UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Mã số đề tài: SV2016-33 Thuộc nhóm ngành khoa học: Xử lý mơi trường Chủ nhiệm đề tài: Lê Thị Thu Tâm Thành viên tham gia: Võ Hoa Cúc Trần Lê Đan Thi Nguyễn Thái Anh Thư Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo Tp Hồ Chí Minh, Tháng4/ 2017 UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC SÀI GÒN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH > Mã số đề tài: SV2016-33 Xác nhận Chủ tịch hội đồng nghiệm thu (ký, họ tên) Giáo viên hướng dẫn (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, tháng 4/2017 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn khử Nitrat nước thải sau qua hầm Biogas số trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” nhóm tơi thực đƣợc hƣớng dẫn ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực, số liệu liệu báo cáo phục vụ cho việc phân tích, nhận xét đánh giá đƣợc thu thập từ nguồn gốc khác đƣợc ghi rõ phần tài liệu tham khảo TPHCM, tháng năm 2017 Chủ nhiệm đề tài Lê Thị Thu Tâm i LỜI CẢM ƠN Đƣợc đồng ý Ban giám hiệu trƣờng Đại học Sài Gòn, Ban Chủ nhiệm khoa Khoa học Mơi trƣờng, em nhóm em tiến hành thực đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn khử Nitrat nước thải sau qua hầm Biogas số trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” với hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu khoa học cấp trƣờng Để hoàn thành nghiên cứu này, em xin thay mặt nhóm để bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS Nguyễn Thị Ngọc Thảo, khoa Khoa học Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sài Gòn ln tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, hỗ trợ bảo tận tình cho chúng em suốt thời gian nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, cán khoa Khoa học môi trƣờng, trƣờng Đại học Sài Gòn giúp đỡ truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu hữu ích trình nghiên cứu cho chúng em Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên em nhóm em nhóm em gặp khó khăn q trình nghiên cứu để chúng em có đủ động lực niềm tin để hồn thành đề tài Tuy nhóm em cố gắng nhƣng báo cáo nghiên cứu tránh đƣợc thiếu sót hạn chế Kính mong nhận đƣợc bảo, đóng góp ý kiến q thầy tồn thể bạn để nhóm hồn thiện nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2017 Chủ nhiệm đề tài Lê Thị Thu Tâm ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .xii MỞ ĐẦU I Lý chọn đề tài II Tổng quan tình hình nghiên cứu II.1 Trong nƣớc II.2 Nƣớc III Mục tiêu đề tài IV Nhiệm vụ nghiên cứu V Phƣơng pháp nghiên cứu VI Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu VI.1 Đối tƣợng nghiên cứu đề tài VI.2 Phạm vi nghiên cứu 10 VII Ý nghĩa đề tài 10 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Tổng quan nƣớc thải chăn nuôi heo sau biogas 11 iii 1.2.1 Tình hình chăn ni heo 11 1.2.2 Tính chất nƣớc thải chăn ni sau biogas: 12 1.2 Tổng quan trình khử nitrat nhờ vi sinh vật 13 1.2.1 Tổng quan chu trình nitrogen tự nhiên 13 1.2.2 Tổng quan trình khử nitrate nhờ vi sinh vật 15 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ khử nitrat 16 1.2.4 Đặc điểm dòng vi khuẩn có khả khử nitrat 17 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 19 2.2 Vật liệu 19 2.2.1 Nguyên vật liệu 19 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.2.3 Hóa chất 20 2.2.3.1 Hóa chất sử dụng 20 2.2.3.2 Môi trƣờng sử dụng 21 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phân lập vi khuẩn 23 2.3.2.1 Đặc điểm sinh trƣởng dòng vi khuẩn 25 2.3.2.2 Phản ứng với thuốc thử diphenylamine 25 2.3.3.2 Phƣơng pháp nhuộm Gram để xác định đặc điểm hình thái 27 2.3.3.3 Xác định đặc điểm sinh lý 28 2.3.4 Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật 30 iv 2.3.4.1 Xác định bƣớc sóng thích hợp dòng vi khuẩn có khả khử nitrate 30 2.3.4.2 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính độ đục mật độ tế bào 30 2.3.4.3 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 2.3.5 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện tối ƣu lên sinh trƣởng phát triển dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 33 2.3.5.1 Ảnh hƣởng nguồn carbon môi trƣờng nuôi cấy 33 2.3.5.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy 34 2.3.5.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết phân lập làm dòng vi khuẩn có khả khử nitrate 36 3.1.1 Phân lập dòng vi khuẩn từ mẫu nƣớc thải 36 3.1.2 Làm dòng vi khuẩn đƣợc phân lập 38 3.1.3 Lƣu trữ bảo quản dòng vi khuẩn đƣợc làm 40 3.2 Xác định khả khử nitrate dòng vi khuẩn 41 3.2.1 Đặc điểm sinh trƣởng dòng vi khuẩn 41 3.2.2 Phản ứng với thuốc thử Diphenylamine 45 3.3 Kết định danh sơ dòng vi khuẩn tuyển chọn 50 3.3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 50 3.3.2 Đặc điểm hình thái tế bào 52 3.3.3 Đặc điểm sinh lý 55 3.3.3.1 Khả sử dụng oxy 55 3.3.3.2 Khả di động 56 v 3.3.4 Kết định lƣợng dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 58 3.3.4.1 Xác định bƣớc sóng thích hợp dòng vi khuẩn 58 3.3.4.2 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính độ đục mật độ tế bào 61 3.3.4.3 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng dòng vi khuẩn 63 3.4 Kết khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho sinh trƣởng dòng vi khuẩn có khả khử nitrate 66 3.4.1 Ảnh hƣởng nguồn carbon 66 3.4.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 68 3.4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ môi trƣờng 69 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Phụ lục 1: Phổ hấp thụ dịch tế bào dòng vi khuẩn 82 Phụ lục 2: Hình ảnh kết thí nghiệm khả sinh trƣởng dòng vi khuẩn mơi trƣờng Giltay lỏng điều kiện kỵ khí 86 Phụ lục 3: Hình ảnh kết thí nghiệm quan hệ với oxy dòng vi khuẩn 89 Phụ lục 4: Kết thí nghiệm khả di chuyển dòng vi khuẩn 90 Phụ lục 5: Thông số mối liên hệ mật độ vi khuẩn độ hấp thụ 92 Phụ lục 6: Giá trị độ hấp thụ dịch huyền phù tế bào biểu diễn trình sinh trƣởng phát triển dòng vi khuẩn môi trƣờng Giltay lỏng 92 Phụ lục 8: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn nguồn carbon khác nhau: Acid citric; Glucose; Pepton điều kiện thiếu khí, khơng sục khí 94 vi Phụ lục 9: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn giá trị pH : 5; 6; 7; 8; điều kiện thiếu khí, khơng sục khí 94 Phụ lục 10: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn giá trị nhiệt độ : 25oC; 30oC; 35oC; 40oC; 45oC điều kiện thiếu khí, khơng sục khí 95 vii BẢN TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NUÔI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Mã số đề tài: SV2016-33 Vấn đề nghiên cứu (vấn đề, tính cấp thiết) Việc tận dụng nguồn vi sinh vật có ích sẵn có nguồn nƣớc bị nhiễm để xử lý nguồn nƣớc đƣợc nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, vi khuẩn có khả khử nitrate lồi vi khuẩn có khả xử lý tốt nguồn nƣớc thải giàu nitơ nên có nhiều nghiên cứu dã ứng dụng chủng vi khuẩn nhiều nơi Tuy nhiên để ứng dụng cách hiệu dòng vi khuẩn việc xử lý nguồn nƣớc thải sau biogas huyện Củ Chi nên đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn khử nitrat nước thải sau qua biogas số trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh” đƣợc thực Mục đích nghiên cứu/mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính sinh lý, sinh hóa dòng đƣợc dòng vi khuẩn có khả khử nitrate từ mẫu nƣớc thải sau hầm biogas trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh Nhiệm vụ/nội dung nghiên cứu/câu hỏi nghiên cứu Phân lập làm dòng vi khuẩn có khả khử nitrat Đánh giá khả khử nitrat dòng vi khuẩn đƣợc thu nhận Định danh dòng vi khuẩn có khả khử nitrat tốt phƣơng pháp sinh lý, sinh hóa Đánh giá đặc tính sinh trƣởng dòng vi khuẩn có khả khử nitrate tốt Đánh giá điều kiện sinh trƣởng tối ƣu dòng vi khuẩn có khả khử nitrat Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp thu mẫu phân tích mẫu; Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn; Phƣơng pháp định danh sinh hóa; Phƣơng pháp định tính; Phƣơng pháp so sánh đánh giá Kết nghiên cứu (ý nghĩa kết quả) sản phẩm (Bài báo khoa học, phần mềm máy tính, quy trình cơng nghệ, mẫu, sáng chế, … Phân lập, làm thuần, lƣu trữ đánh giá khả khử nitrate 55 dòng vi khuẩn mơi trƣờng chọn lọc Giltay Tuyển chọn thu nhận đƣợc 21 dòng vi khuẩn có khả khử nitrate với đặc điểm dòng vi khuẩn gram âm, có khả di chuyển đạt pha cân khoảng thời gian từ 60h đến 120h Đánh giá điều kiện ni cấy tối ƣu phòng thí nghiệm dòng vi khuẩn A1 A3 viii Phụ lục 1: Phổ hấp thụ dịch tế bào dòng vi khuẩn A1 A3 A9 A12 A19 82 A7 A14 Phổ hấp thụ dịch tế bào dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải A 83 B2 B8 B4 B5 B11 B1 B1 Phổ hấp thụ dịch tế bào dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải B 84 C1 C2 C9 C12 C19 Phổ hấp thụ dịch tế bào dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải C 85 C4 C16 Phụ lục 2: Hình ảnh kết thí nghiệm khả sinh trƣởng dòng vi khuẩn mơi trƣờng Giltay lỏng điều kiện kỵ khí Đặc điểm sinh trưởng dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải A 86 Đặc điểm sinh trưởng dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải B 87 Đặc điểm sinh trưởng dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải C 88 Phụ lục 3: Hình ảnh kết thí nghiệm quan hệ với oxy dòng vi khuẩn Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải A Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải B 89 Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải C Phụ lục 4: Kết thí nghiệm khả di chuyển dòng vi khuẩn 90 Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải A Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải B 91 Các dòng vi khuẩn phân lập tuyển chọn từ mẫu nước thải B Phụ lục 5: Thông số mối liên hệ mật độ vi khuẩn độ hấp thụ A1 A3 B2 B15 C1 C12 Độ hấp thụ (Abs) 0,02 0,152 0,586 0,864 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 325 2485 26875 255000 Độ hấp thụ (Abs) 0,008 0,284 0,673 0,985 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 665 2352,5 26850 268750 Độ hấp thụ (Abs) 0,003 0,248 0,621 1,004 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 2585 29525 260500 2445000 Độ hấp thụ (Abs) 0,001 0,218 0,523 0,985 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 3010 23600 308750 3132500 Độ hấp thụ (Abs) 0,002 0,361 0,621 0,912 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 890 21925 292500 2920000 Độ hấp thụ (Abs) 0,005 0,396 0,863 1,237 Số lƣợng tế bào vi khuẩn 30550 219250 2925000 29200000 Phụ lục 6: Giá trị độ hấp thụ dịch huyền phù tế bào biểu diễn trình sinh trƣởng phát triển dòng vi khuẩn mơi trƣờng Giltay lỏng Thời gian 20 40 60 80 100 120 Độ hấp thụ (Abs) 0.032 0.438 1.272 1.693 1.752 1.624 1.321 92 LogN/ml 2.78112 4.05393 6.66852 7.988355 8.17332 7.77204 6.822135 140 1.021 5.881635 Giá trị độ hấp thụ dòng vi khuẩn A1 Thời gian 20 40 60 80 100 120 140 Độ hấp thụ (Abs) LogN/ml 0.012 0.938 1.428 1.993 2.274 1.753 1.395 2.7385672 5.2208028 6.5342968 8.0488358 8.8020844 7.4054918 6.445837 1.122 5.7140332 Giá trị độ hấp thụ dòng vi khuẩn A3 Thời gian OD LogN/ml 0.002 3.5769676 20 0.904 6.1781552 40 1.232 7.1240416 60 1.742 8.5947796 80 2.003 9.3474514 100 1.794 8.7447372 120 1.312 7.3547456 140 0.822 5.9416836 Giá trị độ hấp thụ dòng vi khuẩn B2 Thời gian OD LogN/ml 0.039 3.5242434 20 0.853 6.1132518 40 1.753 8.9757918 60 2.124 10.1557944 80 2.231 10.4961186 93 100 1.732 8.9089992 120 1.112 6.9370272 140 0.724 5.7029544 Phụ lục 8: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn nguồn carbon khác nhau: Acid citric; Glucose; Pepton điều kiện thiếu khí, khơng sục khí Thời Dòng gian (h) VK Acid A1 0,012 0,332 0,971 1,256 1,487 1,413 1,372 1,235 citric A3 0,009 0,562 1,524 2,082 2,134 2,058 1,932 1,824 A1 0,016 0,026 0,159 0,207 0,524 0,397 0,216 0,231 A3 0,005 0,012 0,524 0,948 1,002 0,976 0,624 0,536 A1 0,013 0,358 0,724 1,016 0,976 0,884 0,752 0,593 A3 0,015 0,164 0,832 1,102 1,202 1,093 0,986 0,828 Đối A1 0,008 0,017 0,034 0,058 0,042 0,018 0,009 0,021 chứng A3 0,009 0,007 0,012 0,018 20 40 60 80 100 120 140 Glucose Peptone 0,03 0,03 0,012 0,017 Phụ lục 9: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn giá trị pH : 5; 6; 7; 8; điều kiện thiếu khí, khơng sục khí Thời Dòng gian (h) VK 20 40 60 80 100 120 140 A1 0,011 0,120 0,265 0,421 0,752 0,637 0,526 0,625 A3 0,004 0,009 0,312 0,367 0,648 0,516 0,324 0,284 A1 0,010 0,226 0,519 1,057 1,374 1,279 1,263 1,142 A3 0,008 0,126 0,627 0,925 1,349 1,226 1,084 0,956 A1 0,012 0,758 1,024 2,016 2,026 2,034 1,962 1,626 pH = pH = pH = 94 A3 0,018 0,809 1,134 2,006 2,074 2,008 1,946 1,828 A1 0,009 0,637 0,942 1,972 2,002 1,992 1,372 1,462 A3 0,018 0,809 1,134 2,006 2,074 2,008 1,946 1,828 A1 0,008 0,231 0,351 0,762 1,246 0,935 0,832 0,973 A3 0,007 0,302 0,815 1,394 1,917 1,954 1,974 1,627 pH = pH = Phụ lục 10: Số liệu biểu diễn độ hấp thụ dòng vi khuẩn giá trị nhiệt độ : 25oC; 30oC; 35oC; 40oC; 45oC điều kiện thiếu khí, khơng sục khí Thời Dòng gian (h) VK T = 25oC o 20 40 60 80 100 120 140 A1 0,006 0,230 0,574 0,845 1,043 0,945 0,723 0,553 A3 0,005 0,132 0,426 0,548 0,735 0,726 0,624 0,423 A1 0,010 0,789 1,094 1,932 2,242 2,198 1,943 1,923 A3 0,016 0,752 1,263 1,938 1,972 1,904 1,862 1,624 A1 0,014 0,632 0,986 1,924 2,121 2,142 2,007 1,903 A3 0,007 0,632 1,326 1,753 2,003 2,105 1,963 1,852 A1 0,008 0,413 0,753 1,521 1,984 1,864 1,896 1,725 A3 0,008 0,405 0,726 1,016 1,524 1,472 1,482 1,392 A1 0,011 0,164 0,348 0,756 1,032 1,007 0,908 0,842 A3 0,011 0,246 0,456 0,894 1,045 1,005 0,974 0,894 T = 30 C o T = 35 C o T = 40 C T = 45oC 95 ... KHOA HỌC SINH VI N PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KHỬ NITRAT TRONG NƢỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA MỘT SỐ TRANG TRẠI CHĂN NI HEO TẠI HUYỆN CỦ CHI, THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Mã số đề tài: SV2016-33 Vấn... CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn khử nitrat nước thải sau qua hầm biogas số trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh - Sinh vi n... nƣớc thải sau hầm biogas trang trại chăn nuôi heo huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh - Mục tiêu cụ thể: + Phân lập số dòng vi khuẩn có khả khử nitrate nƣớc thải chăn ni heo sau qua hầm Biogas +Tuyển