Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn(Catharanthus roseus (L.) G. Don) (LA tiến sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN, 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học cơng nghệ, phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Bùi Thị Hà ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Thị Tâm bảo, động viên tận tình hướng dẫn suốt trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh học đại Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi có nhiều góp ý sâu sắc cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Sinh học, thầy cô cán phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Tơi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Y Dược, chân thành cảm ơn đồng nghiệp Khoa Khoa học bản, Trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập công tác Tôi biết ơn người thân gia đình, bạn bè ln động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng 12 năm 2017 TÁC GIẢ Bùi Thị Hà iii MỤC LỤC Lời cam đoan………………………………………………… i Lời cảm ơn……………………………………………………… … ii Mục lục……………………………………………………… ………… iii Danh mục chữ viết tắt luận án…………………………… vi Danh mục bảng luận án…………………………………………… ix Danh mục hình luận án…………………………………………… xi MỞ ĐẦU………………………………………………… …………… 1.Đặt vấn đề…………………………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………… Nôi dung nghiên cứu……………………………………………… Những đóng góp luận án……………………………… … Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án…………………… Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………… 1.1.Alkaloid dừa cạn………………………………… ………… 1.1.1 Vai trò alkaloid thực vật 1.1.2 Alkaloid dừa cạn………………………………………… 1.2 Sinh tổng hợp alkaloid hoạt động enzyme DAT dừa cạn 10 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn………… …… 10 1.2.2 Hoạt động enzyme DAT gen DAT 16 1.3 Nghiên cứu cải thiện hàm lượng alkaloid dừa cạn 18 1.3.1 Định hướng nghiên cứu nâng cao hàm lượng alkaloid dừa iv cạn phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật…………………… 18 1.3.2 Nâng cao hàm lượng vinblastine vincristine kỹ thuật chuyển gen……………………………………………………………… 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 26 2.1 Vật liệu nghiên cứu ……………………………………………… 26 2.1.1 Vật liệu thực vật………………………………………………… 26 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector……………………………… 26 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu……………………… 26 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu…………………………………… 26 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận án…………………… 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………… 27 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử……………………………… 28 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT 32 2.3.3 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc 35 2.3.4 Tái sinh chuyển gen gus dừa cạn 36 2.3.5 Chuyển gen CrDAT vào dừa cạn thông qua A.tumefaciens 41 2.3.6 Phương pháp phân tích chuyển gen 43 2.3.7 Phương pháp tính hiệu suất chuyển gen………………………… 46 2.3.8 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu……………………… 47 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… 48 3.1 Đặc điểm gen CrDAT phân lập từ dừa cạn 48 3.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự nucleotide gen v CrDAT………………………………………………………………………… 48 3.1.2 So sánh trình tự nucleotite gen CrDAT 50 3.2 Thiết kế vector chuyển gen biểu gen CrDAT thuốc 55 3.2.1 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT…… 55 3.2.2 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen 60 3.2.3 Thảo luận kết thiết kế đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121-CrDAT………………………………………………… 66 3.3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh xây dựng quy trình chuyển gen dừa cạn 69 3.3.1 Nuôi cấy in vitro dừa cạn…………………………………… 69 3.3.2 Xây dựng quy trình chuyển gen thơng qua gen gus……………… 75 3.3.3 Kết chuyển gen gus vào dừa cạn 81 3.4 Kết chuyển gen CrDAT tạo dừa cạn chuyển gen 86 3.4.1 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT tái sinh dừa cạn chuyên gen 86 3.4.2 Xác định có mặt hợp gen chuyển CrDAT hệ gen dừa cạn chuyển gen hệ T0 88 3.4.3 Phân tích biểu protein DAT tái tổ hợp hệ T1 91 3.4.4 Thảo luận kết tăng cường biểu gen CrDAT dừa cạn chuyển gen…………………………………………………… 95 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ………………………………………… 99 CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIỆN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN… 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… 101 PHỤ LỤC…………………………………………………………… 118 vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh AS Acetosyringone A Tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A Rhizogenes Agrobacterium rhizogenes BAP Benzylaminopurine 35S Promoter CaMV 35S bp base pair Tiếng Việt Cặp bazơ nitơ cộng cs Môi trường đồng nuôi cấy CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid cDNA Complementary DNA CTAB Cetyltrimethyl ammonium Bromide DAT Deacetyl vindoline 4-Oacetyltransferase DEPC Diethyl pyrocarbonate dNTP Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Phản ứng ELISA GM Germination Medium Môi trường tái sinh gus β-Glucuronidase IAA Indole Acetic acid IPTG Isopropyl β-D-1thiogalactopyranoside DNA bổ sung Gen DAT vii Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog Tên gọi đặt cho môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật mRNA Messenger ribonucleic acid NAA Naphthaleneacetic acid NptII Neomycyn phosphatranferaseII Gen kháng kanamycine OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RNA Ribonucleic acid RM Rooting medium Môi trường tạo rễ rCrDAT Recombinant CrDAT protein Protein DAT tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi TAE Tris Acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật T0, T1 Các hệ chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm T1 Hạt chuyển gen T0 nảy mầm thành T1 viii TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galacto-pyranoside Cây không chuyển gen 107 incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015", Lancet, 388 (10053), pp 1545 – 1602 44 Gajalakshmi S., Vijayalakshmi S., and Rajeswari V (2013), "Pharmacological activities of catharanthus roseus: A perspective review", Internaltional Joural of Phama Bio Sciences, 4(2), pp 431 – 439 45 Goddijin O J M., De Kam R J., Zanetti A., Schilperoort R A., Hoge J H.C (1992), "Auxin rapidly down-regulates transcription of the tryptophan decarboxylase gen from Catharanthus roseus", Plant Molecular Biology, 18(6), pp 1113 – 1120 46 Guillon S., Gantet P., Trémouillaux-Guiller J., Thiersault M., Rideau M (2008), Hairy Roots of Catharanthus roseus: Efficient routes to monomeric indole alkaloid, Bioactive Molecules and Mdicinal Plants, pp 285 – 295 47 Hedhili S., Courdavault V., Giglioli-Guivarc’h N., Gantet P (2007), “Regulation of the terpene moiety biosynthesis of Catharanthus roseus terpene indole alkaloids", Phytochemistry Reviews, 6(2-3), pp 341 – 351 48 Hernandez-Dominguez E., Campos-Tamayo F., Vazquez-Flota F (2004), "Vindoline synthesis in vitro shoot cultures of Catharanthus roseus", Biotechnology Letters, 26(8), pp 671 – 674 49 Hughes E., Hong S., Gibson S., Shanks J., San K., (2004), "Metabolic engineering of the indole pathway in Catharanthus roseus hairy roots and increased accumulation of tryptamine and serpentine", Metabolic Engineering, 6(4), pp 268 – 276 50 Jaggi M., Kumar S., Sinha A K (2011), “Overexpression of an apoplastic peroxidase gen CrPrx in transgenic hairy root lines of Catharanthus 108 roseus”, Applied Microbiology Biotechnology, 90(3), pp 1005 - 1016, doi:10.1007/ s00253-011-3131-8 51 Jefferson R A., Kavanagh T A., and Bevan M W (1987), “GUS fusion: βglucuronidase as a sensitive and versatile gen fusion marker in higher plants”, The EMBO Journal, 6(13), pp 3901 - 3907 52 Jiaqi Liu, Junjun Cai, Rui Wang and Shihai Yang (2017), "Transcriptional Regulation and Transport of Terpenoid Indole Alkaloid in Catharanthus roseus: Exploration of New Research Directions", Internaltional Journal of Molecular Bio Sciences, 18(1), pp.53 53 Jiayi Sun (2016), “Examining the Transcriptional Response of Overexpressing Anthranilate Synthase in the Hairy Roots of an Important Medicinal Plant Catharanthus Roseus by RNA-seq”, BMC plant Biology, 16 (1), pp 108, doi: 10.1186/s12870-016-0794-4 54 Kittakoop P., Mahidol C., Ruchirawat S (2014), "Alkaloids as important scaffolds in therapeutic drugs for the treatments of cancer, tuberculosis, and smoking cessation", Current Topics Medicinal Chemistry, 14 (2), pp 239 252 55 Knaggs A R (2001), "The biosynthesis of shikimate metabolites", Natural Product Reports, 18(3), pp 334 - 355 56 Kumar S., Dutta A., Sinha A K., Sen J (2007), “Cloning characterization and localization of a novel basic peroxidase gen from Catharanthus roseus”, FEBS Journal, 274(5), pp 1290 – 1303 57 Laemmli UK (1970), “Cleavage of structural protein during the assembly of the head of Bacteriophage T4”, Nature, 227, pp 680 - 685 109 58 Laflamme P., St Pierre B., De Luca V (2001), “Molecular and biochemical analysis of a Madagascar periwinkle root - specific minovincinine – 19 hydroxy-O-acetyltransferase, Plant Physiology, 125, pp 189 – 198 59 Levac D., Murata J., Kim W S., De Luca V (2008), “Application of carborundum abrasion for investigating leaf epidermis: molecular cloning of Catharanthus roseus 16-hydroxy-tabersonine-16-Omethyltransferase” Plant Journal, 53(2), pp 225 – 236 60 Liu Z., Park B J., Kanno A., Kameya T (2005), “The novel use of a combination of sonication and vacuum infiltration in Agrobacteriummediated transformation of kidney bean (Phaseolus vulgaris L.) with lea gen”, Molecular Breeding, 16, pp 189 – 197 61 Liscombe D K., Usera A R., O’Connor S E (2010), “Homologue of tocopherol C methyltransferases catalyzes N methylation in anticancer alkaloid biosynthesis”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 107(44), pp.18793 –18798 62 Lo Thi Mai Thu, Vi Thi Xuan Thuy, Le Hoang Duc, Le Van Son, Chu Hoang Ha, Chu Hoang Mau (2016), “RNAi-mediated resistance to SMV and BYMV in transgenic tobacco”, Crop Breeding and Applied Biotechnology, 6, pp 213 - 218 63 Lorena Almagro, Francisco Fernández-Pérez and Maria Angeles Pedreño (2015), Indole Alkaloids from Catharanthus roseus: Bioproduction and Their Effect on Human Health, Molecules, 20(2), pp 2973 - 3000; doi:10.3390/molecules20022973 64 Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V (2006), Identification of a low vindoline accumulating cultivar of Catharanthus roseus (L.) G Don by alkaloid and enzymatic profiling Phytochemistry, 67, pp 1758 – 1764 110 65 Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V (2007), Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy roots Phytochemistry 68(14), pp 1922 – 1931.doi:10.1016/j.phytochem.2007.04.037 66 Marfori E C., Alejar A A., (1993), Alkaloid yield variation in callus cultures derived from different plant parts of white and rosy-purple periwinkle Catharanthus roseus (L.) Don Philippine Journal of Biotechnology, 4(1), pp - 67 Meehan T.D., Coscia C.J (1973), Hydroxylation of geraniol and nerol by a monooxygenase from Vinca rosea Biochemistry Biophys Res Commun 53, pp 1043 – 1048 68 Mei-Liang Zhou, Xue-Mei Zhu, Ji-JongShao, Yan-Min Wu, Yi-Xiong Tang (2012), An protocol for gentic transformation of catharanthus roseus by Agrobacterium rhizogenes A4 Appl Biochemistry Biotechnology; 166(7), pp 1674 - 1684 69 Mohsen Zargar, Farah Farahani, Tahereh Nabavi (2010), Hairy roots production of transgenic Catharanthus roseus L plants with Agrobacterium rhizogens under in vitro conditions, Journal of Medicinal Plants Research, 4(21), pp 2199 - 2200 70 Moreno PRH, Van der Heijden R, Verpoorte R (1995), Cell and tissue cultures of Catharanthus roseus: a literature survey II Updating from 1988 to 1993 Plant Cell Tissue and Organ Culture, 42, pp – 25 71 Murashige, T and F Skoog (1962), Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures, Physiology plant: 15, pp 473 - 479 72 Murray M G., Thompson W F (1980), “Rapid isolation of high molecular weight plant DNA”, Nucleic Acids Res., 8(19), pp 4321- 4325 111 73 Nisa Nur Iskandar and Iriawati (2016), “Vinblastine and Vincristine Production on Madagascar Periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G Don) Callus Culture Treated with Polethylene Glycol”, Makara Journal of Science, 20/1, pp - 16 doi: 10.7454/mss.v20i1.5656 74 Noble R L (1990), “The discovery of the vinca alkaloids–chemotherapeutic agents against cancer” Biochemistry Cell Biology, 68(12), pp 1344 – 1351 75 Noé W., Mollenschott C., Berlin J (1984), “Tryptophan decarboxylase from Catharanthus roseus cell suspension cultures: purification, molecular and kinetic data of the homogenous protein”, Plant Molecular Biology 3(5), pp 281 – 288 76 Nowacki E and Wezyk S., (1960), “Preliminary reseach on lupin alkaloid Toxicity for Rabbit organism”, Rozniki Nauk Rolinkzych, pp 75 - 383 77 O’Keefe B R., Mahady G B., Gills J J., Beecher C W W (1997), “Stable vindoline production in transformed cell cultures of Catharanthus roseus”, Journal of Natural Products 60(3), pp 261 – 264 78 Park B.J., Liu Z., Kanno A., Kameya T (2005), “Transformation of radish (Raphanus sativus L.) via sonication and vacuum infiltration of germinated seeds with Agrobacterium harboring a group LEA gen from B napus”, Plant Cell Reports, 24(8), pp 494 – 500 79 Pahwa D (2008), Catharanthus alkaloids, B Pharm Punjab University Chandigarh 80 Peebles C A., Sander G W., Hughes E H., Peacock R., Shanks J V., San K Y (2011), “The expression of 1-deoxy-D-xylulose synthase and geraniol-10-hydroxylase or anthranilate synthase increases terpenoid indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus hairy roots”, Metabolic England, 13(2), pp 234 – 240 112 81 Power R., Kurz W G., De Luca V (1990), “Purification and characterization of acetyltransferase from acetylcoenzyme Catharanthus A: deacetylvindoline roseus”, Arch 4-O- Biochemistry Biophysology, 279(2), pp 370 - 376 82 Qifang Pan., Quan Wang., Fang Yuan., Shihai Xing., Jingya Zhao., Young Hae Choi., Robert Verpoorte., Yuesheng Tian., Guofeng Wang and Kexuan Tang (2012), “Overexpression of ORCA3 and G10H in Catharanthus roseus Plants Regulated Alkaloid Biosynthesis and Metabolism Revealed by NMR-Metabolomics”, BMC Biotechnology, 7(8), pp 12 - 34 doi: 10.1186/1472-6750 83 Qiu S., Sun H., Zhang A H., Xu H Y., Yan G L., Han Y., Wang X J (2014), "Natural alkaloids: basic aspects, biological roles, and future perspectives", Chinese Journal of Natural Medicines, 12 (6), pp 401 – 406 doi:10.1016/S1875-5364 (14) 60063-7.PMID 24969519 84 Robert A Meyers, Encyclopedia of Physical Science and Technology , 3rd edition ISBN 978-0-12-227410-7 85 Roepke J., Salim V., Wu M., Thamm A M K., Murata J., Ploss K., Boland W., De Luca V (2010), “Vinca drug components accumulate exclusively in leaf exudates of Madagascar periwinkle”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(34), pp 15287 – 15292 86 Russo P., Frustaci A., Del Bufalo A., Fini M., Cesario A (2013), “Multitarget drugs of plants origin acting on Alzheimer's disease”, Current Medicinal Chemistry, 20 (13), pp 1686 - 1693 87 Sambrook J., Russell D W., (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual NeW York, Cold Sping Harbor Laboratory Press 113 88 Santarém ER., Trick HN., Essig JS., Finer JJ (1998), “Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression” Plant Cell Reports, 17 (10), pp 752 – 759 89 Shihai Xing., Qifang Pan., Yuesheng Tian., Quan Wang., Pin Liu., Jingya Zhao., Guofeng Wang1., Xiaofen Sun., Kexuan Tang (2011), “Effect of plant growth regulator combinations on the biosynthesis of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus” Journal of Medicinal Plants Research 5(9), pp 1692 - 1700 90 Smith B D (1966), “Effect of plant alkaloid sparteine on the distribution of the aphid Acythosiphon spartii”, Nature 212, pp 213 - 214 doi:10.1038/212213b0 91 Southern EM (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, Journal of molecular Biology, 98(3), pp 503 - 517 92 Srivastava T., Das S., Kumar Sopory S., Srivastava PS (2009), “A reliable protocol for transformation of Catharanthus roseus through Agrobacterium tumefaciens”, Physiology and molecular biology of plants, 15(1), pp 93 - 98 93 St-Pierre B., De Luca V (1995), “A Cytochrome P-450 Monooxygenase Catalyzes the First Step in the Conversion of Tabersonine to Vindoline in Catharanthus roseus” Plant Physiology 109(1), pp 131 - 139 94 St-Pierre B., Laflamme P., Alarco AM., De Luca V (1998), “The terminal Oacetyltransferase involved in vindoline biosynthesis defines a new class of proteins responsible for coenzyme A dependent acyl transfer” Plant Journal 14(6), pp 703 – 713 114 95 St-Pierre B., Vazquez-Flota FA., De Luca V (1999), “Multicellular compartmentation of Catharanthus roseus alkaloid biosynthesis predicts intercellular translocation of a pathway intermediate” Plant Cell 11(5), pp 887 – 900 96 Stevens LH., Blom TJM., Verpoorte R (1993), “Subcellular localization of tryptophan decarboxylase, strictosidine synthase and strictosidine glucosidase in suspension cultured cells of Catharanthus roseus and Tabernaemontana divaricata” Plant Cell Reports., 12(10), pp 573 – 576 97 Shukla AK., Shasany AK., Verma RK., Gupta MM., Mathur AK., Khanuja SPS (2010), “Influence of cellular differentiation and licitation on intermediate and late steps of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus” Protoplasma 242, pp 35 – 47 98 Sun HJ., Cui ML., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Letters, 580 (2), pp 620 - 626 99 Taha HS., Salah EM., Ola IM., El-Hamshary., Nahla S E A., Naglaa., M N., El-Bahr M., Medhat M., El-Nasr S (2008), “In vitro studies on Egyptian Catharanthus roseus (L.) G Don: III Effects of extra tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase gen copies in indole alkaloid production”, Journal of Cell and Molecular Biology, 2(2), pp 18 - 23 100 Tanaka N., Takao M., Matsumoto T (1994), “Agrobacterium rhizogensesmediated transformation and regenration of vinca minor L” Plant Tissue Culture Letters, 11(3), pp 191 - 198 101 Thanh Son LO., Hoang Duc LE., Vu Thanh Thanh NGUYEN., Hoang Ha CHU., Van Son LE., Hoang Mau CHU (2015), “Overexpression of a soybean expansin gen, GmEXP1, improves drought tolerance in transgenic tobacco” Turkish Journal of Botany 39, pp 988 - 995 115 102 Toki K., Saito N., Irie Y., Tatsuzawa F., Shigihara A., Honda T (2008), “7O-Methylated anthocyanidin glycosides from Catharanthus roseus” Phytochemistry 69 (5), pp 1215 – 1219 doi:10.1016/j.phytochem.2007.11.005 103 Topping J F., Foster G D., Taylor S C (1998), “Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance”, Human Press, Totowa, 81, pp 365 - 480 104 Vancanneyt G., Schmidt R., Connor-Sanchez AO., Willmitzer L., Sosa MR (1990), “Contruction of an intron-containing maker gen: Splicing of the intron in transgenic plants and its use in monitoring early events in Agobacterium-mediated plants transformation” Molecular Gen gent, 220, pp 245 - 250 105 Van der Heijden R., Jabos DJ., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), “The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology” Current medicinal chemistry 11(5), pp 607 – 628 106 Van der Fits L., Memelink J (2000), “ORCA3, a jasmonate - responsive transcriptional regulator of plant primary and secondary metabolism” Science, 289 (5477), pp 295 - 297 107 Vázquez - Flota F., Vincenzo De Luca V (1998), “Jasmonate modulates development and light regulated alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus” Phytochemistry 49(2), pp 395 – 402 108 Vázquez - Flota FA., St-Pierre B., De Luca V (2000), “Light activation of vindoline biosynthesis does not require cytomorphogensis in Catharanthus roseus seedlings” Phytochemistry 55(6), pp 531 – 536 109 Vázquez - Flota F., De Luca V., Carrillo - Pech M., Canto - Flick A., de Lourde M - Ham M (2002), “Vindoline biosynthesis is transcriptionally 116 blocked in Catharanthus roseus cell suspension cultures” Molecular Biotechnology 22(1), pp - 110 Verma P., Mathur AK (2011a), “Direct shoot bud organogensis and plant regenration from leaf explants in Catharanthus roseus Plant Cell”, Tissue and Organ Culture 106(3), pp 401 – 408 111 Verma P., Mathur AK (2011b), “Agrobacterium tumefaciens - mediated transgenic plant production via direct shoot bud organogensis from preplasmolyzed leaf explants of Catharanthus roseus” Biotechnology Letters, 33 (5), pp 1053 - 1060 112 Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., Tang K (2010), “Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase gen promoter” Plant Cell Reports, 29(2), pp 185 - 192 113 Wang Q., Yuesheng Tia., “Development Shihai Xing, Yu Chen., of efficient Qifang Pan., Fang Yuan., Guofeng Wang., catharanthus Jingya Zhao., Kexuan Tang roseus (2012), regenration and transformation system using Agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants“ BioMed Central Biotechnology, pp 12 - 34 doi: 10.1186/1472- 6750-12-34 114 Whitmer S., Canel C., Hallard D., Goncalves C., Verpoorte R (1998), “Influence of precursor availability on alkaloid accumulation by transgenic cell line of Catharanthus roseus” Plant Physiology, 116(2), pp 853 – 857 115 Whitmer S., Canel C., van der Heijden R., Verpoorte R (2003), “Long term instability of alkaloid production by stably transformed cell lines of Catharanthus roseus” Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 74(1), pp 73 – 80 117 116 Zárate R., Verpoorte R (2007), “Strategies for the gentic modification of the medicinal plant Catharanthus roseus (L.) G Don” Phytochemistry Reviews 6(2-3), pp 475 - 491 117 Zhao J., Zhu WH., Hu Q (2001), “Effects of light and plant growth regulators on the biosynthesis of vindoline and other indole alkaloids in Catharanthus roseus callus cultures” Plant Growth Regulation 33(1), pp 43 - 49 118 Zhao L., Sander GW., Shanks JV (2013), “Perspectives of the metabolic engineering of terpenoid indole alkaloids in Catharanthus roseus hairy roots” Advances in Biochemical Eng Biotechnology(;134), pp 23 - 54 119 Woolley JG (2001), Plant Alkaloids Encyclopedia of life science Nature Publishing Group / www.els.net (11 peges) Trang web 120 http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2002/jjones/Content/vincristine.htm 118 PHỤ LỤC Phụ lục Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu P1.1 Sơ đồ cấu trúc vector tách dòng pBT P1.2 Sơ đồ cấu trúc vector pCB-gusplus 119 P1.3 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pRTRA7/3 P1.4 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121 120 Phụ lục Thành phần môi trường sử dụng nuôi cấy in vitro chuyển gen P2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro thuốc Môi trƣờng Thành phần Nảy mầm MS1(20ml/l) + MS2 (20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + (MS) Cảm ứng tạo chồi (GM1) Cảm ứng tạo chồi (GM2) Kéo dài chồi (GM3) MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l); pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l); pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l) + Kanamycin 0,05g/l + cefortaxime 0,4g/l; pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + BAP (0,001g/l) + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,4g/l; pH=5,8 MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + Ra rễ (RM1) MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + mannose (30g/l) + IBA 0,0001g/l + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,25 g/l; pH=5,8 Ra rễ (RM2) MS1(20ml/l) + MS2(20ml/l) + MS3(5ml/l) + MS4(5ml/l) + MS5(5ml/l) + agar (10g/l) + sucrose (30g/l) + IBA 0,0001g/l + Kanamycin 0,05g/l + cefotaxime 0,25 g/l; pH=5,8 * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày 121 P2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy in vitro dừa cạn Môi Thành phần trƣờng GM MS + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100 ml/l bổ sung BAP 0,5mg/l SIM MS + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100ml/l SEM MS + IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l RM MS + IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l P2.3 Thành phần mơi trường ni cấy in vitro dừa cạn chuyển gen Môi Thành phần trƣờng GM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l CCM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100µM + nước dừa 100ml/l + BAP 0,5 mg/l+ IBA 0,4 mg/l SIM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l + nước dừa 100ml/l SIM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 75 mg/l + nước dừa 100ml/l SEM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l RM MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l ... tài luận án: Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase... THỊ HÀ NGHIÊN CỨU TĂNG CƢỜNG BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DAT THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ... SINH TỔNG HỢP ALKALOID VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME DAT Ở CÂY DỪA CẠN 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp alkaloid dừa cạn Trong năm gần đây, đường chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn nghiên cứu chi tiết Ở