ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUN - 2017 Cơng trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM – ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm GS.TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 1: …………………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………………… Phản biện 2: …………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Vào hồi phút, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiều luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu - Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Ngun CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Các báo Bùi Thị Hà, Hồ Mạnh Tường, Hoàng Phú Hiệp, Lê Văn Sơn, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2015), “Tách dòng phân tử thiết kế vector chuyển gen DAT phân lập từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), TAP CHI SINH HOC 37(2), pp 236-243 Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), “Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus (L.).G.Don)”, Tạp chí KHĐHQGHN Khoa học Tự nhiên công nghệ, Tập 31, sô 4S , tr 56-62 Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2016), “Nghiên cứu quy trình chuyển gen dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Tập 157, số 12/1 Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam , Le Van Son, Chu Hoang Mau (2017), “Expression of the gen encoding deacetylvindoline 4-Oacetyl transferase (CrDAT) from Catharanthus roseus in transgenic tobacco plants” (Gửi tạp chí Khoa học Quốc tế đợi đăng) Các trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế [1] Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T and Chu,M.H (2015), Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN1 (Pink-purple flower), GenBank: LN809930.1 [2] Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T and Chu,M.H (2015), Catharanthus roseus mRNA for DAT enzyme (DAT gene), isolate TN2 (White flower), GenBank: LN809931.1 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, loài người giới phải đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe như: Ung thư, AIDS, tiểu đường, thối hóa khớp, viêm gan B, C Ung thư bệnh gây tử vong hàng đầu toàn giới Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 14 triệu người Đến năm 2015 có 90 triệu người mắc ung thư hàng năm có triệu người chết ung thư Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) loại dược liệu quý Cây dừa cạn có khả sản xuất indol alkaloid có dược tính quan trọng sản xuất loại thuốc chống ung thư, đặc biệt ung thư máu Ngồi ra, dừa cạn dẫn điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp số bệnh ung thư khác Trong dân gian, dừa cạn sử dụng trị cao huyết áp, bệnh tiểu đường, điều hòa kinh nguyệt, chữa tiêu hóa chữa lị, lợi tiểu mạnh, chữa bệnh tiểu đỏ ít, tẩy giun, chữa sốt cao Trong dừa cạn có chứa loại alkaloid vinblastine vincristine sử dụng rộng rãi điều trị bệnh ung thư Vinblastine vincristine chất ức chế mạnh phân chia tế bào ngăn cản tăng số lượng tế bào Hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn hoang dại thấp định hướng nghiên cứu làm tăng hàm lượng alkaloid dừa cạn quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật đại đó, xác định tăng cường biểu enzyme chìa khóa quan trọng Deacetylvindoline4-O-acetyltransferase (DAT) enzyme chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn Biểu mạnh enzyme DAT làm tăng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn nâng cao Từ lý thực đề tài luận án: “Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa deacetylvindoline-4O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ dừa cạn Tạo dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid cải thiện Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu thu thập thông tin gen CrDAT, thiết kế cặp mồi PCR nhân gen CrDAT, khuếch đại, tách dòng xác định trình tự gen CrDAT 3.2 Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa gen CrDAT đánh giá hoạt động vector chuyển gen thuốc 3.3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium tumafaciens dừa cạn 3.4 Nghiên cứu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn, phân tích chuyển gen đánh giá biểu chức sinh học gen chuyển CrDAT dừa cạn Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen biểu gen CrDAT thuốc dừa cạn, cụ thể là: 1) Đã phân lập gen CrDAT từ mRNA dừa cạn, gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa 439 amino acid 2) Xây dựng quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thơng qua A.tumefaciens tạo dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT hệ T1 (T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượng alkaloid tổng số tăng từ 3,16 lần đến 15,57 lần so với đối chứng không chuyển gen 3) Protein tái tổ hợp rCrDAT biểu thuốc lá, dừa cạn chuyển gen kết kiểm chứng Western blot ELISA Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Về mặt khoa học Kết nghiên cứu luận án góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen CrDAT phân lập từ dừa cạn màu hoa hồng tím màu hoa trắng thu thập Thái Nguyên Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid dừa cạn Các báo đăng tải tạp chí khoa học với trình tự gen cơng bố Ngân hàng gen quốc tế tư liệu có giá trị tham khảo nghiên cứu giảng dạy sinh học công nghệ sinh học Về mặt thực tiễn Các trình tự gen CrDAT phân lập, cấu trúc vector chuyển gen, dòng chuyển gen góp phần giải vấn đề cụ thể việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid dược liệu nói chung dừa cạn nói riêng Kết nghiên cứu mở triển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu mạnh gen mã hóa enzyme vào việc nâng cao hàm lượng dược chất dược liệu Cấu trúc luận án: Luận án có 120 trang (kể tài liệu tham khảo) chia thành chương, phần: Mở đầu (03 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (21 trang), Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết thảo luận (49 trang); Kết luận đề nghị (01 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (01 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang) Phụ lục (4 trang) Luận án có 20 bảng, 31 hình tham khảo 121 tài liệu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt; 99 tài liệu tiếng Anh để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Alkaloid dừa cạn, (2) Sinh tổng hợp alkaloid hoạt động DAT dừa cạn, ( 3) Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid dừa cạn Alkaloid chất hữu có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp thực vật đơi có động vật, thường có dược tính mạnh Trong lĩnh vực y học, alkaloid cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao độc đáo Theo Đỗ Tất Lợi (1977), dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) hay hải đằng, dương giác, bơng dừa, trường xn hoa lồi thực vật chi Catharanthus thuộc họ La bố ma (Apocynaceae) Dừa cạn địa đặc hữu Madagascar Ở Việt Nam, dừa cạn hoang dại, phân bố khắp nơi nước Dừa cạn nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole tách chiết từ ba giống, roseus với hoa màu hồng tím, albus với hoa màu trắng vàng ocellatus với hoa màu trắng đỏ, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine vinblastine cao Trong dừa cạn có khoảng 130 loại alkaloid, vinblastine vincristine hai hợp chất quan trọng Alkaloid có nhân indol tìm thấy tất phận cây, nhiều rễ Alkaloid tồn phần có dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ 1,14%, hạt 0,18% Trong khoảng 130 loại alkaloid chiết từ dừa cạn, người ta đặc biệt ý 20 nhóm alkaloid dimeric nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine vinblastine DAT enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối chuỗi tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline dừa cạn Theo St-Pierre cs (1998) protein DAT có khối lượng phân tử 51 kDa, gồm chuỗi polypeptid Gen DAT dừa cạn mã hóa cho enzyme acetyl CoA: deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) tham gia vào bước cuối trình sinh tổng hợp vindoline Gen DAT có kích thước 1320bp, gồm 439 amino acid, tham gia xúc tác chuỗi phản ứng cuối trình tổng hợp vindoline Để cải thiện hàm lượng vinblastine vincristine, hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật chuyển gen đề xuất Nhiều nghiên cứu theo hướng tăng sinh khối việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy, nuối mô tế bào thực vật, ni cấy tạo dòng rễ tơ để làm tăng hàm lượng alkaloid, đặc biệt vinblastine vincristine Trong năm gần đây, ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng hàm lượng alkaloid dừa cạn quan tâm nghiên cứu Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển gen dừa cạn nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogens Mohsen Zargar cs (2010) cho thấy dòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid tăng đáng kể so với không chuyển gen Kỹ thuật biểu mạnh gen mã hóa enzyme chìa khóa chuỗi phản ứng tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn chuyển gen tập trung nghiên cứu Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hạt giống dừa cạn màu hoa hồng tím màu hoa trắng thu thập tỉnh Thái Nguyên Giống thuốc Nicotinana tabacum K326 có nguồn gốc từ Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Phòng tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Các chủng vi khuẩn E Coli (DH5α), chủng A tumefaciens CV58 Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất sử dụng nghiên cứu mua từ hãng tiếng giới hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, Các thí nghiệm thực trang thiết bị đại Phòng cơng nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Ngun Phòng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng Phòng cơng nghệ tế bào thực vật thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Luận án hồn thành Bộ mơn Sinh học đại&Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phương pháp nghiên cứu chia thành nhóm chính: (1) nhóm phương pháp sinh học phân tử, (2) nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo chuyển gen, (4) nhóm phương pháp phân tích chuyển gen Các thí nghiệm tiến hành theo sơ đồ tổng qt mơ tả hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử Phân lập gen CrDAT phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R RNA tổng số tách chiết Trizol Reagent Kit cDNA tổng hợp theo quy trình nhà sản xuất Tách dòng giải trình tự gen qua bước: i) Tinh sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc colony PCR; v) Tách chiết plasmid cắt kiểm tra BamHI; vi) Xác định phân tích trình tự nucleotide Kết nghiên cứu trình tự gen, amino acid xử lý phần mềm BioEdit, 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Vector chuyển gen mang gen CrDAT thiết kế theo hai bước (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu trúc chứa gen CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121 (Hình 2.2) Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT 10 Xác định trình tự gen CrDAT Kết giải trình tự nucleotide gen CrDAT (cDNA) phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 (hoa hồng tím) TN2 (hoa trắng) cho thấy gen CrDAT có kích thước 1320 bp Gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 TN2 có độ tương đồng so với trình tự gen DAT mang mã số AF053307 99,5% 99% tỷ lệ tương đồng trình tự gen CrDAT hai mẫu TN1 TN2 Như kết luận rằng, gen CrDAT phân lập từ mẫu dừa cạn TN1 TN2 tách dòng thành cơng Trình tự nucleoitde gen CrDAT phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế với mã số LN809930 LN809931 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn DAT hai mẫu dừa cạn TN1, TN2 DAT mang mã số AAC99311 Ngân hàng Gen (protein suy diễn từ gen DAT mang mã số AF053307) cho thấy protein DAT gồm 439 amino acid có độ tương đồng cao so với protein mang mã số AAC99311 Ngân hàng gen (99,3% 99,4%); trình tự amino acid suy diễn hai mẫu TN1 TN2 tương đồng 97,7% 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN VÀ BIỂU HIỆN GEN CrDAT TRÊN CÂY THUỐC LÁ 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Trình tự nucleotid gen CrDAT màu hoa hồng tím sử dụng để thiết kế vector chuyển gen thực vật thông qua A tumefaciens Sử dụng enzyme giới hạn HindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDAT để thu nhận cấu trúc 35SCrDAT-cmyc-KDEL-polyA Gắn cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA vào vector chuyển gen pBI121 DNA T4 ligase tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen chuyển CrDAT (pBI121-CrDAT 11 Plasmid tái tổ hợp pBI121-35S-DAT-cmyc tách chiết, kiểm tra biến nạp vào A tumefaciens Cấu trúc vector chuyển gen pBI121 – CrDAT bao gồm thành phần thể hình 3.8A Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR A: Cấu trúc vector chuyển gen pBI121CrDAT LB: bờ trái T-DNA; RB: bờ phải T-DNA; nptII: gen kháng kanamycin; 35S: promoter CaMV35S B: Kết kiểm tra sản phẩm colony-PCR dòng A tumefaciens chứa vector chuyển gen pBI121DAT Các dòng A tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI12135S-DAT-cmyc kiểm tra colony-PCR kết phân tích ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc thu dòng dương tính với colony-PCR (Hình 3.8B) Các dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT lưu giữ sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen 3.2.2 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen Biến nạp cấu trúc chứa gen CrDAT và tạo thuốc lá chuyển gen nhờ A.tumefacinens Các mảnh thuốc giống K326 có kích thước khoảng 1cm2 sử dụng làm vật liệu nhận gen Thí nghiệm chuyển gen CrDAT vào thuốc trình bày hình 3.9 12 Hình 3.9 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp, chọn lọc tái sinh tạo thuốc chuyển gen A: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc; B, C: Tái sinh đa chồi; D: Kéo dài chồi; E: Tạo rễ; G: Ra bầu điều kiện nhà lưới Bảng 3.3 cho thấy, sau lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh thuốc lá, kết có 235/ 249 mảnh sống sót sau tuần, phát sinh 205 chồi thu 186 in vitro sống sót mơi trường MS có bổ sung kháng sinh Số bầu đất 113 có 65 trồng nhà lưới có biểu xanh tốt, mập mạp Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh thuốc Đối chứng thí nghiệm ĐC0* ĐC1* Thí nghiệm Tổng Lần Lần Lần Tổng số mảnh 30 30 82 90 77 249 Số Số Số mảnh mảnh rễ cảm sống môi ứng tạo sót sau trường chồi tuần chọn lọc 30 79 86 70 235 40 68 74 63 205 25 55 61 52 186 Số bầu Số trồng nhà lưới 15 34 44 35 113 15 22 25 18 65 13 Phân tích có mặt và hợp gen chuyển CrDAT hệ gen thuốc lá chuyển gen Các dòng thuốc chuyển gen T0 sau trồng nhà lưới tuần tiến hành thu để thực phản ứng PCR với cặp mồi CrDATF -Xba/CrDATR-Sac để kiểm tra có mặt gen chuyển CrDAT (Hình 3.10) Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen DAT thuốc chuyển gen đối chứng Từ đến 19: dòng thuốc chuyển gen; M: thang DNA kb; wt: thuốc khơng chuyển gen Hình 3.10 cho thấy, 19 dòng thuốc chuyển gen có 12 dòng thuốc chuyển gen dương tính với phản ứng PCR dòng T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15, T0-16, T0-17, T0-19 (các dòng điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19) Để khẳng định gen chuyển CrDAT hợp vào hệ gen thuốc lá, DNA thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15) cho kết PCR dương tính lựa chọn ngẫu nhiên để sử dụng phân tích Southern blot Hình 3.11 cho thấy tất dòng thuốc chuyển gen cho kết lai Southern (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), hai dòng T0-5 T0-15 cho băng DNA (2 copy), bảy dòng lại có băng DNA kích 14 thước khác Bảy dòng thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết lai Southern có copy sử dụng phân tích Western blot Hình 3.11 Kết phân tích Southern blot mẫu thuốc chuyển gen CrDAT M: Marker 1kbplus, (+) Plasmid pBI121- CrDAT cắt SacI, 1-15: chuyển gen T0 (1: T0-1 ; : T0-2 ; : T0-4 ; : T0-5 ; : T0-6 ; : T0-8 ; 12 : T0-12 ; 13 : T0-13; 15 : T0-15), wt: đối chứng khơng chuyển gen Phân tích biểu protein tái tổ hợp CrDAT thuốc lá chuyển gen Protein tổng số dòng thuốc chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T06, T0-8, T0-12, T0-13 xuất băng DNA từ kết lai Southern phân tích điện di SDS-PAGE chuyển phân đoạn protein lên màng nitrocellulose thực phản ứng lai Western Kết phân tích PCR, Southern blot Western blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT hệ T0 chứng minh gen chuyển CrDAT hợp vào hệ gen thuốc gen chuyển CrDAT hoạt động phiên mã dịch mã cho kết biểu protein tái tổ hợp CrDAT 15 Hình 3.12 Kết phân tích western blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: chuyển gen; WT: đối chứng không chuyển gen 3.3 NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN 3.3.1 Nuôi cấy in vitro dừa cạn Kết nghiên cứu nuôi cấy in vitro dừa cạn cho nhận xét khử trùng hạt dừa cạn cồn 70% phút dung dịch javen 60% 15 phút cho hiệu cao Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm Gây tổn thương cách chẻ dọc dùng mũi dao châm vào đoạn thân mang mắt chồi bên cho hiệu đa chồi cao Môi trường tối ưu tạo đa chồi sở cho thí nghiệm nghiên cứu chuyển gen dừa cạn 3.3.2 Xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua gen chuyển gus Tiến hành biến nạp gen gus vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens Các mẫu biến nạp sau nhiễm khuẩn nuôi tối ngày nhuộm X-gluc để xác định hiệu suất chuyển gen gus (Hình 3.16) Kết chọn lọc sau tuần thu 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %), sau tuần số chồi sống sót 34 mẫu (đạt 9,45%), có 21 chồi rễ Khi đưa môi trường thu 15 sống sót Lấy ngẫu nhiên rễ 15 đem nhuộm X-gluc để kiểm tra biểu gen gus Tất 15 cho kết dương tính xuất màu xanh chàm đặc trưng 16 Hình 3.16 Kết biểu tạm Hình 3.17 Kết biểu gen thời gen gus A: Lá mầm chuyển gus dừa cạn chuyển gen A: gen; B: Đoạn thân chuyển gen; C: Lá chuyển gen gus; B: Rễ Lá mầm không chuyển gen; D: chuyển gen gus; C: Lá không Đoạn thân không chuyển gen chuyển gen; D: Rễ không chuyển gen Như thông qua chuyển gen gus, trình chuyển gen vào dừa cạn tối ưu (i) Vật liệu chuyển gen mầm; (ii) Nồng độ vi khuẩn OD 600nm = 0,8; (iii) Nồng độ acetosyringone 100µM; (iv) Thời gian nhiễm khuẩn 30 phút; (v) Nồng độ kanamycin để chọn lọc chồi chuyển gen 50 mg/l Quy trình chuyển gen gus vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A tumefaciens tóm tắt hình 3.18 17 Hình 3.18 Sơ đồ quy trình chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A tumefaciens KẾT QUẢ CHUYỂN GEN CrDAT VÀ TẠO CÂY DỪA CẠN CHUYỂN GEN 3.4.1 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT tái sinh dừa cạn chuyển gen Lá mầm thu từ hạt dừa cạn nảy mầm sử dụng làm mẫu biến nạp Cấu trúc mang gen CrDAT chuyển vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens lây nhiễm qua nách mầm (Hình 3.19) Kết biến nạp 390 mẫu, qua giai đoạn tái sinh sinh trưởng chồi, chọn lọc kháng sinh tạo 19 chuyển gen CrDAT điều kiện nhà lưới, chiếm 4,87% (Bảng 3.13) Hình 3.19 Hình ảnh biến nạp tái sinh dừa cạn chuyển gen A: Hạt dừa cạn; B: Hạt nảy mầm môi trường MS; C: Lá mầm dừa cạn; D: Nhiễm khuẩn 30 phút; E Đồng nuôi cấy tối; F: Cảm ứng tạo đa chồi; G: 18 Tái sinh đa chồi sau tuần ; H: Tái sinh đa chồi sau tuần; I: Chọn lọc kéo dài chồi; K, L: Ra rễ tạo hoàn chỉnh; M: Cây trồng giá thể Các dừa cạn chuyển gen bầu có xanh tốt đưa trồng vườn thực nghiệm, kết 19 chuyển gen T0 đem trồng mơi trường tự nhiên có sinh trưởng, phát triển bình thường (36,84%) Bảng 3.13 Kết biến nạp cấu trúc CrDAT vào dừa cạn hoa hồng tím Số Số sống Tổng Số mẫu Số Số Đối chứng chồi trồng số tạo chồi thí nghiệm kéo vườn thực mẫu chồi rễ bầu dài nghiệm ĐC0* 30 0 0 * ĐC1 30 25 20 13 12 Lần 80 55 36 28 15 Thí nghiệ Lần 120 86 65 45 20 m Lần 180 92 63 47 35 Tổng 390 233 164 120 70 19 3.4.2 Xác định có mặt hợp gen chuyển CrDAT hệ gen dừa cạn chuyển gen hệ T0 Kết quả kiểm tra dừa cạn được chuyển gen bằng PCR Cây dừa cạn chuyển gen trồng vườn thực nghiệm, chọn sinh trưởng, phát triển tốt để xác định có mặt gen chuyển CrDAT phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacIR (Hình 3.20) Kết cho thấy dòng dừa cạn kiểm tra có băng DNA có kích thước ứng với kích thước gen chuyển CrDAT 1383 bp Gen CrDAT nội dừa cạn có kích thước 1320 bp, khơng có cmyc KDEL; gen chuyển CrDAT chứa điểm cắt enzyme giới hạn XbaI SacI, cmyc KDEL có kích thước 1383 bp Điểm phân biệt gen nội CrDAT gen chuyển CrDAT kết PCR nhân đoạn gen DAT với cặp mồi XbaI-DAT-F/cmyc-KDEL-SacI-R PCR nhân cấu trúc CrDAT-cmyc-KDEL 19 Hình 3.20 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen CrDAT từ dừa cạn chuyển gen M: thang DNA chuẩn kb; (+) đối chứng dương (+) plasmid pBT-CrDAT; (-) Đối chứng âm (-) kết PCR nhân gen CrDAT từ dừa cạn không chuyển gen; 1-7 dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT Bảy dừa cạn chuyển gen dương tính với PCR đối chứng không chuyển gen sử dụng để phân tích Southern blot DNA tổng số dừa cạn chuyển gen đối chứng không chuyển gen, xử lý enzyme giới hạn SacI Kết hình 3.21 cho thấy băng DNA xuất dòng chuyển gen T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6 T0-7; dòng dừa cạn chuyển gen T0-5 đối chứng không chuyển gen không xuất băng DNA Dòng T0-2 T0-4 xuất băng DNA (2 copy), dòng lại T0-1, T0-3, T0-6, T0-7 có copy Hiệu suất chuyển gen tính đến thời điểm phân tích lai Southern 1,54% (6/390) Các dòng chuyển gen cho kết lai Southern tiếp tục đánh giá sinh trưởng phát triển thu hạt phục vụ thí nghiệm phân tích chuyển gen hệ gen T1 3.4.3 Phân tích biểu protein DAT tái tổ hợp hệ T1 Theo dõi sinh trưởng phát triển dừa cạn hệ T0 (T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-6, T0-7) cho thấy có hoa kết (T0-1, T0-3, T0-6, T0-7) hệ T1, hoa khơng cho (T0-2, T0-4) Thu hạt dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7) đem gieo trồng, thu sử dụng cho phân 20 tích biểu đánh giá hoạt động protein tái tổ hợp CrDAT dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1 Hình 3.21 Kết phân tích Southern blot DNA tổng số dừa cạn chuyển gen CrDAT với đoạn dò nptII đánh dấu biotin M: thang DNA chuẩn kb, (+): vector pBI121-CrDAT; 1-7: dòng dừa cạn chuyển gen dương tính với PCR (T0-1; T0-2; T0-3; T0-4; T0-5; T0-6; T07); (-): dừa cạn khơng chuyển gen, Hình 3.22 Kết phân tích Western blot từ dòng dừa cạn chuyển gen đối chứng không chuyển gen (+): protein đối chứng dương; M: thang protein chuẩn; T1-1, T1-3, T1-6, T1-7: protein bốn dừa cạn chuyển gen dương tính với southern blot; (-) protein dừa cạn đối chứng khơng chuyển gen Kết phân tích Western blot hình 3.22 cho thấy, màng lai nitrocellulose xuất băng màu vị trí kích thước khoảng 51 kDa 21 dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1, tương ứng với kích thước phân tử protein CrDAT tái tổ hợp cho kết biểu thuốc chuyển gen Điều chứng tỏ gen chuyển CrDAT bốn dòng dừa cạn chuyển gen T1 biểu dịch mã cho protein CrDAT tái tổ hợp Hiệu suất chuyển gen đến giai đoạn dịch mã 1,02% (4/390) Hình 3.23 biểu thị kết phân tích hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT từ dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT hệ T1 kỹ thuật ELISA cho thấy dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng protein tái tổ hợp dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg, dòng dừa cạn chuyển gen T1-1 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT cao (5,12 µg/mg) dòng T1-3 có hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT thấp (2,86 µg/mg) (Hình 3.24) Hình 3.23 Kết phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ hợp CrDAT dòng dừa cạn chuyển gen T1 (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7 ) đối chứng không chuyển gen (WT) Tuy nhiên, bốn dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1 có sinh trưởng, phát triển bình thường, khơng có khác biệt hình thái chuyển gen khơng chuyển gen (Hình 3.24) 22 Hình 3.24 Các dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1 đối chứng không chuyển gen WT: dừa cạn đối chứng không chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: dòng dừa cạn chuyển gen T1 Tiến hành phân tích hàm lượng alkaloid tổng số dòng dừa cạn chuyển gen T1-1; T1-3; T1-6; T1-7 đối chứng không chuyển gen (WT) kết thu được thể hình 3.25 Hình 3.25 Hàm lượng alkaloid tổng số (g/100g khối lượng khô) dòng dừa cạn chuyển gen hệ T1 đối chứng không chuyển gen WT: dừa cạn khơng chuyển gen; T1-1; T1-3; T1-6; T1-7: dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT hệ T1 3.4.4 Thảo luận kết tăng cường biểu gen CrDAT dừa cạn chuyển gen Dừa cạn (Catharanthus roseus) thuốc có giá trị dược học, sản sinh nhiều TIA vindoline, ajamlicine, serpentine, catharanthine, vinblastine vincristine nhiều hợp chất thứ cấp khác Vinblastine vincristine chất chuyển hóa thứ cấp từ dừa cạn, có giá trị dược học cao sử dụng điều trị ung thư, nhiên hợp chất tổng hợp dừa cạn Để nâng cao hiệu suất tổng hợp alkaloids dừa cạn, nhiều nghiên cứu tiếp cận theo hướng tăng 23 sinh khối nuôi cấy mô, tế bào nuối cấy rễ tơ Ở dừa cạn, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gen nhằm tăng hàm lượng alakloid quan tâm DAT tham gia khâu cuối trình sinh tổng hợp vindoline DAT enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối trình sinh tổng hợp vindoline dừa cạn biểu mạnh gen CrDAT làm tăng hàm lượng protein DAT dẫn đến hiệu hoạt động enzyme DAT tăng cường Nghiên cứu chuyển gen CrDAT phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím vào dừa cạn qua nách mầm nhờ A.tumefaciens nhằm chứng minh tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa DAT cải thiện hàm lượng alakaloid dừa cạn 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Gen CrDAT phân lập từ dừa cạn tách dòng phân tử xác định trình tự nucleotide Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid 1.2 Vector chuyển gen thực vật pBI121-CrDAT thiết kế chuyển vào hệ gen thuốc dừa cạn chuyển gen biểu protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa 1.3 Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l IBA 0,6 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l IBA 0,4 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 1.4 Hiệu chuyển gen CrDAT vào dừa cạn qua nách mầm tối ưu mật độ A.tumefaciens OD600nm= 0,8; AS 100 µM thời gian nhiễm khuẩn 30 phút; chọn lọc kháng sinh Km thích hợp nồng độ 50 mg/l 1.5 Chuyển thành công cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc vào dòng dừa cạn với hiệu suất chuyển gen 1,02% Protein tái tổ hợp CrDAT biểu dòng dừa cạn T1 chuyển gen có khối lượng phân tử khoảng 51 kDa, hàm lượng dao động từ 2,86 µg/mg đến 5,12 µg/mg Các dòng dừa cạn chuyển gen CrDAT có hàm lượng alkaloid tổng số tăng so với dừa cạn đối chứng không chuyển gen từ 3,16 - 15,57 (lần) Đề nghị Tiếp tục phân tích đánh giá bốn dòng dừa cạn chuyển gen (T1-1, T1-3, T1-6, T1-7) hệ T 2, T3, nhằm chọn dòng dừa cạn chuyển gen có hàm lượng alkaloid cao ổn định ... tài luận án: Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa deacetylvindoline-4O-acetyltransferase... động enzyme DAT tăng cường Nghiên cứu chuyển gen CrDAT phân lập từ dừa cạn hoa hồng tím vào dừa cạn qua nách mầm nhờ A.tumefaciens nhằm chứng minh tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa DAT. .. trúc gen CrDAT phân lập từ dừa cạn màu hoa hồng tím màu hoa trắng thu thập Thái Nguyên Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid