ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN VĂN TỤNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CYTOCHROME P450 TỪ DNA METAGENOME SUỐI NƯỚC NÓNG BÌNH CHÂU Chun ngành: Cơng nghệ nano sinh học Mã số: Chun ngành đào tạo thí điểm TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 MỞ ĐẦU Cytochrome P450 (P450) họ enzyme phân bố rộng rãi đa dạng nhất, đóng vai trò quan trọng nhiều đường chuyển hóa vật chất thể tự nhiên P450 có mặt hầu hết giới hệ thống sinh vật học, đa dạng cấu trúc chức năng, chí P450 lồi có cấu trúc, chức tính chất khác nhau, đặc biệt tính đặc hiệu chất Chính P450 ứng dụng rộng rãi tất lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, môi trường, y dược… Để đáp ứng yêu cầu quy trình sản xuất số sản phẩm sinh học quy mô công nghiệp thực phản ứng nhiệt độ cao, có mặt số loại dung mơi đòi hỏi enzyme tham gia vào quy trình phải có tính chất đặc biệt bền nhiệt, chịu dung mơi, chịu áp… Vì vậy, việc tìm kiếm P450 bền nhiệt từ tự nhiên gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt P450 đặc biệt quan tâm nghiên cứu Các enzyme bền nhiệt thường thu nhận từ vùng địa nhiệt suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí… Một lợi Việt Nam có mạng lưới ba trăm suối nước nóng vơ phong phú, trải dài từ Bắc tới Nam Tuy nhiên, nghiên cứu đánh giá khu hệ vi sinh vật ưa nhiệt suối nước nóng để thấy tiềm vai trò chúng hệ sinh thái người hạn chế Cho đến nay, nghiên cứu vi sinh vật ưa nhiệt hệ enzyme chúng nghiên cứu Việt Nam, chủ yếu tập trung vào nhóm vi sinh vật phân lập hệ enzyme thủy phân chúng amylase, protease, cellulase… Mặt khác, suối nước nóng thường có số lượng vi sinh vật thấp, 0,1% tổng số vi sinh vật phân lập trực tiếp phương pháp truyền thống Kỹ thuật metagenomic đời cho phép nhà nghiên cứu tiếp cận sâu với hệ gen vi sinh vật không thông qua ni cấy Trong năm gần có nhiều công bố khai thác gen mới, protein/enzyme vi sinh vật nhờ kỹ thuật Chính vậy, nghiên cứu chúng tơi đặt mục tiêu tìm kiếm gen mã hóa cho cytochrome P450 từ suối nước nóng Bình Châu – suối nước nóng có nhiệt độ nóng Việt Nam với hy vọng tìm thấy P450 bền nhiệt kỹ thuật không nuôi cấy Để thực mục tiêu này, thực nội dung nghiên cứu sau: - Thu nhận, tách chiết DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu, giải trình tự xây dựng sở liệu nhóm gen mã hóa cho P450 - Biểu gen mã hóa P450 mới, tinh nghiên cứu số tính chất P450 tái tổ hợp - Nghiên cứu hệ thống truyền điện tử xác định phổ chất tiềm enzyme thu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 Cytochrome P450 (P450) họ enzyme lớn nhất, đóng vai trò quan trọng số đường chuyển hóa vật chất thể tự nhiên P450 có mặt hầu hết giới hệ thống sinh vật học: vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật Các P450 monooxygenase bên ngồi, đó, chúng cần chất cho điện tử để khởi động q trình oxi hóa hydroxyl hóa chất sơ đồ phản ứng sau: RH + O2 + NAD(P)H + H+  ROH + H2O + NAD(P)+ Số lượng gen mã hóa cho P450 tất loài hệ thống sinh vật học khoảng 37.000 trình tự cơng bố Ngân hàng gen số lượng tiếp tục tăng lên nhóm nghiên cứu tìm gen P450 loài sinh vật khác 1.1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 vi sinh vật Với đặc trưng tốc độ phản ứng nhanh, có khả hòa tan biểu tế bào E coli nên enzyme P450 vi khuẩn thu hút quan tâm nghiên cứu nhóm nhà khoa học dựa vào hệ enzyme P450 vi khuẩn để phát triển mơ hình chuyển hóa sinh học tự nhiên để nghiên cứu cấu trúc chức hệ enzyme P450 loài eukaryote P450 vi sinh vật đóng vai trò quan trọng việc chuyển hóa chất khác sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng tái tạo môi trường, dược phẩm nông nghiệp Các xạ khuẩn thường mang gen P450 thuộc CYPome (cytochrome P450 complement) tham gia vào q trình sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên ứng dụng y dược Mặc dù số lượng P450 vi sinh vật không ngừng tăng lên, nhiên nhà khoa học dự đoán nhiều P450 từ vi sinh vật tồn tự nhiên chưa khai thác, đặc biệt vùng có hệ sinh thái môi trường cực trị mà thu nhận vi sinh vật enzyme cách nuôi cấy thông thường 1.1.2 Hệ thống truyền điện tử P450 Vì P450 monooxygenase bên ngồi, chúng cần chất cho điện tử để khởi động chuỗi truyền điện tử chuyển hóa chất Các P450 có hệ thống truyền điện tử thuộc nhóm II đại diện cho P450 thuộc nhóm eukaryote Hệ thống monooxygenase nhóm tìm thấy mạng lưới nội chất (ER) tế bào eukaryote bao gồm hai protein liên kết màng: P450 reductase phụ thuộc NADPH (Hình 1C) Reductase chứa nhóm FAD FMN, đóng vai trò truyền điện tử từ NADPH tới isozyme P450 Hình 1.1: Sơ đồ số hệ thống truyền điện tử điển hình nhóm P450 A) Hệ thống P450 vi khuẩn (Nhóm Ia); B) Hệ thống P450 ty thể (Nhóm Ib); C) Hệ thống P450 tế bào (Nhóm II); D) Hệ thống tự xúc tác CYP102A1 (Nhóm VIII) 1.1.3 Hệ enzyme cytochrome P450 bền nhiệt vi sinh vật Một số tiêu chí enzyme triển khai quy mơ cơng nghiệp tính bền, có tính bền nhiệt Tuy nhiên, không ổn định P450 điều kiện sản xuất công nghiệp nhiệt độ cao, xúc tác có mặt dung môi hạn chế ứng dụng hệ enzyme quy mơ sản xuất lớn Chính vậy, việc tìm kiếm P450 bền nhiệt từ tự nhiên gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt P450 biết quan tâm nghiên cứu Cho đến nay, có enzyme P450 bền nhiệt thu nhận từ chủng cổ khuẩn phân lập tự nhiên bao gồm CYP119A1, CYP119A2, CYP175A1, CYP231A2 CYP154H1 công bố Từ kết nghiên cứu Thế giới thấy số lượng P450 bền nhiệt từ nhóm vi sinh vật hạn chế có tiềm ứng dụng cơng nghiệp lớn Chính việc tìm kiếm, khai thác để thu nhận, nghiên cứu cấu trúc, tính chất ứng dụng P450 bền nhiệt từ tự nhiên cần thiết có ý nghĩa 1.1.4 Ứng dụng cytochrome P450 Các P450 tham gia xúc tác nhiều loại phản ứng sinh hóa khác nhau, ứng dụng họ enzyme rộng rãi Quá trình gắn nhóm hydroxyl vào chất họ enzyme P450 thường dẫn đến việc thay đổi tính chất chất thay đổi tính hòa tan, tính đặc hiệu độc tính Do họ enzyme thường sử dụng để tổng hợp hợp chất hữu khó thu nhận đường hóa học để phân giải chất hữu khó phân hủy ngồi mơi trường nhiễm Bên cạnh hợp chất steroid, P450 vi khuẩn sử dụng để xúc tác trình tổng hợp hợp chất axit epoxyeicosatrienoic, leukotoxin B epoxide eicosanoid khác 1.2 Kỹ thuật metagenomic trình khai thác gen Kỹ thuật metagenomic sử dụng lần Jo Handelsman cộng Metagenomic định nghĩa ứng dụng kỹ thuật di truyền nghiên cứu hệ sinh thái vi sinh vật trực tiếp từ môi trường sống mà không cần phân lập riêng rẽ chủng kỹ thuật truyền thống, phương pháp phân tích hệ gen quần xã vi sinh vật Kỹ thuật metagenomic nghiên cứu metagenome quần xã sinh vật thông qua ba bước chính, bao gồm: (i) tách chiết nucleic acid từ mẫu thu thập; (ii) thiết lập thư viện metagenome giải trình tự DNA metagenome sử dụng thiết bị giải trình tự hệ mới; (iii) phân tích, sàng lọc gen kỹ thuật tin sinh học phân lập gen dựa vào số liệu giải trình tự, qua tạo tiền đề cho việc tách dòng biểu gen Các liệu metagenome phân tích hiệu sử dụng cơng cụ tin sinh học 1.3 Khai thác DNA metagenome công cụ tin sinh Tin sinh học lĩnh vực khoa học sử dụng công nghệ ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính tốn sinh học để giải vấn đề sinh học Máy giải trình tự hệ tạo đoạn trình tự đọc ngắn thơng qua phản ứng tổng hợp song song tạo lượng lớn liệu thí nghiệm, bên cạnh giảm đáng kể chi phí giải trình tự Tuy nhiên, đoạn đọc hệ thống tạo ngắn nhiều so với hệ máy đầu tiên, nên cần độ bao phủ cao để thỏa mãn tiêu chí xác định chồng lặp Thuật toán lắp ráp de novo ứng dụng xây dựng để đáp ứng thách thức tồn liệu giải trình tự Rất nhiều thuật tốn lắp ráp de novo thực thi, loại có tiên đề, điểm mạnh yếu riêng Mỗi chương trình lắp ráp mang tính chất đặc thù riêng, nhiên chúng có sở chung tất giải phức tạp liệu giải trình tự hệ Dữ liệu thô Tiền xử lý Dữ liệu tinh Lắp ráp Contigs Dự đoán gene Genes Phân lồi sinh thái Chú giải chức Hình 1.2: Quy trình xây dựng phân tích hệ gen từ liệu giải trình tự Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu - Mẫu nước thu từ suối nước nóng Bình Châu 2.1.2 Vi sinh vật - Chủng Escherichia coli TOP10F’ (sử dụng thí nghiệm nhân dòng gen) - Chủng Escherichia coli C43(DE3) (sử dụng thí nghiệm biểu gen) - Chủng Escherichia coli BL21(DE3) (sử dụng thí nghiệm biểu gen) - Chủng Escherichia coli JM109(DE3) (sử dụng thí nghiệm biểu gen) 2.1.3 Vector - Vector pUC19 gắn gen tổng hợp nhân tạo trình tự đoạn ORF denovo_35152 (ký hiệu P450-T2) (Phù Sa Biochem Ltd.) - Vector pET17b (Novagen, USA) 2.1.4 Mồi sử dụng - 35152f: gatcCATatgggccttggcagcttcca - 35152f: gatcAAGCTTAGTGGTGATGGTGATGATGctgggccttgagctgcagca Cặp mồi đặt Phù sa Biochem Ltd (Việt Nam) 2.1.5 Các môi trường sử dụng Môi trường LB (g/L): Peptone Cao nấm men NaCl Bacto Tryptone 12 Cao nấm men Glycerin ml H2O 900 mL Môi trường TB (g/L) Sau khử trùng, bổ sung 100 ml: K2HPO4 0,72 M KH2PO4 0,17 M Môi trường SOC (g/L) Bacto Tryptone 20 Cao nấm men NaCl 0,5 H2O 980 mL Sau khử trùng bổ sung 20 ml dung dịch glucose 1M vô trùng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 2.2.1.1 Tách chiết DNA metagenome Quy trình tách chiết thực theo kit PowerWater® DNA Isolation DNA metagenome kiểm tra chất lượng cách chạy điện di gel agarose 0,8% Nồng độ độ tinh DNA xác định máy quang phổ NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) bước sóng 260 280 nm Độ tinh DNA đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280 Protein coi sạch, đủ chất lượng cho thí nghiệm tỷ lệ nằm khoảng 1,8 ÷ 2,0 2.2.1.2 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu DNA metagenome khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu gửi giải trình tự thiết bị giải trình tự hệ Hiseq Illumina công ty BGI (Hongkong) Dữ liệu sau đọc trình tự lưu dạng file fasstq 2.2.1.3 Thiết kế mồi Mồi khuếch đại gen thiết kế dựa sở liệu bao gồm trình tự gen mã hóa cytochrome P450 bền nhiệt khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu Các cặp mồi tổng hợp cơng ty sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ) 2.2.1.4 Khuếch đại gen P450-T2 Đoạn khung đọc mở gen nhân tạo P450-T2 khuếch từ vector pUC19 mang đoạn gen Thành phần phản ứng cho tổng thể tích 50 µl sau: 5X Phusion HK Buffer Mồi 35152f (10 pmol) Mồi 35152r (10 pmol) Khuôn pUC19-T2 (10 ng) mM dNTPs DMSO Phusion polymerase dH2O Phản ứng thực điều kiện sau: 98oC 30 s o 98 C 10 s o 60 C 10 s 35 chu kỳ o 72 C 20 s 72oC o 10 C  10 µl µl µl 2,5 µl µl 1,5 µl 1,5 µl 29,5 µl Sản phẩm PCR chạy kiểm tra gel agarose 0,8% làm theo hướng dẫn nhà sản xuất Kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher Scientific) 2.2.1.5 Chuẩn bị tế bào Escherichia coli khả biến xung điện Một khuẩn lạc E coli hoạt hóa lại đĩa mơi trường LB thạch lựa chọn để cấy vào 10 ml môi trường LB lỏng Nuôi vi khuẩn qua đêm 37oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút Hơm sau, dịch tế bào chuyển vào bình tam giác thể tích L chứa L môi trường LB với tỷ lệ giống 1% tiếp tục ni 37oC, lắc 200 vòng/phút OD600 đạt 0,4-0,6 Đặt bình ni tế bào vào đá 15 phút trước ly tâm thu tế bào tốc độ 4000 vòng/phút, 4oC 15 phút Cặn tế bào rửa nước cất vô trùng lạnh lần 20 ml dung dịch 10% glycerol lạnh Ly tâm thu cặn tế bào tốc độ 4000 vòng/phút, 4oC 15 phút Hòa cặn tế bào vào 1,5-2 ml dung dịch 10% glycerol chia vào ống eppendorf vơ trùng, ống 50 µl dịch Làm đông tế bào đột ngột nitơ lỏng bảo quản tế bào 80oC sử dụng 2.2.1.6 Tạo vector biểu pET17b gắn đoạn gen P450-T2 (pET17b-T2) Vector pET17b (Novagen) mang T7 promoter đầu N, vùng tạo dòng, T7 terminator, pBR322 origin cắt mở vòng với hai enzyme giới hạn HindIII NdeI (NEB) loại gốc phosphate với CIP (NEB) Thành phần phản ứng mở vòng sau: Đệm Smart cutter: NdeI: HindIII: Plasmid (152 ng/µl): dH2O: µl µl µl µl 10 µl Phản ứng ủ 37 C Bất hoạt enzyme giới hạn cách nâng nhiệt độ phản ứng lên 65oC 20 phút Tiếp tục loại gốc phosphate với thành phần phản ứng sau: o Đệm Smart cutter: Plasmid mở vòng: CIP: dH2O: 10 µl 20 µl µl 15 µl Phản ứng ủ 37oC 30 phút Làm plasmid Kit GenJET Gel extraction (Thermo Fisher Scientific) Mặt khác, sản phẩm khuếch đại gen mục 2.2.1.4 cắt tạo đầu dính với enzyme tương ứng Hind III NdeI (NEB) Làm đoạn gen Kit GenJET Gel extraction (Thermo Fisher Scientific) Đoạn gen P450-T2 gắn vào vector pET17b mở vòng vị trí HindIII NdeI Kit Fast Link DNA ligation (Epicenter) với thành phần phản ứng sau: Đệm 10x Fast-link ligation: 10 mM ATP: pET17b mở vòng: Đoạn gen P450-T2: dH2O: Fast link ligase: 1,5 µl 0,75 µl µl µl 4,75 µl µl Hỗn hợp ủ 15 phút nhiệt độ phòng trước bất hoạt enzyme 70oC 15 phút 2.2.1.7 Biến nạp vào E coli phương pháp xung điện Hỗn hợp gắn mục 2.2.1.6 (3 µl) trộn vào tế bào khả biến E coli TOP10F’ để đá 510 phút Đồng thời cuvette đặt đá Chuyển dịch tế bào trộn hỗn hợp gắn vào cuvette tiến hành xung điện điện 1800-2000V Phục hồi tế bào ml môi trường SOC, lắc 37oC Dịch biến nạp sau cấy trải đĩa mơi trường LB có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) 2.2.1.8 Chọn lọc dòng E coli mang vector pET17b-T2 Khuẩn lạc mọc đĩa môi trường LB (sản phẩm mục 2.2.1.7) tách nuôi riêng rẽ môi trường LB lỏng có kháng sinh qua đêm 37oC Tách plasmid Kit GeneJET Plasmid miniprep (Thermo Fisher Scientific) cắt kiểm tra hai enzyme giới hạn HindIII NdeI Những dòng plasmid có xuất hai băng (kích thước tương ứng khoảng 3000 bp 1000 bp) giữ lại gửi đọc trình tự gen Phù sa Biochem Ltd 2.2.1.9 Biểu gen P450-T2 Dòng plasmid pET17b-T2 xác định trình tự đảm bảo đủ mã di truyền biến nạp vào tế bào E coli BL21(DE3), JM109(DE3) C43(DE3) phương pháp xung điện Các dòng tế bào E coli tái tổ hợp ban đầu nhân bình tam giác chứa mơi trường LB bổ sung ampicillin (100 µg/ml) 37oC qua đêm làm giống Chuyển 1% giống vào môi trường TB tiếp tục lắc 37oC 3-4h OD600 đạt 0,8 – bổ sung mM IPTG 0,5 mM -amino levulinic acid hạ nhiệt độ xuống 30oC Sau 48 giờ, ly tâm thu cặn tế bào bảo quản cặn tế bào -20oC cho thí nghiệm sau 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Tinh protein P450-T2 tái tổ hợp Cặn tế bào rã đơng hòa tan 50 ml đệm A (50 mM Kpi pH 7,4; 500 mM Naacetate; 0,1 mM EDTA; 1,5% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF 0,1 mM DTE) Tế bào sau phá sóng siêu âm 15 phút Dịch phá tế bào ly tâm 35.000 vòng/phút 30 phút để thu dịch thô enzyme Xác định nồng độ enzyme tái tổ hợp theo phương pháp Omura Sato Cột sắc ký IMAC-Ni2+ cân bằng đệm B (50 mM Kpi pH 7,4; 500 mM Na-acetate; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF 0,1 mM DTE) Đưa mẫu enzyme thô vào cột rửa 50 ml đệm B Tiếp tục rửa 50 ml đệm C (50 mM Kpi pH 7,4; 0,1 mM EDTA; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF 0,1 mM DTE; 0,1 mM ATP) Protein tái tổ hợp đẩy khỏi cột đệm D (50 mM Kpi pH 7,4; 400 mM Imidazol AcO; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF 0,1 mM DTE) thành phân đoạn (2 ml/phân đoạn) với tốc độ ml/phút Các phân đoạn đo quang phổ UV-Vis từ bước sóng 700 đến 200 nm Thu nhận phân đoạn có tỉ lệ A417/A280 từ 1,6-1,8 Các phân đoạn lựa chọn hòa chung, loại imidazol phương pháp thẩm tích lại đến thể tích mong muốn Centriprep 30 kDa Mẫu protein tinh kiểm tra điện di SDS-PAGE xác định nồng độ cytochrome P450 2.2.2.2 Điện di SDS-PAGE Điện di SDS-PAGE thực theo phương pháp Laemmli Nồng độ cytochrome P450 xác định máy đo quang phổ CO-Difference tính tốn cơng thức ε(459–490) =91 mM-1 cm-1 dựa theo phương pháp Omura and Sato Phổ UV-vis cytochrome P450 ghi lại nhiệt độ phòng máy đo quang phổ UV2101PC, Shimadzu, Kyoto, Japan 2.2.2.3 Xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis phương pháp xác định nồng độ cytochrome P450 Enzyme tinh đo máy quang phổ Shimadzu Photometer (UV2101PC, Kyoto, Japan) bước sóng từ 200-700 nm nhằm xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis Nồng độ cytochrome P450 xác định dựa theo phương pháp Omura Sato Cytochrome P450 hấp thụ cực đại bước sóng 450 nm chúng bị khử thành phức hợp Fe-CO Nồng độ P450 tính theo cơng thức: C(P450) = (A450-A490) x hệ số pha loãng xd C(P450): nồng độ cytochrome P450 [mM] A450-A490: Hiệu số độ hấp thụ bước sóng 450 nm 490 nm ε: Độ hấp thụ phân tử (molar extinction coefficient) [91 mM-1×cm-1] d: Đường kính chiều dài cuvette [cm] 2.2.2.4 Xác định pH tối ưu nhiệt độ tối ưu P450-T2 tái tổ hợp Enzyme tái tổ hợp tinh hoà đệm 50 mM Kpi với dải pH từ 2-9 15 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút thu dịch Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Omura Saito để xác định giá trị pH cho nồng độ P450 cao Enzyme tiếp tục hoà đệm 50 mM Kpi pH tối ưu ủ nhiệt độ 40, 50, 60 70oC 15 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút thu dịch Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Omura Saito để xác định giá trị nhiệt độ cho nồng độ P450 cao 2.2.2.5 Xác định độ bền nhiệt P450-T2 tái tổ hợp Giá trị T50 xác định cách ủ protein tinh nhiệt độ 40oC, 50oC 60oC đồng thời xác định hoạt tính enzyme lại sau khoảng thời gian 15 phút Đường cong biến tính enzyme xác định thông qua đặc điểm vùng hấp thụ tia UV xa (far UV) sử dụng hệ thống quang phổ lưỡng sắc tròn (Circular dichroism - CD) JASCO J-715 Enzyme tinh hoà đệm 10 mM Kpi pH 7,4 đến nồng độ cuối µM Phổ hấp thụ đo vùng UV xa từ bước sóng 190 đến 260 nm Mỗi lượt đo cách phút với tốc độ 0,5s/nm chiều rộng băng nm 2.2.2.6 Xác định redox partner hệ thống truyền điện tử P450-T2 Enzyme tái tổ hợp tinh P450-T2 trộn chung với hệ ferredoxin reductase ferredoxin khác nhau, bao gồm: (i) hệ adrenodoxin reductase/ adrenodoxin rút gọn (4-108) người; (ii) hệ ferredoxin reductase arh1/ ferredoxin etp1 nấm men; (ii) hệ ferredoxin reductase BmCPR/ ferredoxin Fdx2 (iii) hệ ferredoxin reductase BmCPR/ ferredoxin Fdx3 từ Bacillus megaterium Tính tương thích xác định dựa khả truyền electron (tính khử) từ NADPH đến ferredoxin reductase, tiếp đến ferredoxin cuối đến P450 Các hệ redox partner tương thích khử P450 hình thành nên phức Fe-CO có peak hấp phụ tối đa bước sóng 450 nm Phản ứng thực đệm HEPES pH 7,2 với tỷ lệ P450:Fdx:FdR 1:20:3 (M) Bổ sung 1mM NADPH, trộn chia vào hai cuvette thạch anh CV10Q700 (Thorlabs) Sau thời gian phút, cuvette sục bão hòa CO Đo mức độ hấp thụ mẫu từ bước sóng 400-500 nm máy quang phố Shimadzu Photometer (UV2101PC, Kyoto, Japan) 2.2.2.7 Xác định phổ chất tiềm P450-T2 Một số hợp chất bao gồm: Caffeic acid, L-Mimosine, Piceatamol, L-Resveratro, Butein, Emodin, Luteolin, Morine, Isoscopoletine, Nalixic acid, Scopoletin lựa chọn để thử nghiệm xác định phổ chất tiềm P450-T2 Cơ chất tiềm P450-T2 đánh giá dựa thay đổi phổ hấp thụ cực đại UV-Vis P450 từ dạng low-spin (hâp thụ cực đại 415-417 nm) khơng có mặt chất chuyển thành dạng high spin (hâp thụ cực đại 390-394 nm) có mặt chất 2.2.3 Các phương pháp tin sinh học Chất lượng đọc trình tự đánh giá phần mềm FastQC Quá trình tiền xử lý liệu thực công cụ Trimmomatic Dữ liệu DNA metagenome khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu lắp ráp để tạo thành contigs phần mềm SOAPdenovo2 với thông số mặc định Công cụ Bowtie2 sử dụng nhằm gióng hàng đoạn đọc ngắn với contig lắp ráp, qua đoạn trình tự lỗi loại bỏ Kết lắp ráp đánh giá phần mềm QUAST Hình 2.1: Quy trình lắp ráp xử lý số liệu MetaGeneMark v2.10 sử dụng để dự đoán khung đọc mở (ORFs) dựa kết lắp ráp Tất khung đọc mở sau so sánh với ngân hàng liệu NCBI cơng cụ Blast++ nhằm dự đốn chức protein sàng lọc ORF mã hóa cytochrome P450 Gen tiềm mã hóa cytochrome P450 đối chiếu với sở liệu cytochrome P450 vi khuẩn Công cụ Tm Index sử dụng để dự đoán nhiệt độ mà 50% cấu trúc protein bị duỗi xoắn, qua loại bỏ gen mã hóa cytochrome P450 khơng bền nhiệt Gen mã hóa cytochrome P450 dịch mã sang axit amin phần mềm ExPASy Trình tự axit amin gen phân lâp từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu cytochrome P450 tương đồng hàng Clustal Omega thể thành hình ảnh nhờ cơng cụ ESPript3 Cây phả hệ cytochrome P450 xây dựng phần mềm MEGA7 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Suối nước nóng Bình Châu thuộc xã Bưng Riềng, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa có nhiệt độ gần miệng giếng phun 82-84oC, pH 7,5 – 7,7 Vị trí lấy mẫu có tọa độ 10o36’03.9” Bắc 107o33’30.0” Đơng Chỉ tiêu hố lý mẫu nước thu nhận từ suối nước nóng Bình Châu trình bày phụ lục Hình 3.1: Vị trí điểm sơi suối nước nóng Bình Châu lựa chọn để lấy mẫu 3.1 Tách chiết DNA metagenome từ mẫu suối nước nóng Bình Châu Q trình tách chiết DNA metagenome thực theo hướng dẫn sử dụng kit PowerWater® DNA Isolation (MO BIO) Kết tách chiết DNA metagenome mẫu nước suối nước nóng Bình Châu thể ảnh điện di hình 3.2 cho thấy DNA metagenome mẫu nước suối nước nóng Bình Châu có chất lượng tốt, DNA khơng bị đứt gãy Nồng độ mẫu đo máy quang phổ Nano Drop 1000 đạt 139,3 ng/µl, A260:A280 đạt 1,84 đủ điều kiện để giải trình tự Hình 3.2: DNA metagenome mẫu nước suối nước nóng Bình Châu (Giếng 1) M: thang DNA chuẩn 1kb 3.2 Giải trình tự DNA metagenome thiết bị HiSeq Illumina DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu gửi giải trình tự Công ty BGI (Hongkong) 3.3 Xây dựng sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu gen mã hóa cytochrome P450 cơng cụ tin sinh học 3.3.1 Giải trình tự tiền xử lý liệu Kết giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu cơng ty BGI (Hongkong) thu 10.2 Gb liệu thơ Phân tích phần mềm FastQC cho thấy có 0.04% liệu khơng xác định A,T,G hay C; 0,41% trình tự mồi đọc trình tự, 6,97% liệu có chất lượng (Q 30 (Hình 3.4) Hình 3.4: Chất lượng liệu sau tiền xử lý Trimmomatic 3.3.2 Lắp ráp de novo metagenome Dữ liệu lắp ráp để tạo thành contigs phần mềm SOAPdenovo2 đánh giá chất lượng lắp ráp công cụ Quast (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies) SOAPdenovo2 lắp ráp 61.212.496 đoạn trình tự tạo 51.346 contigs có độ dài 500 bp, contig dài 1.767.609 bp (Bảng 3.1) Bảng 3.1: Kết lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu Tổng số đoạn trình tự 93.999.534 Số đoạn trình tự lắp ráp 61.212.496 Tổng số contig 51.346 Contig dài (bp) 1.767.609 Độ dài trung bình contig (bp) 3.351 Độ dài contig N50 (bp) 9.791 Độ dài contig N90 (bp) 1.059 Hình 3.5: Phân bố độ dài contig sau lắp ráp phần mềm SOAPdenovo2 3.3.3 Dự đoán gen xây dựng sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hoá cytochrome P450 Sử dụng chức dự đoán ORF dành cho liệu metagenomic phần mềm MetaGeneMark v2.10 với 51.346 contig thu 156.093 khung đọc mở tiềm Phân bố độ dài khung đọc mở thể hình 3.6 cho thấy đoạn gen có độ dài từ 500-999 bp có tỉ lệ 47,2%, đoạn gen có chiều dài 1000-1499 bp chiều dài từ 1500-1999 bp có tỷ lệ 20,4% 6,9% Hình 3.6: Phân bố độ dài gen dự đoán từ sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu Tất khung đọc mở sau so sánh với ngân hàng liệu NCBI công cụ Blast++ Có tất 106.903 khung đọc mở tiềm giải, có 68 gen tiềm mã hóa cytochrome P450 bao gồm 38 gen hoàn chỉnh, 14 gen thiếu mã mở đầu, gen thiếu mã kết thúc gen thiếu hai đầu (Bảng 3.2) Bảng 3.2: Cơ sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hóa cytochrome P450 Loại gen Số lượng Gen hoàn chỉnh 38 Gen thiếu mã mở đầu 14 Gen thiếu mã kết thúc Gen thiếu mã mở đầu mã kết thúc Tổng số 68 Cơ sở liệu metagenome cụm gen mã hóa cho cytochrome P450 có mang 38 ORF hồn chỉnh Các trình tự phân tích dự đoán chức protein theo đường KEGG Kết phân tích cho thấy protein P450 sở liệu chia thành nhóm (Hình 3.7): - Nhóm bao gồm 15 enzyme tham gia chuyển hóa Terpenoid Polyketides tham gia vào trình phân hủy Limonene pinene với mức độ tương đồng protein với cytochrome P450 công bố từ 41-81% - Nhóm bao gồm enzyme tham gia chuyển hóa lipid chất béo với mức độ tương đồng 42 61% - Nhóm bao gồm protein có độ tương đồng 61% với cytochrome P450 người (CYP4V) - Nhóm bao gồm 20 cytochrome P450 chưa rõ chức có mức độ tương đồng protein với cytochrome P450 công bố từ 28-100% Số lượng cytochrome P450 25 20 15 10 Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Hình 3.7: Số lượng cytochrome P450 sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu chia thành nhóm: Nhóm - enzyme tham gia chuyển hóa Terpenoid Polyketides tham gia vào trình phân hủy Limonene pinene; Nhóm - enzyme tham gia chuyển hóa lipid chất béo; Nhóm 3- enzyme tương đồng với CYP4V; Nhóm 4- nhóm chưa rõ chức 3.3.4 Dự đốn nhiệt độ nóng chảy (Tm) P450 tiềm sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu Tm 38 ORF hồn chỉnh mã hóa cho cytochrome P450 tiềm dự đốn trực tiếp từ trình tự protein gen thơng qua phần mềm T m Index Kết cho thấy có 13 đoạn ORF (34,21%) dự đốn có Tm protein cao 65oC, 23 ORF (60,53%) mã hố cho protein có T m nằm khoảng từ 55oC đến 65oC ORF (5,26%) mã hố cho protein có Tm thấp 55oC (Hình 3.8) Hình 3.8: Phân bố Tm cytochrome P450 tiềm mã hoá 38 ORF hoàn chỉnh từ sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 3.4 Tách dòng biểu gen mã hóa cytochrome P450 từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 3.4.1 Phân lập gen mã hóa cytochrome P450 Với mục tiêu tìm kiếm gen mã hóa cytochrome P450 bền nhiệt, ORF có Tm < 55oC bị loại bỏ, 36 ORF có Tm > 55oC sử dụng làm đối tượng để khuếch đại gen Sử dụng 36 cặp mồi có trình tự thiết kế phụ lục để khuếch đại ORF sở liệu metagenome Phương pháp thông dụng để làm giàu số gen đích làm giàu mật độ vi sinh vật sinh tổng hợp sản phẩm mã hóa gen đích chất đặc hiệu, đặc biệt nhóm enzyme thủy phân (amylase, cellulase…) Tuy nhiên cytochrome P450 nhóm enzyme oxy hóa, cần phải có tham gia nhiều cofactor để thực trình xúc tác Hơn nữa, phổ chất cytochrome P450 khác khác nhau, việc lựa chọn chất để làm giàu số gen mã hóa cytochrome P450 DNA metagenome bất khả thi Trong thí nghiệm này, không thành công việc khuếch đại gen mã hóa cytochrome P450 trực tiếp từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu Do chúng tơi lựa chọn phương pháp tổng hợp nhân tạo ORF sở liệu metagenome để biểu nghiên cứu tính chất 3.4.2 Lựa chọn ORF hồn chỉnh mã hóa cytochrome P450 Do bất cập tính tương thích nhiệt độ tối ưu enzyme chuỗi truyền điện tử, chúng tơi khơng có hệ redox partner (ferredoxin reductase, ferredoxin) chịu nhiệt, tiêu chí đặt để lựa chọn ORF bao gồm: - Là ORF hồn chỉnh (có trình tự nucleotide mã hố Methionine khởi đầu kết thúc Stop codon) Có Tm dự kiến nằm khoảng 55 – 65oC Có độ tương đồng với P450 biết < 85% Tham gia vào đường chuyển hoá terpenoid polyketide Trong số ORF sàng lọc, lựa chọn ORF thuộc contig [denovogenes]_35152 đáp ứng tiêu chí để tổng hợp nhân tạo Cơng ty TNHH MTV Phù Sa (Việt Nam) 3.4.3 Phân tích trình tự gen mã hoá cytochrome P450 tổng hợp nhân tạo (P450-T2) Gen tổng hợp có ký hiệu P450-T2 có chiều dài 1188 bp mã hóa cho 395 axit amin P450-T2 có mức độ xác định 70,8% độ tương đồng 81,4% với trình tự axit amin CYP203A1 chủng Hydrogenophaga taeniospiralis Do đó, xếp enzyme cytochrome P450 mã hóa gen tìm vào nhóm CYP203A1 Kết xác định thông qua phả hệ neighbor-joining trình tự gen mã hóa P450-T2 cytochrome P450 khác (Hình 3.9) Hình 3.9: Cây phả hệ cytochrome P450 mã hóa gen phân lập từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu số cytochrome P450 khác Cytochrome P450 hemoprotein, có đặc trưng motif EXR, CXG heme binding domain Một số cấu trúc đặc trưng cytochrome P450 EXXR motif heme binding domain (FGHGIHFCLG) thể hình 3.10 Hình 3.10: Kết so sánh trình tự axit amin P450-T2 số cytochrome P450 khác 3.4.4 Thiết kế hệ vector biểu gen mã hóa P450-T2 Gen mã hố P450-T2 gắn vector pUC19 Sử dụng cặp mồi 35152f 35152r để khuếch đại đoạn gen theo phương pháp trình bày mục 2.2.1.4 (Hình 3.11A) Sau đó, vector pET17b (Novagen) sản phẩm PCR xử lý NdeI HindIII trước gắn đoạn ORF P450-T2 vào vector enzyme Fast link ligase (Epicenter) Vector tái tổ hợp pET17b mang đoạn gen P450-T2 nhân lên E coli TOP10F’ cắt kiểm tra NdeI HindIII M 1000 bp M 1000 bp A B Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen mã hoá P450-T2 (A) dòng vector pET17b mang đoạn gen mã hố P450-P2 sau cắt NdeI HindIII (B) M: kb ladder 3.4.5 Biểu gen mã hóa P450-T2 Nồng độ P450 [nmol/L] Các chủng tái tổ hợp sau biểu bình tam giác nhẵn tích 250 mL chứa 50 mL mơi trường TB Quá trình cảm ứng thực với mM IPTG 0,5 mM δ-Aminolevulinic acid Sau 48 mức độ biểu P450-T2 đạt mức 10,7 nmol/L thấp 12 10 10.7 6.2 BL21(DE3) JM109(DE3) Hình 3.12: Nồng độ P450-T2 tái tổ hợp E coli BL21(DE3) JM109(DE3) Mơ hình biểu thực bình tam giác nhẵn tích 250 mL chứa 50 mL mơi trường TB Do hiệu suất biểu ban đầu thấp nên tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu suất biểu bình tam giác nhẵn dung tích 2000 ml chứa 500 ml môi trường Chủng E coli lựa chọn BL21(DE3) Mặc dù hiệu suất biểu nâng lên 60,3 nmol/L hiệu suất biểu thấp cho bước nghiên cứu Chúng tiếp tục thử nghiệm biểu quy mơ bình tam giác có gờ dung tích 2000 mL chứa 250 mL mơi trường TB sử dụng dòng tế bào E coli C43(DE3) mang plasmid pET-T2 Kết Hình 3.13 cho thấy mức độ biểu tăng lên rõ rệt, tế bào E coli có màu đỏ, nồng độ cytochrome P450-T2 đạt 541 nmol/L, gấp gần lần so với hệ thống biểu trước 541 Nồng độ P450 [nmol/L] 600 500 400 300 200 100 60.3 BL21(DE3) 500 C43(DE3) 250 mL bình mL bình nhẵn 2L gờ 2L A B Hình 3.13: Màu sắc tế bào E coli C43(DE3) tái tổ hợp mang vector pET17b-T2 (A) hiệu suất biểu P450-T2 hai hệ thống bình tam giác chủng E coli khác 3.5 Tinh P450-T2 tái tổ hợp Cặn tế bào E coli C43(DE3) tái tổ hợp phá vỡ sóng siêu âm để thu dịch enzyme thơ Tồn quy trình tinh enzyme qua cột sắc ký lực IMAC-Ni2+ thực theo mô tả phần 2.2.2.1 Dịch protein thô protein tinh chạy điện di SDS PAGE, đồng thời xác định nồng độ enzyme tinh theo phương pháp Omura Sato (Hình 3.14) Enzyme tinh có hoạt độ 1120 μmol/L, trọng lượng phân tử 44,3 kDa tính tốn lý thuyết Sản phẩm có đỉnh bước sóng 450 nm bị khử Na-dithionite bão hoà CO, khơng có đỉnh bước sóng 420 nm Do đó, enzyme enzyme trạng thái hoạt động M 37 kDa A B Hình 3.14A: Điện di đồ SDS-PAGE dịch enzyme P450-T2 thô (1) dịch enzyme tinh (2) M: protein ladder 10-250 kDa (Biorad) Hình 3.14B: Phổ đặc trưng cytochrome P450 enzyme tái tổ hợp P450-T2 bị khử Na-dithionite bão hoá CO 3.6 Xác định số tính chất P450-T2 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp Dịch enzyme hòa đệm 50 mM Kpi pH khác 2-10, ủ 15 phút xác định hoạt độ cytochrome P450 theo phương pháp Omura Sato (1964) Kết Hình 3.15 cho thấy hoạt tính cao P450-T2 pH 100 80 60 40 20 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10 Hoạt tính tương đối (%) 120 pH Hình 3.15: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính P450-T2 Do mong muốn thu nhận P450 ưa nhiệt và/hoặc bền nhiệt nên xác định ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme từ 40-70oC 15 phút Kết trình bày Hình 3.16 cho thấy P450-T2 tái tổ hợp thể hoạt tính cao 50oC Tuy nhiên nâng nhiệt độ lên 60oC P450T2 hồn tồn hoạt tính Hình 3.16: Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính P450-T2 3.6.2 Độ bền nhiệt nhiệt độ biến tính tồn phần (Tm) P450-T2 Trong bước dự đốn tính bền nhiệt enzyme P450 thơng qua phần mềm T m index, trình tự axit amin P450-T2 dự đốn có hệ số Tm 60,2oC Độ bền nhiệt P450-T2 thực tế xác định thông qua hai thơng số Tm T50 Nhiệt độ nóng chảy P450-T2 đo phổ lưỡng sắc tròn - CD Kết thể Hình 3.17 cho thấy nhiệt độ nóng chảy P450-T2 56,8oC ± 0.08 (R2 = 0,99), gần với giá trị dự đốn Ở 50oC, tín hiệu CD bị giảm khơng đáng kể so với phổ CD enzyme 30 oC nâng nhiệt độ lên >50oC, enzyme cytochrome P450 biểu bị cấu trúc bậc Điều thể rõ ràng nhiệt độ 60oC Hình 3.17: Đường cong biểu diễn giá trị hấp thụ bước sóng 211 nm P450-T2 thay đổi nhiệt độ từ 30-90oC Điểm đường cong thể thay đổi trạng thái chuỗi α từ trạng thái gấp nếp sang duỗi xoắn Giá trị nhiệt độ tương ứng với điểm đường cong hệ số nhiệt độ nóng chảy protein Hoạt tính tương đổi [%] Đồng thời, dịch enzyme hòa đệm 50 mM Kpi pH ủ 40-50oC Cứ 15 phút lại lấy mẫu đo hoạt tính để xác định thời gian biến tính 50% Kết trình bày Hình 3.18 cho thấy giá trị T50 P450-T2 50 phút 50oC Kết từ Hình 3.16, 3.17 3.18 tạm kết luận P450-T2 khơng phải enzyme bền nhiệt enzyme ưa nhiệt hoạt động nhiệt độ 40-50oC, cao so với hầu hết P450 hoạt động ngưỡng 30-37oC 120 100 80 60 40oC 40 50oC 20 Thời gian [phút] Hình 3.18: Đường cong biểu diễn biến thiên hoạt tính P450-T2 40 50oC theo thời gian 3.7 Redox partner thích hợp chuỗi truyền điện tử P450-T2 Trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tơi khơng có thơng tin FdR Fdx tự nhiên P450T2, chúng tơi thử nghiệm tính tương thích P450-T2 với số hệ thống FdR/Fdx có sẵn Khoa Hố sinh, Trường Đại học Tổng hợp Saarland (CHLB Đức) bao gồm (i) adrenodoxin (Adx) rút gọn (4-108) adrenodoxin reductase (AdR) người; (ii) ferredoxin reductase (BmCPR), ferredoxin Fdx Bacillus megaterium, ferredoxin reductase(BmCPR), ferredoxin Fdx Bacillus megaterium, ferredoxin reductase (arh1), ferredoxin (etp1) nấm men với tỷ lệ nồng độ P450:Fdx:FdR 1:20:3 Hình 3.19: Sàng lọc hệ redox partner thích hợp cho P450-T2 Kết Hình 3.19 cho thấy P450-T2 tương tác thích hợp với hệ Fdx2/BmCPR B megaterium tương tác với hệ ferredoxin reductase/ ferredoxin khác 3.8 Phổ chất tiềm P450-T2 Cơ chất tiềm P450-T2 đánh giá dựa thay đổi phổ hấp thụ cực đại UV-Vis P450 từ dạng low-spin (hấp thụ cực đại 415-417 nm) khơng có mặt chất chuyển thành dạng high-spin (hấp thụ cực đại 390-394 nm) có mặt chất Bảng 3.3: Sàng lọc chất P450-T2 dựa thay đổi UV-Vis từ trạng thái LS sang trạng thái HS Hợp chất Thay đổi UV-Vis từ dạng LS sang dạng HS Caffeic + Citrinin - L-Mimosine + Piceatamol - L-Resveratro - Butein - Emodin + Luteolin + Morine + Isoscopoletine + axit Nalixic - Scopoletin + KẾT LUẬN Tách chiết DNA metagenome khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu có chất lượng cao: nồng độ DNA 139,3 ng/µl, A260:A280 đạt 1,84 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu máy giải trình tự gen hệ Hiseq Illumina thu liệu 9.4 GB Xây dựng sở liệu gen liên quan đến họ cytochrome P450 bao gồm 68 gen tiềm mã hóa cytochrome P450, 38 gen hồn chỉnh, 14 gen thiếu mã mở đầu, gen thiếu mã kết thúc gen thiếu hai đầu Biểu gen mã hoá P450-T2 thuộc họ CYP203A1 E coli C43(DE3) đạt nồng độ 541 nmol/L Tinh enzyme tái tổ hợp hệ thống sắc ký IMAC, enzyme tinh có nồng độ 1120 μmol/L Xác định số tính chất P450-T2 tái tổ hợp: pHopt 7, Tm 56,8oC ± 0,08 (R2=0.99), T50 P450-T2 50 phút 50oC P450-T2 enzyme bền nhiệt enzyme ưa nhiệt P450-T2 nhận điện tử từ số redox partner khác để khởi động chuỗi truyền điện tử bao gồm Adx (4-108)/AdR người; Fdx2/BmCPR, Fdx3/BmCPR B megaterium, arh1/etp1 nấm men Phổ chất tiềm P450-T2 hợp chất vòng thơm đa dạng, bao gồm: axit caffeic, mimosine, isoscopoletine, scopoletine, emodin, luteolin, morine KIẾN NGHỊ Chuyển hoá chất tiềm in vitro Phân tích sản phẩm q trình chuyển hoá in vitro kỹ thuật phù hợp ... metagenome suối nước nóng Bình Châu 3.4 Tách dòng biểu gen mã hóa cytochrome P450 từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 3.4.1 Phân lập gen mã hóa cytochrome P450 Với mục tiêu tìm kiếm gen mã hóa cytochrome. .. mẫu nước thu nhận từ suối nước nóng Bình Châu trình bày phụ lục Hình 3.1: Vị trí điểm sơi suối nước nóng Bình Châu lựa chọn để lấy mẫu 3.1 Tách chiết DNA metagenome từ mẫu suối nước nóng Bình Châu. .. Hình 3.2: DNA metagenome mẫu nước suối nước nóng Bình Châu (Giếng 1) M: thang DNA chuẩn 1kb 3.2 Giải trình tự DNA metagenome thiết bị HiSeq Illumina DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu gửi