i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2016 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SĨI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến Thái Nguyên - 2016 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh iv LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hải Yến - Khoa Khoa học sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn ThS Hồ Mạnh Tường cán nghiên cứu thuộc Phòng cơng nghệ ADN ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô giáo nhà khoa học trực tiếp giảng dạy truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức khoa học quý báu Cảm ơn thầy cô, đồng nghiệp bạn bè tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành luận văn Tơi ln trân trọng biết ơn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở đào tạo thuộc Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trình thực đề tài Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Mai Hoàng Oanh v MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sói rừng .3 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Thành phần hóa học sói rừng 1.1.3 Tác dụng sinh học sói rừng 1.2 Tổng quan mã vạch DNA 1.2.1 Giới thiệu DNA Barcode 1.2.2 Các đặc điểm trình tự barcode 1.2.3 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 1.2.3.1 Trình tự gen nhân 1.2.3.2 Vùng gen mã hóa ribosome 10 1.2.3.3 Trình tự gen lục lạp 10 1.3 Ứng dụng mã vạch DNA nhận biết dược liệu 14 Chương 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu, hóa chất thiết bị .18 2.1.1 Vật liệu thực vật 18 2.1.2 Chủng vi khuẩn 18 2.1.3 Hóa chất 18 2.1.4 Thiết bị sử dụng 19 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái 19 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 20 2.2.2.2 Kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 21 2.2.2.3 Phương pháp nhân gen đích kỹ thuật PCR 22 2.2.2.4 Tinh sản phẩm PCR 24 vi 2.2.2.5 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector 25 2.2.2.6 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli phương pháp sốc nhiệt 26 2.2.2.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony - PCR) 26 2.2.2.8 Tách chiết plasmid từ tế bào E coli 28 2.2.2.9 Phương pháp xác định trình tự gen 29 2.2.2.10 Phương pháp phân tích số liệu 29 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Đặc điểm thực vật học sói rừng thu Lạng Sơn 30 3.2 Phân lập gen từ mẫu sói rừng 32 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 32 3.2.2 Khuếch đại vùng gen nghiên cứu phản ứng PCR 33 3.2.3 Kết ghép nối gen vào vector tách dòng 35 3.2.4 Kết chọn dòng tế bào mang gen tái tổ hợp 36 3.2.5 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 37 3.3 Kết xác định trình tự đoạn đoạn gen nghiên cứu 38 3.3.1 Phân tích trình tự đoạn gen rpoC1 39 3.3.2 Phân tích vùng ITS 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh bp Base pair CBOL Consortium for the Barcode of Life CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleostide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid E coli Escherichia coli IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside UV Ultraviolet LB Luria Bertani ITS-rDNA Internal Transcribed Spacer-rDNA Kb Kilobase OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rDNA Ribosome deoxyribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulphate Sol Solution STS Sequence-Tagged Site TAE Tris - Acetic acid - EDTA Taq polymerase Thermus aquaticus polymerase TE Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X-gal X - - brom - - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 111 Bảng 2.1 Các máy móc thiết bị sử dụng thí nghiệm 19 Bảng 2.2 Thành phần dung dịch đệm rửa 200 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm tách 200 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen ITS 23 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen rpoC1 23 Bảng 2.7 Trình tự mồi dùng phản ứng PCR 23 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng 25 Bảng 2.9.Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang 26 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng colony - PCR 27 Bảng 2.11 Chu trình nhiệt phản ứng colony-PCR 27 Bảng 2.12 Thành phần hóa chất tách plasmid 28 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 41 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu lạng sơn 41 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng gen ITS mẫu sói rừng nghiên cứu với số trình tự ngân hàng gen giới (NCBI) 44 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide đoạn gen ITS 46 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu lạng sơn 46 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh sói rừng tự nhiên Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 25 Hình 3.1 Mẫu Sói rừng thu thập Lạng sơn 30 Hình 3.2 Các phận sói rừng 31 Hình 3.3 Kết điện di DNA tổng số Sói rừng gel agarose 1% 32 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 sản phẩm nhân gen ITS từ cặp mồi đặc hiệu 34 Hình 3.5 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 35 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc sử dụng mồi rpoC1 mồi ITS 37 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid 38 Hình 3.8 Trình tự nucleotide đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng hai trình tự mang mã số EF380352 KP256024 Genbank 40 Hình 3.9 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 mẫu sói rừng với mẫu EF380352 KP256024 Genbank 42 Hình 3.10 Trình tự nucleotide đoạn gen ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế 45 Hình 3.11 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế ………………………………………………… 46 MỞ ĐẦU Theo đánh giá Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh ung thư gánh nặng kinh tế - xã hội quốc gia, trung bình năm có thêm 10 - 16 triệu người mắc bệnh Đây bệnh nguy hiểm, có tỷ lệ tử vong cao Mặc dù có nhiều phương pháp điều trị đại nhằm loại bỏ khối u phương pháp xạ trị, hóa trị, liệu pháp hormon, liệu pháp sinh học, điều trị trúng đích ghép tế bào gốc để ức chế tiêu diệt tế bào ung thư Ngoài ra, người bệnh phải sử dụng thuốc nhằm nâng cao thể trạng, khắc phục hậu khối u gây ra, kéo dài thời gian sống cho người bệnh Tuy nhiên, phương pháp tốn mặt kinh tế [3], [9] Ngày việc sử dụng loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay hợp chất tổng hợp từ chất có nguồn gốc thiên nhiên có xu hướng ngày tăng chiếm vị trí quan trọng y học, chúng có khả chữa trị bệnh cao, an tồn tác dụng phụ Ở Việt Nam tính đến 2005 xác định 3948 loài thực vật nấm, 52 loài tảo biển, 408 loài động vật 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc Đa số thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu quần xã rừng, có gần 10 % số thuốc trồng [1] Kết cho thấy nguồn dược liệu nước ta phong phú đa dạng chủng loại Các nghiên cứu khoa học gần cho thấy Sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb.) Nakai) dược liệu có khả chữa trị bệnh cảm mạo, viêm phổi, viêm ruột thừa, đau lưng số bệnh ung thư ung thư tụy, ung thư dày, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư cuống họng… [2], [12], [21] Tuy nhiên việc nghiên cứu sử dụng thuốc chưa quan tâm mức làm cho khu vực phân bố loài bị thu hẹp trữ lượng loài suy giảm cách nghiêm trọng 40 Hình 3.8 Trình tự nucleotide đoạn rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng hai trình tự mang mã số EF380352 KP256024 ngân hàng gen Phân tích vị trí sai khác cho thấy, trình tự nucleotide gen rpoC1 phân lập từ mẫu Sói rừng có sai khác so với trình tự mang mã số EF380352 10 vị trí sai khác so với trình tự mang mã số KP256024 14 vị trí Các vị trí sai khác trình tự nucleotide mẫu sói rừng so với mẫu EF380352 KP256024 Genbank thể bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide mẫu sói rừng mẫu Genbank thơng tin quan trọng để xây dựng mã vach DNA có mẫu sói rừng khác 41 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 Vị trí điểm sai khác Trình tự nucleotide gen rpoC1 lồi có mã số EF380352 KP256024 SR.rpoC1 A A C 15 A 16 A A G 34 - T C 67 C C T 122 - T C 160 - C T 189 A A G 202 - C T 271 A A C 303 - T G 382 A A G 499 A A G 543 - - G 551 G G A G Bảng 3.2 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu Lạng Sơn 42 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền mẫu sói rừng sở phân tích gen rpoC1 hình 3.9 cho thấy, mẫu SR thu thập từ Lạng sơn – Việt Nam nằm thành nhánh riêng biệt khác hẳn với nhánh lại mang lồi thuộc họ hoa sói cơng bố Genbank (EF380352 phân lập từ sói Chloranthus spicatus KP256024 phân lập từ sói nhật Chloranthus japonicus) Khoảng cách di truyền xác định sở so sánh trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 phân lập từ mẫu sói rừng thu Lạng Sơn trình tự ngân hàng gen 1,0 % Hình 3.9 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn gen rpoC1 mẫu sói rừng với mẫu EF380352 KP256024 Genbank Điều khẳng định tính bảo thủ hệ gen lục lạp thực vật trình tự gen so sánh thuộc loài khác thu từ ba vùng địa lý xa 3.3.2 Phân tích vùng ITS Vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) vùng mã hóa cho đoạn ARN khơng đóng vai trò chức nằm vùng mã hóa cho ARN ribosome nhân Vùng ITS dài khoảng 655 bp gồm ba phần: vùng ITS1 nằm vùng 18S 5,8S có kích thước khoảng 255-261 bp, vùng 5,8S dài khoảng 164 bp vùng ITS2 nằm vùng 5,8S 28S khoảng 216 - 233 bp 43 Đây trình tự thường xuyên sử dụng nghiên cứu hệ thống phát sinh lồi thực vật Từ kết xác định trình tự, tiến hành so sánh mức độ tương đồng vùng ITS mẫu sói rừng nghiên cứu với kết công bố ngân hàng gen giới - NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Kết xác định so sánh trình tự trình bày bảng 3.3 hình 3.10 Kết xác định trình tự thu đoạn gen khoảng 650 bp, với kích thước tính tốn lý thuyết vùng ITS khoảng 655 bp, so sánh trình tự DNA vùng gen ITS mẫu nghiên cứu với trình tự DNA vùng gen ITS loài thuộc chi Sacandra công bố Genbank phần mềm Bioedit kết cho thấy có tỷ lệ tương đồng cao mẫu ITS chúng tơi phân lập trình tự Genbank Vùng ITS mẫu sói rừng nghiên cứu tương đồng 99% so với vùng ITS mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế Kết khẳng định đoạn gen phân lập từ mẫu sói rừng vùng ITS Như chúng tơi nhân xác định trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng từ Lạng Sơn 44 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng vùng ITS mẫu sói rừng nghiên cứu với số trình tự ngân hàng gen giới (NCBI) Tỷ lệ STT Trình tự tương đồng với ITS Mã số tương NCBI đồng (%) Sarcandra glabra isolate shawpc0691I 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal JN407442 99 JN407443 99 spacer 1, partial sequence; and 5.8S KC840060 99 RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sarcandra glabra isolate shawpc0692I 18S ribosomal RNA gene, partial sequence; internal transcribed spacer 1, 5.8S ribosomal RNA gene, and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence Sarcandra glabra subsp brachystachys voucher KUN 200653 internal transcribed ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence Sarcandra glabra voucher KWNU91871 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, KP317601 complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence 99 45 Hình 3.10 Trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng SR trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 ngân hàng gen quốc tế Kết so sánh trình tự đoạn vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng với trình tự Genbank có độ tương đồng giao động từ 99,1 đến 99,4 Sự sai khác giao động từ 0,6 – 0,8 Kết thể bảng 3.5 Mặc dù có hệ số tương đồng tương đối cao, trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu Sói rừng có sai khác so với trình tự mang mã số JN407442, JN407443, KP317601 vị trí, sai khác so với trình tự mang mã số KC840060 vị trí Các vị trí sai khác trình tự nucleotide mẫu SR so với mẫu JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 Genbank thể bảng 3.4 46 Bảng 3.4 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide vùng ITS Trình tự nucleotide gen ITS lồi có mã số Vị trí điểm sai khác JN407442 JN407443 KC840060 KP317601 SR ITS C C T C C 66 G G G G C 102 C C C C T 215 G G G G A 375 C C C C T Bảng 3.5 Hệ số tương đồng hệ số sai khác trình tự nucleotide Hệ số phân ly vùng ITS phân lập từ mẫu sói rừng thu Lạng Sơn Hình 3.11 Sơ đồ hình so sánh mức độ tương đồng đoạn vùng gen ITS mẫu sói rừng với mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 47 Sơ đồ hình hình 3.11 dựa kết so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS cho thấy mẫu sói rừng chia thành nhóm Nhóm thứ gồm mẫu có mã số JN407442, JN407443, KC840060, KP317601 nhóm thứ mẫu Sói rừng Khoảng cách di truyền hai nhánh 0,3% Như dựa vào phương pháp so sánh trình tự ITS, góp phần khẳng định thêm vùng gen ITS mã vạch DNA tiềm cho nhận diện lồi Sử dụng mã vạch DNA có vai trò quan trọng việc nhận diện mẫu thực vật, đặc biệt nhân diện loài thực vật dùng làm thuốc thảo dược, giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm có tầm quan trọng việc nghiên cứu đặc tính đa dạng di truyền Trong nhiều nghiên cứu trước chứng minh trình tự ITS rpoC1 có vai trò to lớn việc nhận diện nguyên liệu thảo mộc Chúng bước đầu nghiên cứu sử dụng hai trình tự gen ITS rpoC1 làm mã vạch DNA Kết giải trình tự phân tích kết thu cho thấy mẫu nghiên cứu có độ tương đồng tương đối cao với trình tự cơng bố Genbank Cùng với nghiên cứu khác giới khẳng định vùng gen ITS rpoC1 giúp nhận diện loài mã vạch phân tử 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I Kết luận Đã nghiên cứu đươc số đặc điểm hình thái sói rừng Cây thân bụi, có rễ phát triển, thân gỗ, mọc đối, kép, có nhánh ngắn, nhỏ mọng Đã tách chiết tinh DNA tổng số mẫu sói rừng từ Lạng Sơn Nhân thành cơng hai vùng gen ITS rpoC1 phương pháp PCR tạo dòng thành cơng hai gen nhân Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 ITS, kết phân tích cho thấy vùng ITS có kích thước khoảng 650 bp đoạn gen rpoC1 có kích thước 550 bp Có hệ số tương đồng cao với trình tự ngân hàng gen giới, từ 97,6 % - 98,4 % với gen rpoC1; Còn với vùng ITS, hệ số tương đồng từ 99,1 - 99,4 % Khoảng cách di truyền mẫu sói rừng thu thập Lạng sơn mẫu Genbank dao động từ 0,3 - 1,0 II Kiến nghị Cần tiếp tục phân tích trình tự ncleotide gen phân loại khác matK, ycf5, trnH-psbA,… cở sở phục vụ xây dựng mã vạch DNA cho sói rừng 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Cục Quản lý Dược (2005), Báo cáo tổng kết công tác dược 2000-2005 [2] Nguyễn Quỳnh Anh (2013), “ Nghiên cứu ứng dụng Sói rừng ( Sarcandra GlaBra (Thunb) Nakai) Cao Bằng để hỗ trợ điều trị số bệnh ung thư”, Khoa học công nghệ Cao Bằng [3] Đái Duy Ban Lữ Thị Cẩm Vân cs (2000) Phòng bênh ung thư Nhà xuất Y học Hà Nội, 150-155 [4] Võ Văn Chi, Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học kỹ thuật, tập 2, 2004 [5] Võ Văn Chi (1999), Từ điền thuốc Việt Nam, NXB Y học [6] Vũ Văn Chuyên, Tóm tắt đặc điểm họ thuốc Việt Nam, Nxb Y học Hà Nội, 1976 [7] Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, 1, tr 287, 1999 [8] Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội [9] Nguyễn Hải Nam (2012) Một số mục tiêu phân tử ứng dụng nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư Nhà xuất Y học Hà Nội, 18-25 [10] Bùi Văn Trọng, Nguyễn Cao Xuân Viên, Nguyễn Thanh Nguyên, (2014), “Ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng tới hình thành rễ hom sói rừng ( Sarcandra Glaban (Thunb.) Nakai.) Lâm Đồng ”, Tạp chí Viện dược liệu Hà Nội, tập 19, số [11] Viện Dược Liệu (1973), Sổ tay thuốc Việt Nam NXB Y học, tr 213 [12] Mai Thị Hải Yến (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng sinh học Sói rừng”, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện quân y 50 Tài liệu tiếng nước [13] Alvarez I., Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29,pp.417-434 [14] Hamilton B.M (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8,pp.513-525 [15] Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, Journal of Evolutionary Biology, (6), pp 558-576 [16] Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philosophical Transactions of the Royal Society, 360 (1462), pp 1889-1895 [17] Collons G.G and Symons R.H (1992), Plant Molecular Biology Reporter., 10,233 [18] Feng S., Xu L., Wu M., Hao J., Qiu SX, Wei X., (2010), A new curmarin from Sarcandra Glabra, Fitoterapia, [19] Huang M.J., Zeng G.Y., Tan J.B., Li Y.L., Jan G.S., Zhou Y.J (2008), Studies on flavonoid glycosides from Sarcandra Glabra, Zhongguo zhong yao za zahi, Vol 33(44), p 1700 – 10702 [20] Huang D., Huang H., Lu Y., (2013), Clinical Observation of Sarcandra glabra combined chemoradiotherapy for treating patients with local advanced nasopharyngeal carcinoma Zhongguo Zhong Xi Yi Jie Za Zhi, 33(4), 456-458 [21] Hu X., Xu X., Yang J., (2008), Progree in research on Sarcandra Glabra Zhongguo Yao Xue Za Zhi, 43 (10), 721-723 51 [22] Hebert P.D.N, Cywinska A., Ball S.L., De Waard J.R., (2003), “Biological indentification through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270,pp.313-321 [23] He R.R., Yao X.S., Li H.Y., Dai Y., Duan Y.H., Li Y.F., Kurihara H., (2009), The anti-stress effects of Sarcandra glabra extract on restraintevoked immunocompromise, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 32(2), 247-252 [24] Jarman S.N., Elliott N.G., (2000), “DNA evidence for morphological an cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, “living fossils” From the Triassic”, Journal of Evolutionary Biology., 13,pp.624-633 [25] Kesanakurthi R.P., Fazekas A.J., Burgess K.S., Percy D.M., Newmaster S.G., Graham S.W., Barrett S.C., Hajibabaei M., Husband B.C., (2011), “Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp.1289-1302 [26] Kress J.W., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A.,Janzen D.H., (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc.Natl Acad.Sci USA, 102,pp.8369-8374 [27] Kress W J., Erickson D L., (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 [28] Kang M., Tang A.Z., Liang G., Yi X., Liu J., (2008), Study on the apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line administrated with Sarcandra glabra extracts in vivo and its mechanism Zhong Yao Cai Vol.31 (10):1529-1533 [29] Leng Y., Li G., Chen S., (2010), Research related to the effectiveness of anti tumor effect of Herba Sarcandra Chin J Mod Drug App, l 4, (6), 16-20 [30] Ole S., Gitte P., (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 [31] Paul D.N Hebert, Alina C., Shelley L.B., Jeremy R.W., (2003), “Biological identifications through DNA barcodes” Proc.R.Soc.Lond.B (270.pp 313-321;DOI 10.1098/rspb.2002.2218 52 [32] Porebski S., Baily L.G., Baum B.R., (1997), Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components Plant Molecular Biology Reporter 15, 8-15 [33] Ratnasingham S., Paul D.N Hebert , (2007), “BOLD: the barcode of life data system”, Molecular Ecology Resources, 7, pp.355-364 [34] Savolainen V., Chase M W., (2003), “A decade of progress in plant molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19), pp 717-724 [35] Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L., (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 [36] Song J.Y., Yao H., Li Y., Li X.W., Lin Y.L, Liu C., Han J., Xie C., Chen S., (2009), Authentication of the family Polygonaceae in Chinese pharmacopoeia by DNA barcoding technique J Ethnopharm 124: 434–439 [37] Storchova H., Olson M S., (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life Sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 [38] Sun W., Li J., Lan F., (2014), “Antitumor activities of Zhongjiefeng injection on FC in mice with precarcinoma of stomach and its toxicity”, Chinese Traditional Patent Medicine Journal , (3), 169-171 [39] Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., Eske W., (2007), “Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 [40] 徐国良,肖兵华,陈奇(2005),肿节风及其分离部位对免疫性血小板 减 少性紫癜小鼠血小板的影响.中国实验方剂学杂志,11(4),120-124 53 Từ Quốc Lượng, Tiêu Tân Hoa, Trần Kỳ (2005) Tác dụng thũng tiết phong thành phần thuốc tới tiểu cầu chuột xuất huyết giảm tiểu cầu Tạp chí thực nghiệm Trung Quốc, 11(4),120-124 [41] Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W., (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 [42] Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders ,(2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 [43] Vijayan K., Tsou C H., (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 [44] Wang X., T.Y., Yoshimaru H., Nagasaka K., Szmidt A.E., (1999), “Phylogenetic relationships of Eurasian pines (pinut, Pinaceae) based on chloroplast rbcL, matK, rpl120-rps18 spacer, and trnV intron sequences”, American Journal of Botany 86,pp.1742-1753 [45] Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010), “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 [46] Wang A.Q., Feng S.C., He X., Xu R.S., (1988), A new sesquiterpen lactone from Sarcandra Glabra, Yao xue xue bao, Vol 23 (1): 64 – 66, [47] Wen J., Li J., Lan F., Yan G (2003), “Antitumor effect of Zhongjiefeng Injection on mice liver cancer HepA22 and its toxicity” Chinese Traditional Patent Medicine Journal, 4, 39-43 [48] Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of 54 single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 [49] Xu X.D., Hu X.R., Yuan J.Q., Yang J.S., (2008), Studies on chemical constituents of Sarcandra glabra, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi Vol 33(8): 900-902 [50] Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J., (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 [51] Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L., Hui Y (2010), “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 [52] Yuan K., Zhu J.X., Si J.P., Cai H.K., Ding X.D., Pan Y.J (2008), Studies on chemical constituents and antibacterial activity from n-butanol extract of Sarcandra glabra Zhongguo Zhong Yao Za Zhi Vol 33: 1843-1846 [53] Zhang Z., Liu W., Zheng Y., Jin L., Yao W., Gao X., (2014), SGP-2, an acidic polysaccharidee from Sarcandra Glabra inhibits proliferation and migration of human osteosarcoma cell Food Funct, 5, 16 ... phân loại sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai)  Mục tiêu nghiên cứu - Mô tả số đặc điểm hình thái sói rừng (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai - Xác định số trình tự gen phân loại sói rừng. .. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - MAI HOÀNG OANH NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TRÌNH TỰ GEN PHÂN LOẠI CÂY SÓI RỪNG (Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai) Chuyên... Sarcandra Glabra (Thunb. ) Nakai  Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm thực vật học sói rừng - Nghiên cứu thơng tin trình tự gen rpoC1 ITS Nhân tách dòng hai đoạn gen rpoC1 ITS - Xác định, phân