Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể có chức năng bảo vệ. Mặc dù chỉ gồm 2 lớp mô chuyên biệt với hai loại tế bào chủ yếu là nguyên bào sợi và tế bào sừng nhƣng việc tái tạo khi da bị tổn thƣơng vẫn còn là một thách thức [2],[8]. Các tấm tế bào da nuôi cấy hoặc vật liệu tƣơng đƣơng da chế tạo từ tế bào da nuôi cấy đã đƣợc ứng dụng trong điều trị bỏng, vết thƣơng mạn tính [6],[17],[18]… Mặc dù hạn chế đƣợc nguy cơ lây nhiễm nhƣng do khả năng tăng sinh có hạn và tính kích thích đào thải miễn dịch của tế bào cao nên chi phí giá thành vật liệu lớn làm hạn chế khả năng phổ biến ứng dụng trong điều trị. Hơn nữa, thành phần các loại vật liệu chỉ là nguyên bào sợi hoặc tế bào sừng nên còn thiếu rất nhiều các thành phần phụ của da nhƣ tế bào sắc tố, tế bào nang lông, tế bào tuyến bã... Việc khắc phục các hạn chế trên đang đƣợc kỳ vọng vào vai trò tác dụng của các tế bào gốc bởi chúng là những tế bào chƣa có chức năng chuyên biệt, chúng có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới. Tế bào gốc trung mô tồn tại trong tủy xƣơng, máu cuống rốn, dây rốn, mô liên kết của cơ thể và ở các khoảng kẽ của nhiều cơ quan [14],[42]. Các tế bào này có thể đƣợc nuôi cấy và nhân lên in vitro và dƣới các điều kiện thích hợp chúng có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào xƣơng, sụn, cơ và mỡ. Hiện nay, tế bào gốc trung mô đƣợc coi là dạng tế bào quan trọng cho công nghệ mô [26],[43]. Trong liền vết thƣơng, tế bào gốc trung mô đƣợc xác định là chúng biệt hóa thành các dạng tế bào da khác nhau. Tủy xƣơng là nguồn chính của tế bào gốc trung mô nhƣng vấn đề thu tủy xƣơng gặp khó khăn và số lƣợng ngƣới cho tủy xƣơng cũng hạn chế [14],[52]. Do sự tăng lên về tuổi tác, khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác nhau của tế bào gốc trung mô tủy xƣơng bị giảm đi và các tế bào cũng đặt ra câu hỏi về nguy cơ nhiễm virus [44]. Những vấn đề cần cân nhắc này đã hạn chế các ứng dụng lâm sàng của tế bào gốc trung mô tủy xƣong. Hơn nữa, cùng với sự tăng lên về tuổi tác của ngƣời cho, số lƣợng tế bào gốc trung mô trƣởng thành trong đó các tế bào gốc trung mô tủy xƣơng cũng bị giảm đi đáng kể. Các dữ liệu trƣớc đây đã chỉ ra rằng số lƣợng tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ở ngƣời 80 tuổi giảm đi 200 lần so với trẻ mới sinh [45],[63]. Việc tìm kiếm các tế bào gốc trung mô từ nguồn mô khác đã đƣợc quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Dây rốn là mô mềm có chiều dài lớn và là cầu nối giữa thai và bánh nhau để trao đổi oxy, dinh dƣỡng…cho thai. Tế bào gốc đa năng đã đƣợc phát hiện và tách từ những phần khác nhau của dây rốn. Các nghiên cứu phôi thai học và kháng nguyên bạch cầu ngƣời (Human Leukocyte Antigen – HLA) của các tế bào từ dây rốn cho thấy chúng có nguồn gốc từ thai nhi chứ không phải từ ngƣời mẹ [1],[57]. Mô dây rốn là sản phẩm thải sau khi sinh và là một nguồn tƣơng đối dƣ thừa. Sự thu hồi mô cũng dễ dàng và không bị ảnh hƣởng cúa các vấn đề về đạo đức và luật pháp [14],[109]. Năm 2004, tế bào gốc trung mô phân lập đƣợc từ màng dây rốn. Các tế bào này sau khi phân lập và nuôi cấy duy trì, cấy chuyền 3 đến 5 lần trong môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng chƣa hề bị biệt hoá, vẫn giữ đƣợc đầy đủ đặc tính của TBG ban đầu mới phân lập [58],[59], [60],[61]. Từ những cơ sở lý luận trên, cùng với nhu cầu thực tiễn điều trị bỏng - vết thƣơng, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm các mục tiêu: 1. Đánh giá một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mô màng dây rốn. 2. Đánh giá hiệu quả ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn trong điều trị vết thương bỏng nhiệt thực nghiệm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QN Y PHAN MINH HỒNG NGHIÊN CỨU BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN NGƯỜI ĐỂ ĐIỀU TRỊ VẾT THƯƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM Chuyên ngành Mã số : Ngoại bỏng : 62.72.01.28 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI, 2014 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình Danh mục ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 QUÁ TRÌNH LIỀN VẾT THƢƠNG, VẾT BỎNG 1.1.1 Diễn biến lâm sàng vết thƣơng, vết bỏng sâu 1.1.2 Các tế bào chủ yếu tham gia liền vết thƣơng 1.2 GHÉP TẾ BÀO ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG 12 1.2.1 Vật liệu tƣơng đƣơng trung bì có tế bào 12 1.2.2 Vật liệu tƣơng đƣơng biểu bì có tế bào 13 1.2.3 Vật liệu tƣơng đƣơng da hai lớp có tế bào 14 1.3 TẾ BÀO GỐC, TIỀM NĂNG VÀ ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC 16 1.3.1 Tế bào gốc, đặc tính phân loại tế bào gốc 16 1.3.2 Ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh 19 1.3.3 Các tiềm ứng dụng tế bào gốc 21 1.3.4 Biệt hóa tế bào gốc thành tế bào da dùng điều trị vết thƣơng 24 1.4 DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO GỐC PHÂN LẬP TỪ MÀNG DÂY RỐN 28 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 33 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 33 2.2.1 Mẫu mô dây rốn 33 2.2.2 Hóa chất chủ yếu dùng nghiên cứu 34 2.2.3 Các vật tƣ tiêu hao chủ yếu 35 2.2.4 Các thiết bị dụng cụ chủ yếu 35 2.2.5 Các giá đỡ để tạo vật liệu tƣơng đƣơng trung bì 36 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.3.1 Các phƣơng pháp nghiên cứu phân lập, ni cấy biệt hóa tế bào 36 2.3.2 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu ghép tế bào điều trị vết thƣơng thực nghiệm 47 2.4 XỬ LÝ SỐ LIỆU 55 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56 3.1 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP, NI CẤY BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ MÀNG DÂY RỐN 56 3.1.1 Đặc điểm phân lập tế bào gốc trung mô dây rốn 56 3.1.2 Biểu kháng ngun hòa hợp tổ chức tính sinh miễn dịch tế bào gốc trung mô dây rốn 62 3.1.3 Khả biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành nguyên bào sợi .67 3.2 HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MÀNG DÂY RỐN TRONG ĐIỀU TRỊ VẾT THƢƠNG BỎNG NHIỆT THỰC NGHIỆM 76 3.2.1 Thay đổi số số toàn thân xét nghiệm thỏ ghép tế bào gốc trung mô 76 3.2.2 Ảnh hƣởng ghép tế bào gốc trung mô tới liền vết thƣơng 79 3.2.3 Vi khuẩn học vết thƣơng bỏng thực nghiệm 88 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 92 4.1 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LẬP NUÔI CẤY, BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ MÀNG DÂY RỐN 92 4.1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô màng dây rốn 92 4.1.2 Một số đặc tính tế bào gốc trung mơ dây rốn 94 4.1.3 Biệt hóa tế bào gốc trung mô dây rốn thành dạng nguyên bào sợi 97 4.2 HIỆU QUẢ GHÉP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ ĐIỀU TRỊ VẾT BỎNG THỰC NGHIỆM 101 4.2.1 Mơ hình nghiên cứu ghép tế bào gốc trung mô dây rốn 101 4.2.2 Tác động ghép tế bào gốc trung mơ q trình liền vết thƣơng thực nghiệm 102 4.2.3 Những ảnh hƣởng bất lợi ghép vật liệu tƣơng đƣơng trung bì đến tình trạng tồn thân nhiễm khuẩn vết thƣơng 113 KẾT LUẬN 117 KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BC Bạch cầu BM Biểu mô CLMC Cord lining messenchymal cell TT (Tế bào gốc trung mô màng dây rốn) CT Công thức D0 Ngày bắt đầu nghiên cứu D5, D10 Ngày nghiên cứu thứ 5, thứ 10 DT Diện tích ĐVDT Đơn vị diện tích GF Growth factor (Yếu tố tăng trƣởng) 10 HC Hồng cầu 11 HLA Human leukocyte antigens (Kháng nguyên hòa hợp mô) 12 MI Mitose index (Chỉ số phân bào) 13 NBS Fibroblast (Nguyên bào sợi ) 14 SL Số lƣợng 15 TB Tế bào 16 TBG Tế bào gốc 17 TBGTM Tế bào gốc trung mô 18 TBGTMDR Tế bào gốc trung mô màng dây rốn 19 TBS Keratinocyte (Tế bào sừng) 20 TBV Tế bào viêm 21 VK Vi khuẩn 22 VT Vết thƣơng DANH MỤC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 3.1 Tỷ lệ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm xử lý cấy mô 56 3.2 Thời gian tế bào tách khỏi mẫu mô đạt 50% che phủ 57 3.3 Khả tạo colony tế bào gốc trung mô P2 60 3.4 Tỷ lệ % hình dạng tế bào biệt hóa qua hệ tế bào 67 3.5 Phân tích hình thái nhận xét biến đổi hình thái tế bào q trình biệt hóa qua hệ tế bào 68 3.6 Tỷ lệ % hình dạng nhân tế bào biệt hóa 70 3.7 Hàm lƣợng collagen hòa tan (µg/ml) 72 3.8 Thay đổi số huyết học thỏ nghiên cứu 77 3.9 Thay đổi số sinh hoá máu liên quan chức thận 78 3.10 Hoạt độ enzym GOT, GPT huyết 78 3.11 Diễn biến lâm sàng vết thƣơng bỏng thực nghiệm 79 3.12 Thay đổi diện tích vết thƣơng bỏng 80 3.13 Tốc độ liền vết thƣơng 80 3.14 Liên quan thời gian số vết thƣơng liền hoàn toàn 81 3.15 Diện tích vùng biểu mơ hóa sau liền 81 3.16 Đặc điểm hình thái cấu trúc mô vết thƣơng thời điểm 84 3.17 Thay đổi số lƣợng tế bào viêm mô vết thƣơng 85 3.18 Thay đổi số lƣợng nguyên bào sợi mô vết thƣơng 85 3.19 Thay đổi số lƣợng tân mạch mô vết thƣơng 86 3.20 Thay đổi số phân bào lớp mầm mô vết thƣơng 86 3.21 Tần xuất xuất vi khuẩn qua thời điểm nghiên cứu 88 3.22 Thay đổi mật độ Số lƣợng vi khuẩn vết thƣơng 90 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên Biểu đồ Trang 3.1 Thời gian tế bào mọc khỏi mẫu mô thời gian thu tế bào 57 3.2 Kết phân tích flowcytometry mức độ biểu HLA-DR TBGTM màng dây rốn 63 3.3 Phát kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên siêu nghiền xét nghiệm ELISA 64 3.4 Phát kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên tế bào nguyên vẹn 65 3.5 So sánh khả phát kháng thể thỏ kháng tế bào gốc với kháng nguyên tế bào siêu nghiền tế bào nguyên vẹn 66 3.6 Thay đổi cân nặng thỏ nghiên cứu 76 3.7 Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng nghiên cứu (Vùng A) 89 3.8 Chủng loại vi khuẩn vết thƣơng vùng đối chứng (Vùng B) 89 3.9 Thay đổi số lƣợng vi khuẩn vết bỏng 91 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Trang Sự tăng sinh nguyên bào sợi giai đoạn khác trình liền vết thƣơng 11 1.2 Các loại tế bào gốc theo nguồn gốc thời điểm phân lập 18 1.3 Khả nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc 21 1.4 Khả ứng dụng trị liệu tế bào gốc 22 1.5 Khả biệt hóa tế bào gốc tủy xƣơng 23 1.6 Khả ứng dụng trị liệu tế bào gốc mỡ 23 1.7 Dây rốn, mô kết nối ngƣời mẹ thai nhi 28 1.8 Nguồn lấy tế bào gốc dây rốn 30 2.1 Cấu trúc mô dây rốn 38 2.2 Dụng cụ gây bỏng thực nghiệm thỏ 49 DANH MỤC ẢNH Ảnh Tên ảnh Trang 3.1 Tế bào mọc khỏi mẫu mô ngày thứ 10 sau cấy mô 58 3.2 Tế bào mọc khỏi mẫu mô sau 14 ngày cấy mô 58 3.3 Hình ảnh nhân bào tƣơng bình thƣờng tế bào trung mô tách khỏi mô dây rốn 59 3.4 Các colony có từ 3-5 tế bào đƣợc quan sát sớm vào ngày thí nghiệm thứ 05 61 3.5 Các colony tế bào gốc trung mô màng dây rốn tạo nên vào ngày thí nghiệm tạo thứ 20 61 3.6 Kháng nguyên HLA-G HLA-E có dịch nghiền tế bào gốc trung mô màng dây rốn đƣợc phát kỹ thuật western blot 62 3.7 Biến đổi hình thái tế bào ngày thứ q trình biệt hóa 67 3.8 Biến đổi hình thái tế bào 69 3.9 Hình dạng tế bào bào tƣơng tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi, tế bào dạng hình thoi, dài 70 3.10 Hình dạng nhân bào tƣơng tế bào biệt hóa dạng nguyên bào sợi Tế bào dạng hình thoi, dài nhân hình trứng 71 3.11 Hình thái siêu cấu trúc ảnh tế bào biệt hóa 71 3.12 Tế bào mọc thành hai lớp đan chéo ngày thứ 73 3.13 Duy trì mơi trƣờng nuôi cấy tuần 74 3.14 Hình ảnh đại thể vật liệu tƣơng đƣơng trung bì 75 3.15 Vết bỏng sâu ngày thứ sau bỏng đƣợc cắt lọc hoại tử, chuẩn bị ghép tế bào gốc trung mô 82 3.16 Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 82 Ảnh Tên ảnh Trang 3.17 Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 15 83 3.18 Vết bỏng ngày nghiên cứu thứ 20 83 3.19 Hình thái cấu trúc mơ vết thƣơng vùng A trƣớc ghép tế bào 87 3.20 Vết thƣơng vùng A ngày nghiên cứu thứ 87 3.21 Mô vết thƣơng vùng A ngày nghiên cứu thứ 10 88 117 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mơ màng dây rốn để điều trị vết thƣơng bỏng thực nghiệm rút số kết luận sau: Một số đặc điểm phân lập nuôi cấy, biệt hóa tế bào gốc trung mơ màng dây rốn - Tế bào phân lập từ màng dây rốn mọc đơn lớp điều kiện ni cấy in vitro có khả tạo cụm Cụm tế bào gốc trung mô dạng CFU-F (Collony Forming Unit – Fibroblast) Các collony xuất sớm vòng 05 ngày thí nghiệm Tỷ lệ colony tập hợp số tế bào tách khỏi mẫu mô đạt cao, thấp 66% cao 77% - Tế bào gốc trung mơ dây rốn có đặc tính sinh miễn dịch thấp Các tế bào có bộc lộ phân tử HLA-G HLA-E nhƣng không lộ rõ HLADR, mức độ biểu HLA-DR 1,9 ± 1,55% Kháng thể đặc hiệu kháng tế bào gốc trung mô thỏ đƣợc ghép thấp giảm dần từ ngày thứ 30 sau ghép Vào ngày thứ 15 sau ghép tế bào, mật độ quang học phát kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt tế bào với hiệu giá kháng thể 1/100 0,0969, với kháng nguyên bao gồm nội bào ngoại bào 0,12478 Hiệu giá kháng thể giảm dần ngày thứ 30 60 sau ghép tế bào gốc trung mô - Tế bào gốc trung mơ dây rốn cảm ứng để biệt hóa thành ngun bào sợi mơi trƣờng định hƣớng in vitro Trong môi trƣờng định hƣớng, tế bào gốc trung mơ thay đổi dần hình thái chức Mức collagen typ I tế bào cảm ứng tổng hợp 2,97 ± 0,011 µg/ml 118 Ghép tế bào gốc trung mô màng dây rốn mô hình vết thƣơng bỏng an tồn có tác dụng tích cực điều trị vết thƣơng - Tế bào gốc trung mơ màng dây rốn có tác dụng thúc đẩy nhanh trình liền vết thƣơng Ngày nghiên cứu thứ 10, vết thƣơng ghép tế bào gốc trung mơ có 77,44% diện tích vết thƣơng liền, vùng đối chứng khơng ghép tế bào 68,76%, tƣơng ứng với tốc độ liền vết thƣơng vùng ghép tế bào 1,41cm2/ngày vùng đối chứng 1,25cm2/ngày với p=0,001 Chỉ số phân bào vùng ghép tế bào gốc trung mô 2,47% vùng đối chứng 1,86% với p = 0,01 Số lƣợng nguyên bào sợi 67,01/ĐVDT, số lƣợng tân mạch 7,23/ĐVDT, cao sơ với ngày nghiên cứu thứ có ý nghĩa thống kê với p