Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K44 CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Văn Hạnh Phịng Cơng nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp với nỗ lực cá nhân, nhận hướng dẫn, giúp đỡ, bảo động viên thầy cô, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: TS Nguyễn Văn Hạnh, Th.S Vi Đại Lâm, Th.S Đỗ Trung Kiên Th.S Lê Bắc Việt, người trực tiếp giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực đề tài q trình hồn chỉnh luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy cô khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, anh chị làm việc phịng Cơng nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè động viên, chia sẻ giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Đình Duy Khanh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 15 Bảng 3.2: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P2 tạo đoạn gene P1-2 18 Bảng 3.4: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P5-6 20 Bảng 3.5:Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P5 P6 để tạo đoạn gene P5-6 21 Bảng 3.6: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-2 P5-6 21 Bảng 3.7: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-6 22 Bảng 3.8: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 P6 để tạo đoạn P1-6 23 Bảng 3.9: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P3-4 23 Bảng 3.10: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P3 P4 để tạo đoạn P3-4 24 Bảng 3.11: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt sản phẩm tinh PCR đoạn gene P1-6 P3-4 24 Bảng 3.12: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt vector pTet-Dual OFF hai enzyme BamHI HindIII 25 Bảng 3.13: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt P16-34 pTRE-Tight-BI hai enzyme BamHI HindIII 26 Bảng 3.14: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 Bảng 3.15: Chu trình nhiệt PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 27 Bảng 3.16: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt DNA plasmid pTet-Dual OFF sản phẩm PCR pTRE-Tight-BI hai enzyme PspXI XhoI 28 Bảng 3.17: Tỉ lệ thành phần PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp 30 Bảng 3.18: Tỉ lệ thành phần phản ứng nối sau cắt enzyme cắt 32 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc vector pTet-Dual-OFF (Catalog No 631113) Hình 2.2: Cơ chế hoạt động pTet-Dual-OFF Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No 631068) Hình 4.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết tinh DN muỗi Aedes aegypti 33 Hình 4.2a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P1-2 34 Hình 4.2b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P1-234 Hình 4.3a: Kết giải trình tự đoạn gene P1-2 35 Hình 4.3b: Kết so sánh giải trình tự đoạn gene P1-2 với đoạn gene Tra-2 RNAi35 Hình 4.4a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 Hình 4.4b: Kết tinh sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 36 Hình 4.5a: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 37 Hình 4.5b: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh sau PCR đoạn gene P5-6 37 Hình 4.6a: Kết điện di sản phẩm cắt P1-2 P5-6 enzyme SalI 38 Hình 4.6b: Kết điện di sản phẩm tinh P1-2 P5-6 sau cắt enzyme SalI 38 Hình 4.7: Kết điện di sản phẩm cắt P3-4 P5-6 Acc65I 39 Hình 4.8a: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P1-2 P5-6 40 Hình 4.8b: Kết điện di sản phẩm nối đoạn P3-4 P5-6 40 Hình 4.9a: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 enzyme HindIII Acc65I41 Hình 4.9b: Kết điện di sản phẩm cắt pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I 41 Hình 4.10a: Kết tinh sản phẩm cắt vector pJET P1-6 pJET P3-4 enzyme HindIII Acc65I 42 Hình ảnh 4.10b: Kết tinh sach DNA plasmid pJET P16-34 sau biến nạp 42 iv Hình 4.10c: Kết điện di sản phẩm pJET P16-34 sau cắt enzyme HindIII BamHI 43 Hình 4.10d: Kết tinh đoạn P16-34 (Tra-2 RNAi) sau cắt HindIII BamHI từ DNA plasmid pJET P16-34 43 Hình 4.11a: Kết kiểm tra sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI pJET p1634 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.11b: Kết tinh sản phẩm cắt vector pTRE-Tight-BI P16-34 enzyme BamHI HindIII 44 Hình 4.12a: Kết biến nạp vector pTRE-Tight-BI P16-34 tạo vector pTRETight-BI-P16-34 vào tế bào khả biến E.coli DH5α 45 Hình 4.12b: Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE-TightBI-P16-34 45 Hình 4.13: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh DNA plasmid pTRE-TightBI-P16-34 sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 enzyme BamHI HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 46 Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli mang vector pTet-Dual OFF 47 Hình 4.14b: Kết điện di tinh DNA plasmid pTet-Dual OFF 47 Hình 4.15: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt vector pTet-Dual OFF BamHI XhoI 47 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Ampr Kháng kháng sinh Ampicillin Bp Base pair – Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid Dox Doxycyline E.coli Escherichia coli Kb Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB Lauria Broth miRNA Micro Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid– RNA thông tin MSC I Multiple cloning site I MSC II Multiple cloning site II PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp RIDL Release of Insects carrying a Dominant Lethal RNA Ribonucleic Acid RNAi Interference Ribonucleic Acid– RNA can thiệp SIRM Sterile Insect Release Method SiRNA Smal interfering Riboncleic Acid SIT Sterile Insect Techmique – Kĩ thuật vô trùng côn trùng TAE Tris-acetate-EDTA Tet Tetracyline Tet-OFF pTet-Dual OFF tTA Tetracycline-repressible transactivato Tra-2 RNAi Transformer-2 Interference Ribonucleic Acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: 1.2 Mục tiêu nghiên cứu: 1.3 Mục đích nghiên cứu: 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiến đề tài: 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học 2.1.1 Bối cảnh thực ý tưởng đề tài 2.1.2 Genee biểu tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti ( Transformer-2 RNAi) 2.1.3 Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) 2.1.4 Vector pTRE-Tight-BI 2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 2.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 11 2.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 13 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 13 3.2 Vật liệu nghiên cứu 13 3.2.1 Hóa chất 13 3.2.2 Thiết bị 15 3.2.3 Vật liệu 15 vii 3.3 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 16 3.4 Nội dung nghiên cứu 16 3.5 Phương pháp nghiên cứu 16 3.5.1 Tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 16 3.5.2 PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 17 3.5.3 Thiết kế vector pTet-Dual-OFF mang gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc) 25 3.5.4 Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến để chọn dịng, ni sinh khối tách DNA plasmid 28 3.5.5 Phương pháp nối Kit Ligation (M0202) 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 33 4.2 Kết PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 33 4.3 Kết thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti vào vector 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 I Tài liệu Tiếng Việt 49 II Tài liệu Tiếng Anh 50 III Tài liệu Internet 50 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề: Trên giới, theo Tổ chức Y tế giới (WHO), ước tình năm có khoảng 2,5 – tỷ người có nguy mắc bệnh muỗi truyền nhiễm sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue), đặc biệt cuối năm 2015 đầu 2016 đến suất bệnh virus Zika Trong 50- 100 triệu người mắc bệnh muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh muỗi Aedes aegypti phải điều trị, 90% trẻ em 15 tuổi, tỉ lệ tử vong muỗi Aedes aegypti 5% Bệnh lưu hành nhiều vùng Đơng Nam Á Thái Bình Dương 100 nước thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới [8], [1] Hiện Việt Nam nước có bệnh dịch lưu hành, bệnh chiếm tỉ lệ cao bệnh truyền nhiễm Việt Nam, nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ tình trạng tải cho bệnh viện mùa dịch Từ năm 1960 đến dịch có xu hướng lan rộng phát triển Ở Tây Nguyên năm có dịch lớn 1983, 1987,1988, 1991, 1995 2004 với số mắc từ 54,80 đến 553,38/100.000 dân số chết từ 0,08 – 1,34/100.000 dân [6], [4], [5],[3] Năm 2008, tỉnh phía Nam, 78.414 trường hợp mắc, 85 trường hợp chết, tỉnh Cà Mau có số bệnh nhân 8.284, tử vong trường hợp [20] Năm 2009 nước có số bệnh nhân chết 105.370/87 [21] Để giải vấn đề trên, nhiều hướng nghiên cứu thử nghiệm áp dụng Các nhà khoa học giới thành công việc tạo muỗi biến đổi gene kĩ thuật DNA tái tổ hợp Những muỗi đực biến đổi gene thả ngồi mơi trường giao phối với muỗi tự nhiên tạo hệ muỗi bị khiếm khuyết chết trước trưởng thành [19], [20] Các nhà khoa học Mỹ Đại học Rocckefeller nghiên cứu tạo muỗi biến đổi gene không phát mùi người, hạn chế q trình lây truyền bệnh tật qua lồi trung gian [19] Ở Việt Nam nay, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp khơng cịn vấn mẻ, có nhiều cơng trình nghiên cứu áp dụng Công nghệ Sinh học để tạo sinh vật biến đổi gene nhằm tạo sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn Xuất phát từ tính cấp thiết bệnh nguy hiểm lây truyền qua muỗi ... NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET -OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy... đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 17 3.5.3 Thiết kế vector pTet-Dual -OFF mang gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc)... 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Kết tách chiết tinh DNA muỗi Aedes aegypti 33 4.2 Kết PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính muỗi Aedes aegypti 33 4.3 Kết thiết