09/02/2015 Phần Chuyên đề Ứng dụng CNSH để khai thác hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học Hệ thống trao đổi chất sinh vật 06/02/2015 Trao đổi sơ cấp • Trao đổi chất sơ cấp loại trao đổi chất liên quan trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển sinh sản bình thường sinh vật Trao đổi chất sơ cấp liên quan trực tiếp đến chức sinh lý bình thường sinh vật • Q trình chuyển hóa xảy bên tế bào sinh vật cần thiết để trì hoạt động sống Trong trao đổi chất nhiều chất bị phân giải để thu nhận lượng chất khác cần thiết cho sống lại tổng hợp • Trao đổi chất sơ cấp xảy tất sinh vật, mang tính đặc thù lồi, tế bào, mơ • Ngược lại, trao đổi chất thứ cấp không liên quan trực tiếp đến q trình có vai trò chức sinh thái Trao đổi chất sơ cấp có mặt số taxon (thực vật, nấm, vi khuẩn…) • • • • • • • Trao đổi thứ cấp • Là dạng trao đổi chất tạo hợp chất hữu không liên quan trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển sinh sản bình thường sinh vật Khơng giống trao đổi chất sơ cấp, khơng có thiếu chất trao đổi thứ cấp không ảnh hưởng nghiêm trọng chết sinh vật nhiên lại ảnh hưởng đến khả sống sót, mức độ sinh sản, thẩm mĩ, hình dạng khơng ảnh hưởng • Trao đổi chất thứ chất thường hạn chế số loài nhóm sinh vật nằm nhánh tiến hóa định • Chất trao đổi thứ cấp thường liên quan đến khả đề kháng thực vật với động vật ăn lá, trùng • Đối với người, chất trao đổi thứ cấp thường dùng để làm thuốc, hương liệu làm vật liệu trung gian để tổng hợp hóa học Một số khái niệm Con đường trao đổi chất (Metabolic pathway) Metabolism Metabolite Secondary metabolite Antimetabolite Metabolic control analysis Metabolome Metabolomics (the study of global metabolite profiles in a system (cell, tissue, or organism) under a given set of conditions • Là loạt phản ứng hóa học xảy tế bào thường xúc tác enzyme, ion kim loại, vitamin, cofactor • Tập hợp đường trao đổi chất đan xen với gọi mạng lưới trao đổi chất • Các đường trao đổi chất giúp trì mối cân động bên tế bào thể • Catabolic pathway (con đường dị hóa) Anabolic pathway (con đường đồng hóa) trái ngược Con đường đồng hóa tạo phân tử sinnh học 09/02/2015 Trao đổi chất… • Một đường trao đổi chất liên quan đến biến đổi bước phân tử ban đầu thành sản phẩm khác Sản phẩm trao đổi chất sử dụng theo cách:  Sử dụng ngay, sản phẩm cuối đường trao đổi chất vừa tạo  Khởi động đường trao đổi chất khác (tiền chất cho đường khác)  Dự trữ tế bào • Một phân tử gọi chất vào đường trao đổi chất phụ thuộc vào nhu cầu tế bào mức độ sẵn có chất Khi nơng đột chất trung gian đồng hóa dị hóa tăng lên sản phẩm cuối ảnh hưởng đến tốc độ trao đổi chất đường định Carbohydrate metabolism Tổng quan đường trao đổi chất • Mỗi đường trao đổi chất bao gồm loạt chuỗi phản ứng hóa học liên hệ chặt với chất, chất chuyển hóa trung gian sản phẩm chuỗi • Con đường trao đổi chất thường xem dòng chiều, phản ứng hóa học có tính chất thuận nghịch Chẳng hạn q trình tổng hợp amino acid theo đường định trình phân giải lại theo đường riêng biệt • Một ngoại lệ đường đường phân (glycolysis) phân giải glucose số phản ứng đường đường phân lại tham gia vào trình tổng hợp glucose (gluconeogenesis) Glycolysis vs Glycogenesis Vai trò hormon điều hòa troa đổi chất 09/02/2015 Trao đổi chất kị khí Metabolic pathways Các thành phần đường trao đổi chất chất trao đổi sơ cấp • • • • • • Trao đổi chất thứ cấp Amino acids and proteins Lipid Carbohydrates Nucleotides Coenzymes Minerals and cofactors Shikimic acid pathway Mevalonate pathway 09/02/2015 Mevanonate and non-mevalonat pathway Phần Cơ chế điều hòa trao đổi chất Cơ chế điều hòa trao đổi chất • Điều hòa enzyme • Điều hòa hormon • Điều hòa thụ thể Tương tác khơng cộng hóa trị Điều hòa dị lập thể • Ức chế dị lập thể – Tăng Km (giảm lực gắn enzyme) – Giảm Vmax (giảm tốc độ phản ứng enzyme) Tương tác khơng cộng hóa trị Điều hòa dị lập thể • Chất hoạt hóa dị lập thể – Giảm Km (tăng lực enzyme với chất) – Tăng Vmax (tăng khả xúc tác enzyme) Tương tác khơng cộng hóa trị Tương tác protein – protein • Calmodulin (CALcium MODULted proteIN) – Gắn Ca++ với calmodulin dẫn đến thay đổi hình dạng cho phép gắn hoạt hóa số enzyme 09/02/2015 Gắn calcium vào Calmodulin thay đổi hình dạng protein Unbound Calmodulin on left Calcium bound Calmodulin on right Stars indicate exposed non-polar ‘grooves’ that non-covalently binds proteins Điều hòa hoạt động enzyme tương tác cộng hóa trị • Enzymes activating enzymes allows for amplification of a small regulatory signal Điều hòa tương tác cộng hóa trị Phosphorylation Dephosphorylation • Gắn loại bỏ nhóm Phosphate (serine, threonine, or tyrosine)  thay đổi hoạt tính enzyme Thay đổi số lượngenzyme • Enzyme Cảm ứng vs Cơ định • Cảm ứng tăng tốc độ phiễn mã – Hormones hoạt hóa TFs • Tăng tổng hợp mRNA • Tăng tổng hợp số enzyme Hormones, Receptors, Sự tương tác tế bào • Thụ thể tế bào • Các hormon hòa tan lipid Phần Hợp chất tự nhiên • Các hormon steroid, vitamin D, retinoids, thyroxine • Gắn với thụ thể protein – Gắn với yếu tố điều hòa (cis/trans) gene – Thay đổi tốc độ phiên mã • Cảm ứng ức chế phiên mã 09/02/2015 Hợp chất tự nhiên Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng Định nghĩa • Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo đường • Là hợp chất hóa học tạo cách tự nhiên sinh vật mevalonic (sesquiterpene dẫn xuất) có hoạt tính sinh dược học sử dụng để sản xuất dược phẩm, • Phenol/polyphenol: hợp chất chứa vòng thơm thuốc… • tổng hợp theo đường acid shikimic acid Hợp chất tự nhiên bao gồm hợp chất tổng hợp malonic (flavonoid) hoàn tồn đường hóa học với đặc điểm tính • Hợp chất chứa nitơ: từ amino acid (alkaloid) chất giống với hợp chất tổng hợp sinh vật Ví dụ: Hợp chất tự nhiên ức chế ung thư Ứng dụng hợp chất tự nhiên • • • • • • Thuốc chữa bệnh (ung thư, trợ tim, thần kinh) Kháng sinh, kháng viêm Chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch Diệt trùng, ký sinh Hương liệu Chất màu bổ sung thực phẩm • • • Gắn với tubulin Ức chế topoisomerase Ức chế telomerase 09/02/2015 Tubulin chất gắn với tubulin • Vi ống protein dạng sợi cấu tạo từ tubulin Trong trình phân bào, NST gắn vào vi ống để di chuyển phía trung tử • Các tế bào ung thư phân chia mạnh Nếu can thiệp vào trình gắn vi ống với NST ức chế trình nhân lên tế bào ung thư • Gắn với tubulin ức chế tế bào ung Tương tác chất gắn tubulin dẫn đến thay đổi cấu trúc ảnh hưởng đến chức tế bào thư Topoisomerase Topoisomerase • Topoisomerase tham gia vào q trình chép sửa chữa DNA • Topoisomerase kiểm sốt trạng thái xoắn phân tử DNA cách cắt nối liên kết phosphodiester phân tử DNA Topoisomerase inhibitors • Là chất ức chế hoạt động enzyme Topoisomerase • Topoisomerase coi đích để phát triển chất chống ung thư Ức chế hoạt động Topoisomerase các phân tử DNA sợi đơn ngắn đoạn DNA mạch kép bị cắt  thay đổi tính tồn vẹn genome • Nhưng tế bào bị đứt gãy DNA bị chết theo chế apoptosis 09/02/2015 Nguồn hợp chất tự nhiên • • • • • • Mô thực vật Sinh vật biển (rong, tảo) Động vật (trên cạn, biển) Nọc độc Nấm/vi nấm Vi sinh vật Những khó khăn khai thác hợp chất tự nhiên • Chỉ có mặt số lồi sinh vật định • Chỉ có hoạt tính điều kiện ni trồng tự nhiên • Chỉ có hoạt tính dạng cấu trúc định, dạng đồng phân khác khơng có hoạt tính hoạt tính thấp • Cải biến đặc hiệu vị trí đường hóa học khó khăn (gắn nhóm chức) • Hàm lượng thấp, khó tinh 09/02/2015 Khai thác hợp chất tự nhiên Lên men vi sinh vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi vi tảo Khó khăn: hoạt tính thấp khơng có hoạt tính Xu hướng khai thác hợp chất tự nhiên • Tách chiết từ nguồn tự nhiên • Tìm nguồn hợp chất Natural compounds Tách chiết từ thực vật, vi sinh vật, nấm Khó khăn: tinh triển khai quy mơ lớn, chi phí cao • Tổng hợp hóa học • Cải biến hóa học • Cải biến xúc tác enzyme • Sử dụng hệ thống xúc tác tế bào để chuyển hóa • Sử dụng sinh vật chuyển gene Tổng hợp hóa học Khó khăn: sản phẩm phụ, độc, đồng phân khơng mong muốn Chuyển hóa enzyme Khó khăn: hiệu cao đắt Con đường tổng hợp hợp chất tự nhiên Sinh vật Các đường tổng hợp Vi khuẩn MVA MEP Vi khuẩn cổ MVA Tảo lục MEP Thực vật Shikimic, MVA, MEP Động vật MVA Nấm MVA MVA MEP 09/02/2015 Chuyển hóa sinh học Chuyển hóa sinh học Q trình chuyển hóa sinh học tạo nhiều hợp chất có đặc tính hóa học, sinh dược học Nhà máy tế bào Tiền chất Tiền chất Sản phẩm Tế bào Giá trị thấp Hoạt tính thấp Khó cải biến đường hóa học Tế bào bình thường Tế bào cải biến di truyền Giá trị cao Hoạt tính mạnh Bền vững Làm để có tiền chất? Plants Mevalonate pathway (MEP) Microalgae Microbe Sikimic acid pathway Công nghệ sinh học sản xuất hợp chất tự nhiên Non-mevalonate pathway (MVA) Tế bào có nhiều đường trao đổi chất  thu tiền chất Nguồn gene Khai thác liệu Các đường trao đổi chất Chuyển gene mong muốn Tiền chất • Khai thác sinh khối hệ thống xúc tác tế bào Tế bào chủ Kiểm tra hoạt tính • • • • Ức chế ung thư Chống oxy hóa Diệt trùng Bệnh Phân tích Chuyển hóa Sản phẩm cuối Cơng nghệ sinh học • • • • • UV-vis HPLC Spectrofluorometer NMR MALDI MS – Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men • Chuyển gene – Thực vật: photobioreactor – Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men Nâng quy mô lớn Phát triển sản phẩm 10 09/02/2015 Reference data, Martin et al., 2001; Jackson et al., 2003; Martin et al., 2003; Ro et al., 2006; Takahashi et al., 2007, Asadollahi et al., 2008; Wang et al., 2011a; Albertsen et al., 2011; Peralta-Yahya et al., 2011; Westfall et al., 2012 Ví dụ Artemisinin • Tế bào nấm men dùng, biểu gene mã hóa enzyme amorphadiene synthase cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1) Món ngon Model of induction of l-glutamate production in C glutamicum Paclitaxel Artemisia annua Chất chống sốt rét Taxus brevifolia Sử dụng dạng paclitaxel (Taxol) để chống ung thư hiệu nhiều năm Chuyển hóa thơng qua đường tổng hợp terpen Tồn cụm gene chuyển hóa đưa vào E.coli nấm men Ví dụ: Sản xuất axit glutamic Nắm đường trao đổi chất (khai thác CSDL) Nakamura J et al Appl Environ Microbiol 2007;73:4491-4498 11 09/02/2015 Terpene production in E coli: FPP source of host cell Mevalonate vector Acetyl-CoA Pyruvate Glyceraldehyde-3-phosphate Acetyl-CoA Acetyl-CoA acetyltransferase pAC-Mev Ptac DXP synthase CoA P15A ori DXP Acetoacetyl-CoA 10.6 kbp Acetyl-CoA TrrnB IPP PMVA HMG CoA HMG CoA kinase isomerase reductase synthase NADP+ CoA MEP HMG-CoA Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes 2NADPCoA MVA ATP MVA kinase ADP CDP-ME ATP DPMVA decarboxylase Terpenoids HMB-PP synthase HMB-PP DPMVA IPP isomerase Sesquiterpene IPP GPP GPP synthase IPP FPP synthase DMAPP Sesquiterpene cyclase MCS Bổ sung nhóm chức Oxy hóa xếp lại khung C HMB-PP reductase ADP, Pi, CO2 IPP TrrnB IPP DPMVA PMVA MVA Ptac kinase decarboxylase kinase isomerase Terpenes MEcPP synthase MEcPP ADP Cmr P15A ori ATP CDP-ME kinase Mevalonolacto ADP CDP-ME-2-phosphate ne PMVA 8.5 kbp Cải biến hóa học Chuyển hóa enzyme Pi ATP PMVA kinase pAC-Mv CTP MEP cytidyl transferase 2NADPH HMG-CoA reductase DPMVA decarboxylase NADPH DXP reductoisomerase HMG-CoA synthase MVA kinase Ví dụ Chuyển hóa terpenoids MEP pathway MVA pathway Cmr FPP quinone and cell wall biosynthesis Cytochrome P450 Cytochrome P450 Hệ thống enzyme oxy hóa khử vơ hiệu • Phản ứng phổ biến xúc tác P450 phản ứng monooxygenase (đưa nguyên tử oxy vào chất, nguyên tử oxy khác bị khử thành nước) • P450s nhiều nhà nghiên cứu quan tâm • P450s sử dụng phản ứng oxy hóa vào vị trí khó (tổng hợp chuyển hóa hóa học khơng thể thực được) Phản ứng oxy hóa định hướng (stereospecific conversion ) Có khả đưa nguyên tử oxy vào vị trí liên kết đơi liên kết C-H chưa hoạt hóa, vị trí nguyên tử C bão hòa (allylic positions) Tỉ lệ thuốc kháng nấm chuyển hóa enzyme Cytochrome P450 12 09/02/2015 Terpene cyclase Là enzyme vòng hóa, xúc tác phản ứng tạo vòng hóa học Valencene  nootkatone Valencene sesquiterpene (hợp chất vòng thơm cam) rẻ Được tổng hợp từ FPP (farnesyl pyrophosphate) enzyme terpene cyclase FPP Terpene cyclase Valencene Nootkatone hợp chất hữu tự nhiên có phạm vi ứng dụng lớn Giá thành cao Đó dạng sesquiterpene ketone Ví dụ: Ứng dụng nootkatone • Nootkatone sử dụng dạng phun xịt để xua đuổi, diệt muỗi, gián, trùng • Thân thiện với mơi trường, khơng độc cho người • Sử dụng phổ biến làm chất bổ sung thức ăn, mỹ phẩm, thuốc, dược phẩm Deer tick Cytochrome P450 Valencene Nootkatone 13 09/02/2015 Chuyển hóa valencene thành nootkatone Sử dụng vi tảo làm Bioreactor Mục đích • Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa hợp chất giá trị thành hợp chất có giá trị cao nhiều • Ứng dụng để tạo hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn, giá thành rẻ • Phát triển sản phẩm ứng dụng nông nghiệp, bảo vệ thực vật, thuốc, mỹ phẩm… Hướng tiếp cận • Khai thác sở liệu hợp chất gene chuyển hóa đường chuyển hóa chất • Sàng lọc tiền chất phù hợp • Sử dụng tế bào chủ – Vi sinh vật (E.coli, Bacillus sp., S pombe and yeasts…) – Vi tảo (nước nước mặn) – Tế bào thực vật • Sử dụng tế bào chuyển gene – Tách dòng gene cụm gene mong muốn từ nguồn tự nhiên tổng hợp gene – Chuyển gene vào vector đưa vào tế bào chủ nhiều phương pháp khác • Các tế bào chủ: E.coli, S pombe, cerevisiae, D salina, C vulgaris Materials Mevalonate vector Cmr pAC-Mev Ptac P15A ori 10.6 kbp MVA kinase TrrnB IPP PMVA HMG CoA HMG CoA kinase isomerase reductase synthase DPMVA decarboxylase Removal of the HMG-CoA reductase and HMG-CoA synthase genes Gene mong muốn: Tách dòng từ nguồn tự nhiên Đặt tổng hợp từ công ty (synthesized genes) Cmr pAC-Mv Sử dụng hệ thống vector biểu tương ứng tế bào chủ khác P15A ori 8.5 kbp TrrnB IPP DPMVA PMVA MVA Ptac kinase decarboxylase kinase isomerase MCS 14 09/02/2015 Ưu điểm sử dụng hệ thống chuyển hóa tế bào Chuyển gene vào vi sinh vật • Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng chuyển cụm gene điều khiển promoter (multicistronic) • Dễ dàng tiết ngồi mơi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, mơi trường ni cấy chi phí cao Các đường chuyển hóa hạn chế Cần phải cung cấp tiền chất • Ưu tiên dùng dạng đơn bào • Có chứa đường chuyển hóa tiền chất • Sinh trưởng nhanh, lẫn tạp • Mơi trường ni cấy rẻ • Dễ dàng mở rộng quy mơ lớn • Sử dụng photobioreactor Chuyển gene vào nấm men • Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Có thể chuyển nhiều gene xen nhập vào genome thông qua trao đổi chéo đoạn tương đồng • Tốc độ sinh trưởng nhanh • Dễ dàng tiết ngồi mơi trường • Khó khăn: Dễ lẫn tạp, mơi trường ni cấy chi phí cao Các đường chuyển hóa hạn chế, cần phải cung cấp tiền chất Chuyển gene vào thực vật • • • • Sự phức tạp hệ thống biểu gene thực vật Mỗi gene chịu kiểm soát promoter Kết hợp sử dụng hệ thống tái tổ hợp nấm men để chuyển nhiều gene vào vector Ưu điểm: Con đường trao đổi chất phong phú CaMV 35S promoter HindIII (11702) PstI (11694) BamHI (11672) SmaI (11669) AvaI (11667) XmaI (11667) MCS ClaI (11456) NcoI (1) P-INO (Promoter) GUS His tagged EcoRI (10821) ApaLI (1150) ApaLI (1475) LacZ Promoter CaMV 35S promoter 3'UTR (polyA signal) AvaI (9791) RB (right border) NcoI (9763) AvaI (2485) pCAMBIA-INO NptII (Neomycin resistance) AvaI (3115) 12463 bp ClaI (8945) AvaI (8913) Left border AvaI (4246) Kanamycin resistance AvaI (4726) ApaLI (6995) ClaI (5550) ApaLI (6497) Chuyển gene vào vi tảo • Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản • Tốc độ sinh trưởng nhanh, lẫn tạp, mơi trường ni rẻ Dễ dàng nâng quy mơ lớn • Dễ dàng tiết ngồi mơi trường • Khó khăn: Chưa có nghiên cứu nhiều Bài tập Viết tiểu luận sở báo cung cấp 15 ... Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa hợp chất giá trị thành hợp chất có giá trị cao nhiều • Ứng dụng để tạo hợp chất có hoạt tính sinh học cao hơn, giá thành rẻ • Phát triển sản phẩm ứng dụng. .. tinh 09/02/2015 Khai thác hợp chất tự nhiên Lên men vi sinh vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi vi tảo Khó khăn: hoạt tính thấp khơng có hoạt tính Xu hướng khai thác hợp chất tự nhiên • Tách chiết... Cảm ứng ức chế phiên mã 09/02/2015 Hợp chất tự nhiên Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng Định nghĩa • Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo đường • Là hợp chất hóa học tạo cách tự nhiên sinh