Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện này tại Việt nam, tai biến mạch máu não là căn bệnh gây tử vong thứ 2 sau các bệnh về tim mạch, khoảng 200.000 người mắc bệnh/năm và có tới 50% tử vong. Nattokinase là một enzym tiêu huyết khối mạch mẽ và mọt enzym thuộc nhóm của protease. Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Vì vậy, Bacillus subtilis natto có khả năng tạo enzym protease này và những enzym khác như amylase, vv. Vì vậy chung tôi tiến hành khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto”.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện này tại Việt nam, tai biến mạch máu não là căn bệnh gây tử vong thứ 2 sau các bệnh về tim mạch, khoảng 200.000 người mắc bệnh/năm và có tới 50% tử vong. Nattokinase là một enzym tiêu huyết khối mạch mẽ và mọt enzym thuộc nhóm của protease. Protease là enzym được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzym trong sản xuất. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Vì vậy, Bacillus subtilis natto có khả năng tạo enzym protease này và những enzym khác như amylase, vv. Vì vậy chung tôi tiến hành khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto”. Khóa luận gồm có hai mục tiêu: 1. Xác định enzym do Bacillus subtilis natto tạo ra 2. Khảo sát một số thông số ảnh hưởng đến khả năng tạo enzym protease của Bacillus subtllis natto. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 BACILLUS SUBTILIS 1.1.1 Phân loại khoa học 2 Giới: Bacteria; Ngành : Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis. 1.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis là loại trực khuẩn hình que, bắt màu Gram (+), hiếu khí. Đa số các chủng Bacillus subtilis có khả năng hình thành nội bào tử cho phép vi khuẩn chịu được điều kiện khắc nhiệt của môi trường như nhiệt độ cao, pH acid, nồng độ muối cao, cạn kiệt dinh dưỡng… Đến khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm thành vi khuẩn và phát triển bình thường. Bacillus subtilis lập lại vi khuẩn gram dương có kích thước 2-3x0,7-0,8(µm), nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8x0,8(µm). Khi nhuộm ogietka, tế bào vi khuẩn bắt màu đỏ, bào tử màu xanh. Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiểu vi 1.1.3 Khả năng sinh Protease của vi khuẩn Bacillus subtilis Bacillus subtilis là vi khuẩn có khả năng sản xuất protease có hoạt tính cao để sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, và y học. 1.1.4 Ứng dụng (Xem của Hương) 3 Ngày nay Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp vì nó sản xuất ra 2 loại protease ngoại bào là nhóm kiềm tính subtilisin và protease A trung tính. Trong lĩnh vực y tế: Vi khuẩn thuộc chì Bacillus, được phân lập bằng kỹ thuật rắc đất, được sử dụng trong sản xuất kháng sinh. kháng sinh Bacitracin được xác định là có tác dụng trên vi khuẩn Gram dương [18]. Các kháng sinh khác mà Bacillussubtilis tạora là polymyxin, difficidin, subtilin, và mycobacillin. Polymyxin có tác dụng chống lại các vi khuẩn Gram âm, trong khi difficidin có phổ rộng hơn [19]. Bacillus subtilis tiết ra vi nhiều enzym, chẳng hạn như amylase, protease, pullulanase, chitinase, xylanase, lipase. Những enzym này được sản xuất thương mại và những enzym này đại diện cho khoảng 60% ngành thương mại sản xuất enzym công nghiệp [17]. Hiện nay được dùng nhiều trong các chế phẩm probiotic với tác dụng B. subtilis có khả năng sản sinh nhiều enzym, quan trọng nhất là amylase và protease 2 loại enzym thuộc hệ thống men tiêu hóa. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram (-), Gram (+) và nấm gây bệnh. B. subtilis tồn tại trong chế phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống vào dạ dày không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột, bào tử nẩy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử dụng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm chứa B. subtilis ví dụ như Biosubtyl, Biobaby được chỉ định trị tiêu chảy, viêm ruột cấp và mãn tính, rối loạn tiêu hóa, trẻ em đi ngoài phân sống, viêm đại tràng .[29]. B. subtilis có hoạt tính diệt nấm tự nhiên, và được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học. Nó được sử dụng để sản xuất amylase. Nó được 4 sử dụng để sản xuất axit hyaluronic, đây là những enzym hữu ích trong lĩnh vực y tế [20]. Trong lĩnh vực thủy sản Hầu hết những loài Bacillus không độc hại đối với động vật. Enzym do vi khuẩn Bacillus tiết ra phân hủy rất có hiệu quả các chất như carbohydrat, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn. Bacillus cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi bổ sung vi khuẩn này vào môi trường nuôi tôm sú thì tỉ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể và hệ miễn dịch tăng lên rõ rệt. Ngoài ra, chúng còn hạn chế vi khuẩn có hại trong đường ruột và trong môi trường giúp chuyển hoá hiệu quả thức ăn và khống chế vi khuẩn gây bệnh. Chế phẩm vi sinh vật hữu ích có 2 loại là loại dùng để xử lý môi trường và loại trộn vào thức ăn cho tôm cá [6]. Các tác dụng khác * Dùng làm chất kích thích tăng trưởng cho cây trồng [7]. * Chất tẩy rửa Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzym vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể con người tiết ra. Một tiêu chuẩn quan trọng khác của các protease dùng trong chất tẩy rửa là hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độ và pH cao cũng như phải thích hợp với các tác nhân oxy hóa và các chất kìm hãm có trong thành phần của chất tẩy rửa. ⃰ Công nghiệp thuộc da 5 Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như Natri sulfit, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzym để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường. Các vi sinh vật thuộc chi Bacillus được sử dụng làm probiotic từ ít nhất 50 năm nay. Tuy nhiên, các nhà khoa học thực sự quan tâm đến probiotic thuộc chi Bacillus mới chỉ 15 năm lại đây và thông tin này được mô tả khá rõ trong ba bài báo tổng quan của tác giả Hong và đồng sự, 2005; Mazza, 1994; Sanders và đồng sự, 2003. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis. Bào tử bền nhiệt có nhiều ưu điểm so với các loài không có khả năng sinh bào tử như các loài thuộc chi Lactobacillus spp… Thứ nhất là sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng ở điều kiện khô mà không bị ảnh hưởng đến độ sống. Ưu điểm thứ hai là bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày (Barbosa et al., 2005; Spinosa et al., 2000), trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt (Tuohy et al., 2007). Chính vì vậy một liều lượng nhất định của bào tử có thể được bảo quản vô thời hạn không cần để trong tủ lạnh và toàn bộ bào tử trong liều dùng đó sẽ được đi vào ruột để phát triển thành vi khuẩn sống và phát huy tác dụng [26]. 1.1.5 Bacillus subtilis natto Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto, Bacillus subtilis var. natto. Bacillus subtilis natto là một chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905. 6 Bacillus subtilis natto phát triển rất nhiều trong đậu nành. Vi khuẩn này cũng phát triển trên loại đậu khác, trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật khác như tảo biển, trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như cá, thịt, tôm, cua và trong sản phẩm bơ sữa. Bacillus subtilis natto sử dụng nguồn carbon là glucose, saccarose, fructose . trong đó saccarose cần thiết cho vi khuẩn phát triển và sản xuất chất nhớt. Bacillus subtilis natto cũng cần biotin, trong môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm được [1]. Bacillus subtilis natto cần oxy có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh bào tử là 40 o C, nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là giữa 39 và 43 o C. Ở 55 o C vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Bacillus subtilis natto phát triển ở pH trung tính. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH=4,5 hoặc thấp hơn. Subtilisin là protease của Bacillus subtilis natto và là endoprotease. pH tối thích cho enzym này là 7,0 khi cơ chất là casein và hoạt tính ở pH=10 thì tương tự ở pH=7,0 [1]. 7 1.2 PROTEASE 1.2.1 Cấu trúc chung Protease (Proteinases, Peptidases hoặc enzym thủy phân protein) là các enzym phá vỡ liên kết peptit giữa các amino acid của protein. Quá trình này được gọi là phân cắt proteolytic, một cơ chế chung của kích hoạt hoặc bất hoạt các enzym đặc biệt là liên quan đến đông máu hoặc tiêu hóa. Chúng sử dụng một phân tử của nước và do đó được phân loại như hydrolases [3]. Nhóm enzym protease (peptit – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển amino acid [3]. Hình 1.2. Mô hình enzym Protease thủy phân phân tử Protein Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa .) và động vật (gan, dạ dày bê .). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzym rất giống nhau về cấu trúc, 8 khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất [3]. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.3. Cấu trúc trung gian enzym protease 1.2.2 Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3(E.C.3.4) . Hình 1.4. Sơ đồ phân loại được tóm tắt 9 Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. * Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid. Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi polypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ là chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm Subtilisin bao gồm hai loại enzym vi khuẩn như Subtilisin carlsberg, Subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như: pepsin, chymosin, 10 cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA [3][5][6]. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid : pH 2-4 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9-11 1.2.3 Ứng dụng enzym protease Trong Y học: Sử dụng nhiều protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương [6]. Trong chế biến thủy sản: Trong chế biến nước mắm sử dụng enzym protease thực vật ( bromelain, papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong công nghiệp sữa : Sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Ví dụ : Renin, Pepsin, và một số protease vi sinh vât: A. candidus, P. roquerti, B. mensentericus… Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy: Protease làm giảm thời gian đảo trộn tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc, protease của A. oryrae dùng thủy phân protease trong hạt ngủ cốc tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn.