tinh độ đặc hiệu phương pháp điện di gel agarose 1,5% nhuộm Ethidium Bromide chụp hình tia tử ngoại Độ tinh đặc hiệu đánh giá số đường băng điện di; mẫu DNA có 46 độ đặc hiệu cao hình ảnh điện di có băng băng điện di thể hích thước tương ứng với sản phẩm khuếch đại ta mong muốn Đánh giá tính nguyên vẹn DNA thơng qua hình ảnh băng điện di co gọn, rõ nét, khơng có băng phụ chứng tỏ DNA không bị đứt gãy Tuy nhiên kết PCR không mong muốn, xuất băng phụ, hình ảnh mồi thừa, băng khơng rõ hay khơng xuất sản phẩm PCR… Bởi phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chất lượng nồng độ DNA mẫu, nồng độ thiết kế mồi, nồng độ ion Mg2+, nồng độ dNTP, Taq DNA polymerase, chu trình nhiệt – thời gian phản ứng yếu tố kỹ thuật trình mastermix Chất lượng mẫu DNA tách chiết đảm bảo nồng độ độ tinh cho phản ứng PCR; cặp mồi thiết kế sẵn sử dụng thành cơng nghiên cứu trước Các thành phần: Taq DNA polymerase, dNTP, ion Mg2+ đệm pha sẵn thích hợp Gold taq Chũng tơi dò tìm nhiệt độ gắn mồi chu trình nhiệt – thời gian tối ưu cho phản ứng PCR (Bảng 3.2) Để tăng độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR, tiến hành PCR lồng Sản phẩm khuếch đại gen PCR lần sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lần hai với cặp mồi cũ Các thành phần khác, thể tích chu trình nhiệt lặp lại giống với PCR lần Kết điện di kiểm tra cho thấy độ nhạy độ đặc hiệu tăng lên nhiều lần, khả phát sản phẩm khuếch đại gen cải thiện rõ Sản phẩm sau PCR lồng hoàn toàn đảm bảo tiêu chuẩn để thực giải trình tự 4.3 Kết giải trình tự exon 21 gen EGFR Kết giải trình tự máy tự động so sánh với trình tự Gene Bank cho thấy không phát loại đột biến exon 21 20 bệnh nhân 47 Hình ảnh giải trình tự (Hình 3.4), cho thấy đỉnh sóng rõ ràng, khơng có tín hiệu bị nhiễu hay sóng đè lên thể khơng có đột biến Rất nhiều nghiên cứu đột biến exon 21 gen EGFR bệnh Ung thư phổi không tế bào nhỏ tỷ lệ đột biến rõ Tuy nhiên, nghiên cứu gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm chưa cho thấy mối tương quan đột biến exon 21 gen EGFR với bệnh u nguyên bào thần kinh đệm (GB) Một số nghiên cứu nước tỷ lệ đột biến gen EGFR GB Zurich (2003) 36%, San Francisco Bay Area (2003) 38% [23]; nghiên cứu V.Milikovic – S.Bankovic (2013) cộng cho tỷ lệ 43,3% [4]; Maire – Ligon.K (2014) cho thấy tỷ lệ 57% [24] Các nghiên cứu đột biến gen EGFR chủ yếu xuất exon 2-7, số đột biến điểm exon exon 9; không cho thấy có đột biến exon 21 Với phạm vi nghiên cứu tiểu luận tốt nghiệp, cỡ mẫu nhỏ hạn chế thời gian, kết thu chưa thể đưa kết luận đột biến exon 21 gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm người Việt Nam Rất cần có nhiều cơng trình nghiên cứu lớn, trình độ cao cỡ mẫu lớn để đưa kết luận đột biến gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm người Việt Nam nói chung đột biến exon 21 nói riêng Điều thực cần thiết chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh điều trị hiệu cho người bệnh 48 KẾT LUẬN Nghiên cứu áp dụng hồn thiện quy trình với điều kiện tối ưu cụ thể để thực kỹ thuật giải trình tự xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Nghiên cứu chưa phát đột biến exon 21 gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (GB) TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Central Brain Tumor Registry of the United States [http://www.CBTRUS.org] Thakkar JP, Dolecek T.A, Horbinski, et al (2014) Epidermiologic and molecular prognostic review of glioblastoma Cancer Epidemiol Biomarker Prevention 1985-1996 Kleihues P and Cavenee W.K (1997) Tumors of the central nervous system: pathology and genetics Lyon, France: Internalional Agency for Research on Cancer 32-36 Vedrana Milikovic, Jasna Bankovic, Miodag Rakic, et al (2013) Identification of novel genetic alterations in samples of malignant glioma patients DOI: 10.1371/journal.pone.0082108 Nguyễn Phong, Nguyễn Quang Hiển, Trương Văn Việt (2002) U não: đặc điểm dịch tễ học (tổng kết 1864 ca mổ có kết mô bệnh học Khoa PTTK Bệnh viện Chợ Rẫy, TP Hồ Chí Minh từ 1994-2000) Chuyên đề ngoại thần kinh Nhà xuất y học, 238-247 Dương Chạm Uyên, Dương Đại Hà, Lê Văn Trị (2003) Đặc điểm dịch tễ học phân loại mô bệnh học u não Hội nghị Ngoại thần kinh Việt-Úc lần thứ IV Bộ Y tế, 86-87 Dự án phòng chống ung thư giai đoạn 2008-2010 Bộ Y tế Hà Nội 04/2008, 8 Hiroko Ohgaki Paul Kleihues (2005) Epidemiology and etiology of gliomas 109, 93-108 Kiều Đình Hùng (2005) Nghiên cứu ứng dụng quang động học điều trị Gliome não ác tính Luận án tiến sỹ y học, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 10 Nguyễn Phúc Cương, Phạm Kim Bình (2010) Bài giảng tập huấn chuyên ngành giải phẫu bệnh Bộ quốc phòng cục quân Y – Bệnh viện Trung ương quân đội 108, Hà Nội 11 Nguyễn Phúc Cương (2001) Giải phẫu bệnh u thần kinh Bài giảng sau đại học Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 12 Figarella-Branger D, Colin C, Fernadez, et al (2008) Histological and molecular classification of gliomas Revue Neurologique, 164, 6-7 13 Bicknell R, Lewis C E, Gasparinig (1997) Pronostic and predictive value of intra–tumoral microvesseel density in human solid tumor Tumor angiogenesis, Oxford University press Inc, New York, 98-137 14 Russell, D S and Rubinstein (1989) L J Pathology of tumours of the nervous system London: Edward Arnold 15 Burton EC and Prados MD (2000) Malignant gliomas Curr Treat Options Oncol (5): 459-68 16 Hoàng Văn Đức (2014) Đánh giá kết phẫu thuật u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) Bệnh viện Việt Đức, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên, Thái Nguyên 17 Lurje G, Lenz H.J (2009) EGFR signaling and drug discovery Oncology 77 (6), 400-10 18 Wheeler D.L (2008) Mechanisms of acquired resistance to cetuximab: role of HER (ErbB) family member Oncogen 27, 3944-3956 19 Marmor M.D, Skaria K.B and Yarden (2004) Signal transduction an oncogenesis by ErbB / HER receptors 58, 903-913 20 Nguyễn Minh Hà (2014) Xác định đột biến gen EGFR Kras định tính đáp ứng thuốc điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội 21 Khuất Hữu Thanh (2006) Nguyên lý kỹ thuật gen Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.102-53 22 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử Nhà xuất Y học 23 Krishnan G, Felini M, Carozza S.E, et al (2003) Occupation and adult gliomas in the San Francisco Bay Area J Occup Environ Med, 45 (6), 639-647 24 Maire C.L and Ligon K.L (2014) Molecular pathologic diagnosis of epidermal growth factor receptor Neuro Oncol, 10, 1093 25 Therese A Dolecek, Jennifer M.Propp, Nancy E Stroup (2012) CBTRUS Statistical Report: Primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009 Oxford Journals, 14 26 Rebecca Siegel, Deepa Naishadham, Ahmedin Jemal (2013) Cancer Statistics 2013 A cancer jounal for clinicians, 63 (1), 11-30 27 Mitsudomi T., Kosaka T and Yatabe Y (2006) Biological and clinical implications of EGFR mutations in lung cancer Int J Clin Oncol, 11, 190-8 28 Elison G., Donald E., McWalter G et al (2010) A comparison of ARMS and DNAsequencing for mutation analysis in clinical biopsy samples J Exp Clin Cancer Res, 29, 132 PHỤ LỤC Danh sách bệnh nhân: STT Họ tên Tuổi Mã bệnh nhân Lê N 66 VD15-04443 Lê Thị H 70 VD15-00404 Nguyễn Đức D 49 VD14-17786 Nguyễn Xuân T 54 VD15-00764 Phạm Văn T 62 VD15-01158 Ngô Văn H 38 VD15-03676 Hoàng Thị Đ 65 VD15-04056 Phạm Thị Thuý N 38 VD15-03461 Nguyễn Tất M 32 VD15-03828 10 Nghiêm Xuân H 57 VD14-14163 11 Nguyễn Thị N 62 VD14-13886 12 Lê Thị L 59 VD14-12208 13 Trần Đình P 39 VD14-19190 14 Lường Văn D 50 VD14-14874 15 Phạm Hữu N 28 VD14-15155 16 Nguyễn Văn N 45 VD14-12869 17 Vũ Thị H 17 VD14-19988 18 Nguyễn Thị N 29 VD14-15557 19 Phạm Đình T 57 VD14-20146 20 Phạm Thị T 48 VD14-20657 ... với mục ti u: Hồn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Bước đ u nghiên c u xác định độ biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm 3 CHƯƠNG... bào thần kinh đệm lợp ống nội tủy U đám rối màng mạch U tế bào thần kinh đệm không rõ nguồn gốc U neuron u hỗn hợp neuron – tế bào đệm U nguyên bào thần kinh U nhu mô tuyến tùng U phôi thai U thần. .. gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, nghiên c u thực vừa nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen vừa phần làm rõ mối liên hệ đột biến exon 21 gen EGFR bệnh u nguyên bào thần