ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI : CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU cry1Ab VÀ cry1B-1Ab VÀO GIỐNG MÍA VN84 4137 (Saccharum officinarum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefacien MỤC LỤC o…………………………………………………………………… 46 I Mở đầu - Ở Việt Nam, mía loại trồng mang lại giá tr ị kinh t ế, n ước ta có đ ặc ểm khí hậu, với khả thích ứng nhiều loại đất khác nh đ ất than bùn, đ ất hoàn toàn cát, đất chua mặn, đất đồi, khơ hạn màu m ỡ… nên mía đ ược tr ồng khắp vùng miền nước Do phát tri ển ngành mía đ ường đ ược xem chương trình khởi đầu để tiến hành cơng nghiệp hóa, hi ện đại hóa nơng thơn, xóa đói giảm nghèo Mặc dù ngành mía đường trọng phát tri ển, hi ện người nông dân phải đối mặt với nhiều khó khăn như: thiên tai lũ l ụt, h ạn hán sâu b ệnh…d ẫn đến suất mía thấp, năm 2011 bình qn suất đạt khoảng 62 t ấn/ha giới 70,5 tấn/ha Những nguyên nhân v ới giá thu mua mía thấp, khơng ổn định làm cho diện tích trồng mía nh ững năm g ần s ụt gi ảm, năm 2002 diện tích trồng mía đạt 320.000 đến năm 2010 kho ảng 269.100 Những khó khăn làm sản lượng mía bị thi ếu hụt không đáp ứng đ ủ nguyên li ệu cho ngành sản xuất đường, nhu cầu tiêu thụ đường n ước ta ngày gia tăng, dự kiến năm 2020 triệu đường/ năm Một nguyên nhân quan trọng dẫn đến gi ảm su ất, s ản l ượng mía nước ta phá hoại sâu bệnh, phổ biến lồi sâu đục thân thu ộc cánh phấn Lepidoptera, hàng năm nhiều nơi gây thiệt hại đến 30% s ản lượng Mặc dù nhiều biện pháp khác áp dụng để phòng tr lo ại sâu dùng lưới bắt sâu, bướm, dùng thuốc trừ sâu, thiên địch…nh ưng nh ững lo ại côn trùng thường khó kiểm sốt chúng di chuy ển l th ức ăn bên thân mía Do việc tạo giống mía có khả kháng loại sâu b ệnh m ột nhu cầu cấp thiết Tuy nhiên việc áp dụng phương pháp lai tạo gi ống truy ền th ống mía g ặp nhiều khó khăn mía có gen phức tạp, gen quy đ ịnh tính ch ống ch ịu v ới sâu bệnh ít, khả sinh sản hữu tính thấp làm cho chu kì chọn l ọc, t ạo gi ống di ễn thời gian dài, đến 10 năm Áp dụng cơng nghệ sinh học khắc phục khó khăn b ằng cách đưa gen kháng sâu Bt vào gen mía, tạo giống mía kháng sâu th ời gian ngắn Mục đích nghiên cứu Lý luận: khảo sát quy trình chuyển gen cry1Ab cry1B-1Ab vào mơ s ẹo mía thơng qua vi khuẩn A tumefaciens, làm sở cho việc ứng dụng chuyển gen nói chung vào mía (Saccharum officinarum L.) thơng qua vi khuẩn A tumefaciens Thực tiễn: Tạo dòng mía mang gen kháng sâu cry1Ab cry1B-cry1Ab b ằng phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens II Tổng quan tài liệu Danh pháp Giới: Plantae Giới phụ: Tracheobionta Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Lớp phụ: Commelinidae Bộ: Cyperales Họ: Poaceae (Gramineae) Chi: Saccharum Nguồn gốc, lịch sử phát triển phân bố mía 2.1 Nguồn gốc lịch sử phát triển Cây mía (saccharum spp) hóa hóa 8000 năm TCN đảo Tân Gi Nê người làm vườn từ thời kì đồ đá mới, sau dần lan truy ền đến Trung Quốc, Ấn Độ đảo Thái Bình Dương Từ Trung Quốc mía trồng nước phía Đơng Nam nh ư: Philippin, Nhật Bản, Indonesia; từ Ấn Độ mía phát triển n ước phía Tây nh ư: Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý Cây mía trồng nước Địa Trung Hải từ kỉ thứ XIII, Châu Mỹ tr ồng mía muộn vào kỉ XV Trong lần thứ hai vượt bi ển sang Tân Th ế gi ới, Christophe Colombus đưa giống mía đến trồng Châu Mỹ vào năm 1490 Santo Domingo, sau đến Mexico (1502), Brazin (1533), Cuba (1650) Đến kỉ thứ XVI đường mía mặt hàng trao đổi gi ữa n ước Nam Mỹ th ị trường Châu Âu 2.2 Phân bố Mía nhiệt đới, phát triển tốt phạm vi t 35 o vĩ tuyến Bắc đến 35 o vĩ tuyến Nam, loại đất từ cát đến sét nặng Việt Nam nước nằm từ 8o đến 23o vĩ tuyến Bắc có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, lượng mưa cao, thích hợp với mía Bảng 1: Phân bố vùng trồng mía Việt Nam TT Vùng sản xuất (tỉnh) Diện tích (ha) Miền núi phía Bắc (Cao Bằng, Tuyên Quang, Sơn La, Hòa 13.876 Bình, Phú Thọ) Bắc Trung (Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Quảng Bình) Trung Trung Bộ (Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên) Tây Nguyên (Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lăk, Đắc Nông) Đông Nam Bộ (Đồng nai, Bình Dương, Bình Phước, Long An, 59.168 47.995 34.747 29.092 Tây Ninh) Đồng sông Cửu Long (Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, 56.838 Tiền Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, Kiên Giang, Cà Mau) Tổng cộng 242.413 Đặc tính thực vật học a) Thân mía - Thân mía cao trung bình 2-3 m, số gi ống cao 4-5m Thân mía hình thành nhiều đốt hợp lại Chiều dài đốt từ 15-20 cm, m ỗi đốt gồm có mắt mía (mắt mầm), đai sinh trưởng, đai rễ, sẹo lá… o Thân mía có màu vàng, đỏ hồng đỏ tím o Tuỳ theo giống mà lóng mía có nhiều hình dạng khác như: Hình trụ, hình trống, hình ống chỉ… Thân đơn độc, khơng có cành nhánh, trừ số trường hợp bị sâu bệnh Hình 1: dạng lóng mía b) Rễ - Rễ mía: Cây mía có loại rễ rễ sơ sinh rễ thứ sinh + Rễ sơ sinh (rễ hom): Mía trồng thân (sinh sản vơ tính) Khi trồng, thân mía chặt thành đoạn, đoạn có từ đến mắt mầm gọi hom giống) Đai rễ hom mía đâm rễ nhỏ, mảnh, có màu trắng màu trắng ẩn vàng nhạt, rễ sơ (thường sinh Đồng thời với rễ này, mầm mía cương lên, bắt đầu mọc đâm lên kh ỏi mặt đất Hình 2: loại rễ chồi Cây mía thời kỳ đầu sử dụng chất dinh d ưỡng ch ứa hom gi ống, nhiệm vụ lớp rễ bám đất hút n ước cung cấp cho hom mía + Rễ thứ sinh (rễ vĩnh cửu): Tiếp sau rễ sơ sinh, lúc mầm mía đâm lên kh ỏi m ặt đất, gốc mầm mía (cây mía non) bắt đầu xuất hi ện chi ếc r ễ vĩnh cửu Loại rễ to trắng Chức chủ yêu hút n ước, dinh d ưỡng, cung c ấp cho Cây mía thoát ly khỏi phụ thuộc vào chất dinh d ưỡng dự trữ hom mía Hom mía khơ quắt lại, rễ sơ sinh đồng thời h ết vai trò nó, teo dần chết Các rễ thứ sinh dính trực tiếp với trục cây, phát tri ển v ới s ự phát tri ển c để hoàn thành chức sinh lý Những rễ cấu tạo ch ủ yêu chất xơ chia thành lớp theo chức riêng lớp Lớp bề mặt từ - 30 cm tầng đất canh tác, phân bố ch ủ y ếu nh ững r ễ nhỏ, có nhiều nhánh đầu rễ mang lơng hút, làm nhiệm vụ hấp th ụ ch ất dinh dưỡng (lớp gọi rễ hấp thụ) Kế đên lớp 30 - 60 cm chủ yếu r ễ xiên Loại r ễ to h ơn r ễ l ớp trên, làm nhiệm vụ chống đỡ, giữ cho không bị đổ ngã Lớp rễ thứ sinh sau rễ ăn sâu, chức hút n ước nên gọi lớp hút nước Tùy thuộc vào loại đất khác nhau, r ễ có ăn sâu tới 5-6 m - Rễ phụ sinh: Loại rễ thường đâm từ đai rễ lóng mía c thân mía Một số trường hợp khác đặc tính gi ống ều ki ện c môi trường (chủ yếu ẩm dộ) rễ phụ sinh phát tri ển nhi ều t đai r ễ thân mía làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng mía nguyên li ệu Do v ậy, giống mía hay rễ thân thường không sản xuất tiếp nhận c) Lá - Lá mía thuộc loại đơn gồm phiến bẹ Phi ến dài trung bình t 1,01,5m có gân tương đối lớn Phiến có màu xanh th ẩm, m ặt có nhiều lơng nhỏ cứng, hai bên mép có gai nhỏ Bẹ r ộng, ơm kín thân mía,có nhiều lơng Nối bẹ phiến đai dày c ổ Ngồi có thìa , tai lá… Các đặc điểm khác tuỳ vào giống mía d) Hoa hạt mía - Hoa mía (còn gọi bơng cờ): + Hoa mía có hình quạt mở Khi mía kết thúc thời kỳ sinh tr ưởng mầm hoa hình thành điểm thân (đi ểm sinh trưởng) phát triển thành hoa (cây mía chuy ển sang giai đoạn sinh thực) Hoa mía bao bọc cuối c (lá c ụt), ngồi, hoa xòe m ột c (nên g ọi c ờ) Cấu tạo hoa mía gồm trục nhánh cấp 1, c ấp 2, (còn g ọi gié gié con) gié hoa mía nh ỏ M ỗi hoa mía bao mảnh vỏ, tạo thành hai l ớp màng màng ngoài.  + Tổ chức sinh sản hoa: Hoa mía loại hoa có tổ ch ức sinh s ản ngầm (Hipogina) cấu trúc đơn giản Mỗi hoa bao gồm tính đực tính cái, với ba nhị đực, tử cung hai nhị Khi hoa mía n ở, bao ph ấn nhị đực tung phấn, nhờ gió mà nhị dễ dàng ti ếp nhận nh ững h ạt phấn đặc tính chung hòa thảo khác - Hạt mía: Hạt mía trơng vảy khơ, nhẵn, hình thoi, chứa albumin, tinh bột mầm nhỏ Khi chín, hạt có màu biến đổi từ vàng sang màu hạt dẻ khơng bị nứt Kích thước hạt khoảng 0,5 mm x 1,5 nặng từ 0,15 đến 0,25 mg Trong công tác lai mm tạo giống mới, lai hữu tính phương pháp ứng dụng r ộng rãi thu nhiều kết quả, đó, hoa kết hạt mía có ý cực mục đích nghĩa r ất tích Hình 3: hoa mía Hình 4: Hạt mía Phân loại giống mía VN84 4137 4.1 Phân loại a) Các lồi mía Trong Saccharum có lồi mía gồm: loài tr ồng trọt loài hoang d ại Các lồi mía phân biệt chúng với đặc điểm thực vật Theo Jeswiet, lồi mía trồng : - Lồi Saccharum officinarum L, gọi mía q (noble cane): Lồi mía trồng thích hợp vùng khí hậu nhiệt đới Ở nước ta hi ện gặp r ất nhiều dạng lồi mía q mía voi, mía đỏ, mía tím (còn g ọi mía tiên, mía thuốc), Thanh Diệu, mía mưng, mà bà nông dân th ường tr ồng đ ể ăn tươi, giải khát Những đặc điểm là: to thịt mềm, x ơ, nhi ều n ước, t ỉ l ệ đường cao Cây có màu xanh, vàng, đỏ xẫm tím, khơng ho ặc r ất hoa Ở nơi đất tốt, điều kiện khí hậu thuận lợi suất mía có th ể đ ạt r ất cao mà có lồi mía khác đạt tới Khả để gốc Lồi mía khơng mẫn cảm với bệnh than số bệnh khác Tuy nhiên, nhìn chung kh ả kháng sâu bệnh kém, bệnh rễ Chính vậy, người ta áp dụng phương pháp lai với giống mía có sức chống chịu cao đối v ới sâu b ệnh đ ể tìm giống mía vừa có suất mía cao, giàu đường lại kháng sâu bệnh Hình 5: Lồi Saccharum officinarum L - Saccharum barberi Jeswiet: Là lồi mía có nguồn gốc từ vùng Bắc Ấn Đ ộ, thích hợp với điều kiện nhiệt đới Lồi mía nghèo đường h ơn lồi Saccharum officinarum, mía nhỏ, dóng hình tr ụ có màu xanh ho ặc tr ắng, x bã nhiều, hẹp, sức sống cao, kháng nhiều loại sâu bệnh - Saccharum sinense Roxb.: Lồi mía gọi mía Trung Qu ốc Ở tỉnh phía Bắc nước ta có nhiều dạng lồi mía Saccharum sinense, dạng mía Gie, Gie Tuyên Quang, Gie Lạng Sơn,… Lồi mía thích hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới nhiệt đới Sức sống mạnh, chín sớm, tỷ lệ đường trung bình Thân mía nhỏ lóng hình ống chỉ, vỏ có màu xanh ánh đồng, sáp phủ dày Lá mía hẹp, mềm, hoa trung bình Có khả chống bệnh gồm: bệnh mosaic, mẫn cảm với bệnh than, bệnh rượu Hình 6: Lồi Saccharum sinense Roxb Các lồi mía hoang dại thuộc loại Saccharum khác là: - Saccharum spontaneum L.: Lồi gọi mía d ại c vùng Tây Nam châu Á Đó lồi lau, sậy thường gặp nhi ều vùng kh ắp đ ất n ước ta Đặc điểm loài S spontaneum thân nhỏ, vỏ c ứng, sức s ống kh ỏe, hàm lượng đường ít, tỉ lệ xơ cao, hoa mạnh, thời gian hoa s ớm, khả thích ứng rộng, bị sâu phá hại có khả kháng nhi ều lo ại b ệnh nh mosaic, gôm, bệnh thối rễ số bệnh khác lại mẫn cảm với bệnh than Hình 7: Loài Saccharum spontaneum L 10 tối 28 0C môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamicin 100 mg/ l rifampicin 50 mg/l Sau dịch vi khu ẩn li tâm 4000 vòng/5 phút chuyển sang nuôi môi trường AB điều ki ện có bổ sung thêm acetocyringone 200 µM gi - Xử lý mơ sẹo với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Mô sẹo tách rời thành cụm nhỏ đường kính 0,5-1 cm đ ược để khô bớt độ ẩm 30 phút tủ cấy vơ trùng Sau đó, ngâm mơ s ẹo 10 phút dịch vi khuẩn điều kiện áp suất thường đưa vào ều kiện chân không -50 kPa phút đưa trở lại môi tr ường áp su ất thường phút Mô sẹo thấm khô đồng nuôi cấy với vi khuẩn môi trường tạo mô sẹo bổ sung 200 µM acerosyringone ều ki ện t ối 2-3 ngày - Chọn lọc tái sinh chuyển gen: Sau giai đoạn đồng nuôi cấy, mô sẹo rửa dung d ịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, r ồi chuyển sang chọn lọc mô chuyển gen môi tr ường tạo mơ s ẹo, có b ổ sung cefotaxime nồng độ 500 mg/l PPT nồng độ ngưỡng gây chết Mơ sẹo hình thành phải kháng PPT chuy ển sang nuôi c môi trường tái sinh bổ sung PPT ngưỡng gây chết 500 mg cefotaxime 2527 C điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày Chồi đạt chi ều cao khoảng 2-3 cm chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung PPT cefotaxime Các có hệ rễ phát triển bình thường đạt chi ều dài khoảng cm chuyển trồng vườn ươm Nội dung 3: Kiểm tra, đánh giá dòng mía chuyển gen giả định 1.13 Khảo sát ảnh hưởng chất chọn lọc PPT lên phát triển c ex vitro - Mục tiêu: Xác định ảnh hưởng thuốc diệt cỏ Basta nồng độ khác đến ex vitro, từ xác định nồng độ thích hợp để ki ểm tra kh ả kháng thuốc diệt cỏ chuyển gen( nhờ biểu gen bar) - Phương pháp thực hiện: Các sau trồng vườn ươm khoảng 1,5 tháng phn thuốc diệt cỏ Basta tính theo thành phần PPT nồng độ sau: 0;50;100;150;200 mg/l - Mỗi nghiệm thức gồ cây, lặp lại lần - Chỉ tiêu theo dõi: biểu thân, tỉ lệ sống sót 1.14 Tách chiết DNA thực vật Tạo nguyên liệu cho nghiệm PCR - Làm đơng 200 mg mẫu nito lỏng Dùng chày nghi ền nát m ẫu thành bột mịn cối 29 - Chuyển bột sang eppendorf 1,5 ml, cho thêm vào 500 µl dịch ly trích Thêm vào 80 µl SDS 10 % trộn hỗn hợp Ủ eppendorf 65 C 10 - phút Thêm 600 µl potassium acetate 5M trộn hỗn hợp , ủ 0C - 20 phút Ly tâm 14000 vòng/ phút 20 phút Hút d ịch n ổi vào eppendorf m ới, thêm vào ml isopropanol lạnh Trộn hỗn hợp va ủ -20 - C 30 phút Ly tâm 13000 vòng/ phút 10 phút Loại bỏ dịch n ổi, làm khô ph ần lắng Hòa tan mẫu 0,7 ml Tris 50 mM, EDTA 10 mM, pH r ồi ly tâm - hỗn hợp 13000 vòng/phút 10 phút Chuyển phần dịch sang eppendorf , thêm sodium acetat 3M b ằng - 1/10 thể tích dịch thu 500 µl isopropanol Trộn đều, ly tâm hỗn hợp 13000 vòng/ phút 10 phút Rửa mẫu với 1ml etanol 80 % lạnh Làm khơ mẫu hòa tan l ại 100 µl Tris 10 mM, EDTA - 1mM pH8 Thêm µl RNAse ủ 37 0C 30 phút để loại bỏ RNA mẫu DNA thu sủ dụng bảo quản -20 0C 1.15: Phân tích PCR -Tương tự mục 2.2.10 thay µl DNA plasmid µl DNA mâu th ực vật 2.15 Đánh giá protein tổng tan kiểm tra bi ểu hi ện gen cry 1Ab, cry 1B-1Ab dòng chuyển gen que thử nhanh - Để ly trích protein tổng số 0,3 g nghiền nitrogen lỏng đến mịn bột, sau thêm vào ml dung dịch protein gi ữ đ ược C Trộn hồn hợp khoảng 10 phút đá Sau đó, mang h ỗn h ợp dung d ịch ly tâm 13000 vòng/ 15 phút, C Thu lấy dịch -Dịch ly trích protein chuẩn độ phương pháp Bradford theo Kit Quick Start TM Bradford Protein Assay Thang nồng độ chuẩn dựng bovine serum albumin (BSA) nồng độ 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625 theo đơn vị mg/ ml Xác lập đồ thị phương trình đường chu ẩn t ương quan nồng độ giá trị OD đo bước sóng 595 nm D ựa vào đ th ị phương trình để tính nồng độ protein mẫu thí nghi ệm theo giá trị OD - Protein Cry1Ab CryB-1Ab biểu dòng mía chuy ển gen đ ược xác định que thử nhanh Phản ứng dương tính cho vạch màu phản ứng âm tính cho vạch màu que 30 Mô chuyển gen nghiền dịch ly trích cho thấm vào đ ầu nạp mẫu que thử Để nhiệt độ phòng xem kết 1.16 Đánh giá kiểu hình dòng mía chuyển gen ngồi vườn ươm Các dòng mía chuyển gen đối chứng sau chuy ển v ườn ươm đ ược ghi nhận thơng số kiểu hình: chiều dài thân( từ gốc t ới đ ỉnh sinh trưởng), đường kính thân, số , kích thước lá( chi ều dài t cu ống t ới lá, bề ngang lớn lá) thời ểm ngày, 30 ngày 60 ngày.tư so sánh với dòng chuyển gen đối chứn để b ước đ ầu đánh giá khả sinh trưởng dòng mía chuyển gen V Kết thảo luận Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tái sinh hồn chỉnh invitro từ mơ sẹo giống mía VN 3.1 ni cấy invito tạo mơ sẹo từ non tái sinh 3.1.1 khử trùng mẫu ni cấy invitro Ngọn mía khoảng 3-4 tháng tuổi tách bỏ lớp xanh bên cắt ngắn thành đoạn 10cm, bỏ phần già, giữ lại phần non Những đoạn khử trùng tủ cấy vơ trùng cồn 70, sau cẩn thận tách bỏ lớp bên tiếp xúc cồn, phần lõi non vô trùng bên cắt thành mảnh 1-0,5 cm nuôi cấy môi trường tạo mô sẹo hầu hết mẫu khơng có nhiễm tạp, phát triển trạng thái vô trùng 3.1.2 khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên q trình tạo mơ sẹo Các mảnh non nuôi cấy môi trường bổ sung 2,4-D n ồng đ ộ khác Sau khoảng thời gian ngày có s ự kéo dài, tăng kích th ước mơ s ẹo b đầu hình thành ngày thứ 10 đến 12, chủ yếu mép số m ạch dẫn bên mảnh ngày thứ 28 nhiều mảnh có hình thành mô s ẹo h ầu hết bề mặt gồm lạo chủ yếu: mô sẹo khô, ; mô sẹo nh ầy, nh ớt; mô s ẹo xốp, mềm (hình 3.2) Sau 28 ngày kết ghi nhận đc nghiệm thức sau: nghiệm thức đối chứng hồn tồn khơng có hình thành mơ sẹo, mảnh bị chết dần, chuyển thành màu nâu đen nghiệm thức bổ sung 2,4-D đ ều ghi nhận hình thành mơ sẹo, nồng độ 2,4-D tăng t đên 2.3 mg/l kh ả hình thành mơ sẹo mẫu tăng tương ứng tỉ lệ mẫu tạo mơ sẹo lượng mơ sẹo hình thành Đặc biệt với nồng độ 2,4-D 3mg/l ghi nh ận tỉ lệ mẫu, lượng mơ sẹo hình thành cao (93,33%) khác bi ệt có ý 31 nghĩa thống kê so với nghiệm thức khác, mơ sẹo hình thành ch ủ y ếu d ạng mô khô, chắc, vàng sẫm tăng nồng độ lên 4mg/l, ngược l ại t ỉ l ệ m ẫu hình thành mơ sẹo lượng mô sẹo gi ảm so với sử d ụng n ồng đ ộ 3mg/l, đồng thời nhận thấy mô sẹo trở nên bở mềm h ơn Như đối v ới gi ống mía VN, 2,4-D 3mg/l có khả kích thích t ạo mô sẹo t ốt m ảnh non( hình 3.3 bảng 3.1) Nghiệm thức 2,4 D TỈ LỆ MẪU HÌNH THÀNH mơ sẹo cho giống VN 0.00a 40.00b 76.67c 93.33d 63.33e Các giá trị trung bình khơng theo nhóm có mẫu chữ giống có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p