NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG TT

28 228 0
NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG TT

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - T NĐ Ở N NG N ỨU Ủ TS G NT T UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Chuyên ngành: S v vật Mã số: 62420104 ỰT T TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC Hà N i – 2017 ô trì N ợc hoàn thành t i: Tr n Đ ớng dẫn khoa h c: K o T n n ĐHQGHN PGS TS Tr n H n T TS Tô T n T Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án đ ợc bảo vệ tr ớc Hộ đ ng cấp sở chấm luận án tiến sĩ vào h i gi p t n t n năm 201 Có thể tìm hiểu luận án t i: -T v ện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - T v ện Đ i h c Quốc gia Hà Nội pt i MỞ ĐẦU Un t đ i tr thứ t un t tràn (UTĐTT) đứng thứ ba mứ độ phổ biến nguyên nhân gây tử vong cao toàn cầu (Arnold cs, 2016) Nhiều yếu tố n u â bện n ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống vận động, l m dụng thuốc chất kí nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo UTĐTT đứng thứ năm s u un t bện n ân t n đìn (Amer n C n er So et n p ổi, d dà un t đ ều cho thấy khả năn o đặc biệt ẩn đo n bệnh đặc thù 2014-2016) Ở Việt Nam, v độ phổ biến (Globocan, 2012) Tuy ó t n l ợng tốt đ ợc chẩn đo n đ ều tr bệnh nhân tử von UTĐTT mứ t í ế độ đo n sớm song tỷ lệ n ớc chậm phát triển (globocan, 2012), đo n sớm h n chế Do vậy, việc tìm dấu hiệu chẩn đo n bệnh sớm đ ợc quan tâm nhiều tron ó ớng nghiên cứu mối liên quan s biến đổi ADN ty thể với bệnh Dữ liệu ôn bố cho thấy, biến đổi ADN ty thể tế bào ung t un ấp hiểu biết bệnh sinh khối u hứa hẹn sở tiềm năn l ợn đ ều tr un t Đ ợ ot n (Br ndon s 2006; Carew cs, 2002) o “n m ” sản xuất năn l ợng, ty thể có vai trò quan tr ng cho m i ho t động sống tế bào t ể Đặc biệt, ty thể có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân Ở n ty thể ó kí t i, ADN ớc 16.569 bp, sợ đô d ng m ch vòng chứa 37 gen đ ợ đ ều khiển chung vùng đ ều khiển D-loop ADN ty thể trình t intron, protein bảo vệ Histone Hơn nữ chế sửa chữa sai hỏng ty thể òn đơn ản nên dễ b t động biến đổi (Aral cs, 2007) S biến đổi gây thiếu hụt hay rối lo n ho t động năn lo n bệnh tật Những nghiên cứu gần đâ ty thể qu â r n ững rối o t ấy, biến đổi ADN ty thể gây khiếm khuyết phức hệ hô hấp l n qu n đến nhiều lo un t Brandon cs, 2006) Cụ thể ơn số đột biến đ ìn (S n s 2009; Czarnecka s, 2007, gen ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV, đo n lớn s t đ ợ x đ nh nhiều lo un t đổi số ADN ty thể tron ó UTĐTT (Br ndon s 2006 Czarnecka s, 2007; Lee cs, 2009) Hơn nữa, số công bố cho thấy s biến đổi ADN ty thể mối liên quan với bện ó tín đặ tr n t eo vùn đ a lý chủng tộc (Dimberg cs, 2014; Canter cs, 2005) Tr n đối t ợn n V ệt N m n n ứu t eo ớn nà n đ ợ qu n tâm tron n ữn năm ần đâ tu nhiên, chủ yếu tập trung vào bện t ần kinh (Huệ cs, 2012), Huệ cs, 2012[Error! Reference source not found.]), bện un t v (An s 2015 L n s 2014 Tr n s 2015) Đối vớ bện UTĐTT có công bố Dimberg cs (2014) với số liệu b n đầu đột biến đo n 4977 bp nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc khảo sát nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg cs, 2014 Do vậy, nghiên cứu với ph m vi rộng mứ độ sâu ơn tr n đối t ợng bệnh nhân Việt Nam mối liên quan s biến đổi ADN ty thể với bện UTĐTT đặc biệt với đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT ó ý n ĩ giúp hiểu thêm ế bệnh h c tiến triển UTĐTT ó t ể sở cho việc tìm th ADN ty thể để nhận biết bệnh sớm Từ th c tế nà n tô t c đề tài luận án: “ ” với hai mục tiêu: Khảo sát số d ng biến đổ (đột biến đ ìn ) gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, đo n 4977 bp mứ độ đo n lớn số s o ADN t t ể mẫu mô mẫu m u ủ n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m Tìm hiểu mối liên quan d ng biến đổi gen, tỷ lệ đo n 4977 bp, mứ độ đo n lớn s t đổi số l ợng ADN ty thể với số đặ đ ểm bệnh h c bệnh UTĐTT Việt N m qu tìm r n ữn b ến đổ t ềm năn ó t ể phát triển thành th trợ ẩn đo n t n l ợn bện Đ ợng nghiên c ị m th c hi n ề tài luận án Nghiên cứu đ ợc th c mẫu mô u mô lân ận u (LCU) số mẫu m u đ ợ un k m t eo mẫu mô nhóm bện n ân UTĐTT Mẫu mô mẫu máu bện n ân un t cung cấp từ K o ả p ẫu bện đ ợc Bệnh viện K Hà Nội Bệnh viện Quân y 103 từ năm 2012 - 2016 Mẫu máu củ n i khỏe m n bìn t truyền m u Trun ơn un ấp n (m u đối chứn ) K o Sàn l m u V ện huyết h c ấp Các nghiên cứu luận n đ ợc th c t i Phòng Proteomics Sinh h c cấu trúc thuộc Phòng Thí nghiệm tr n đ ểm Công nghệ Enzyme Protein, Bộ môn Sinh lý h c Sinh h Sinh h Tr Đ o n i, Khoa n ĐHKH T nhiên – ĐHQG Hà Nội c nghiên c u Đố t ợng tham gia nghiên cứu hoàn toàn t nguyện Quy trình lấy mẫu t eo đ n qu đ nh Bệnh viện Các thông tin cá nhân bệnh nhân tham gia nghiên cứu đ ợc mã hóa bảo mật Ý - ĩ k o ọc th c tiễn c Kết ủ luận n un đo n lớn, s t ề ậ ấp liệu biến đổi số gen ty thể, tỷ lệ mứ độ đổ số l ợng ADN ty thể n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m Đâ ngu n liệu tham khảo quan tr ng cho nghiên cứu bệnh h c phân tử củ UTĐTT - Luận n xâ d n đ ợ p ơn p p x đn đột b ến đ ểm đột b ến đo n đ n l ợn mứ độ đo n số s o ADN t t ể t ơn đố sở n - C n ứu x t n kết ủ n n ứu nà ó t ể đ ợc sử dụn làm sở k o ởn đo n 4977 bp mứ độ đo n lớn s t Đó - en ND1, ND3, COX-1, COX-2 đến n u óp ới c ề t ợn bện UTĐTT b n - ơn p p Đề tà luận n n o ủ số b ến đổi ADN ty thể n p n ứu t ếp tỷ lệ đột b ến mắ t ến tr ển ủ UTĐTT n ứu đầu t n x ơn p p PCR p ả trìn t en p đ n tỷ lệ mứ độ đo n lớn s en ND1, ND3, COX-1 COX-2 tr n đố ơn p p đ ìn ều dà đo n cắt giới h n ơn p p re l-t me PCR V ệt N m n ứu cung cấp liệu mố l n qu n 4977 bp mứ độ đo n lớn s t ữ tỷ lệ đột b ến đo n đổ số s o ADN t t ể số v trí biến đổi ủ gen ND1 (A4164G), ND3 (A1398G), COX-1 (C6340T) COX-2 (G7853A) vớ ủ bện UTĐTT n liên quan vớ n đổ số s o ADN t t ể số đột b ến đ ểm đổ số s o ADN t t ể số biến đổi ủ (PCR-RFLP) p ó t ể đ ợ áp dụn ậ Đề tà luận n tron n ữn n t ơn p p nà ệm có liên quan Việt Nam t eo: xâ d n mô ìn d đo n ản tr n p đặ đ ểm bện V ệt N m Tron đó, biến đổ A4164G A10398G G7853A đo n T bệnh, biến đổi A4164G, G7853A liên quan với giớ tín biến đổ A4164G A10398G ó xu Đặc biệt, ớn đ k m n u xảy với tần suất cao giai đo n T1, giảm dần đo n T 2, T3 T4 Mứ độ đo n lớn liên quan với v trí un t độ biệt hóa, số ADN ty thể l n qu n đến v trí un t - Đề tà luận n n mứ độ xâm lấn khối u n ứu phát đo n mớ 5094 bp 5169 bp 5104 bp ADN ty thể Đặc biệt, việ tăn mứ độ đo n yếu tố làm tăn n u t ơn qu n n mắ UTĐTT ó mối ch mứ độ đo n số ADN ty thể mô LCU bện UTĐTT ƯƠNG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Thực tr ng mắ u t i trực tràng Un t đ i tr tràn (UTĐTT) đứng thứ ba mứ độ phổ biến nguyên nhân gây tử vong cao thứ t un t tr n toàn ầu (Arnold cs, 2016) T i Việt Nam, số ca bện UTĐTT đ ợc chẩn đo n chiếm tỷ lệ khoảng 7% tổng số un t đ ợc xếp vào v trí thứ năm s u un t n un t p ổ un t d dà un t v Tỷ lệ tử von UTĐTT ếm khoảng 6,3%, cao thứ t s u t gan, un t p ổ un t d dày (Globocan, 2012) Nhìn chung, tỷ lệ mắc tử vong bện UTĐTT đ n nhập thấp trung bình, ổn đ n ó xu ớng giảm ó xu ớn tăn quốc gia có thu n ớc có thu nhập cao (Arnold cs, 2016) Tuy nhiên, tỷ lệ mắc tử vong cao cho thấ đâ ăn bệnh nguy hiểm đ n n nặng toàn cầu 1.1.2 Các hệ thố p â a o n bệ Có nhiều hệ thốn p ân vào kí t ou t đo n cho ung t i trực tràng Đối vớ UTĐTT t ng p ân đo n un t d a ớc khối u (T), mứ độ lâ l n đến h ch b ch huyết (N) s diện củ d ăn (M) (Tumor- lymph Node – Metastases, TNM) (American Cancer Society, 2016), (Compto cs, 2004) 1.1.3 Các yếu tố u â u Nhiều yếu tố n u t trự tr â bện n vận động, l m dụng thuốc chất kí t í ế độ ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống đặc thù nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo (American Cancer Society, 2014-2016) Đặ b ệt số biến đổi tr n ADN t t ể n đ ìn đo n, s t đổi số ADN t (Br ndon s 2006 Czarnecka s 2007; Lee cs, 2009) 1.2 TY TH NGƯỜI 1.2.1 ấu tr v ứ n đ ợ x đn đình đột biến đ ểm, ó l n qu n đến n u mắc ung t t ể Ty thể bào quan có mặt tế bào chất hầu hết tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác Ty thể g m hai lớp màng lipoprotein, hai lớp màng khoang gian màng, bên hai màng chất Ty thể “nhà máy” năn l ợng tế bào, tham gia vào trình apoptosis (quá trình tế bào chết t eo u trìn ) (Du s 2000; L u s 1996; W n s 2016 qu trìn lão ó ủ ơt ể (Bratic, 2013) đ ều chỉnh tín hiệu canxi (Rizzuto, 2012) số khác Nhiều nghiên cứu r ng, biến đổi hệ gen ty thể ó l n qu n đến việc phát sinh số bệnh ty thể bện un t (Dimauro, 2007; Bradon cs, 2006; Chatterjee cs, 2006) 1.2.2 Hệ gen ty thể Bào quan ty thể có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân ADN ty thể n d ng m ch vòng, sợ đô ó kí t it nt iở ớc 16.569 bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA 13 phân tử protein thuộc phức hợp chu i hô hấp (Anderson s 1981) 1.2.3 Hiệ t ợng d tế bào chất v ỡng biểu t biến ADN ty thể Do hệ gen ty thể có nhiều sao: vài ty thể, hàng nghìn tế bào Vì vậy, ADN ty thể có hai d ng t n t đ ng tế bào chất d tế bào chất Đ ng tế bào chất (homoplasmy) tr ng thái t n t i mà tế bào mô qu n tất ADN ty thể giống D tế bào chất (Heteroplasmy) t n t biến tế bào mô qu n 1.3 Đ T N NT T Một số nghiên cứu đ ng th i ADN d ng bìn t ng d n đột t ể (DiMauro cs, 2007) V N UNG T Ư ỉ r ng, gốc t ho t động chứa oxi (Reactive oxygen species, ROS) l n qu n đến s tăn tr ởng tế bào, s chết tế bào, s sinh sản, hình thành m ch, s p t s n t ến tr ển d ăn ủ un t (Desouki cs, 2005[Error! Reference source not found.], Ishikawa K, 2008) ROS sản phẩm phụ trình hô hấp ty thể (oxidative phosphorylation, OXPHOS), có từ - 4% oxi tiêu thụ hô hấp ty thể t ì đ ợc chuyển thành ROS (Desouki cs, 2005) Hơn nữa, đột biến ADN ty thể làm nhiên, s tăn tăn ROS nội sinh l t ốc ROS (Carew cs, 2012; Brandon cs, 2006), động trở l i gây tổn h i thêm cho ADN ty thể ADN nhân (Carew cs, 2012) Ngoài ra, s ho t động NADPH-ox d se (Nox1) đ n kể ROS tế bào Nox1 l đ ợc kiểm soát s ho t động gen ty thể, s kiểm soát gen ty thể góp phần t o khối u số lo un t trứng (Desouki s 2005) N n un t v un t vậy, ho t động số biến đổi ADN ty thể ản tr c tiếp đến việc t o ROS t phát sinh phát triển un t n t o l ợng động thông qua Nox1 từ ó t ể ản bu ng ởng ởn đến trình Mặt khác, khiếm khuyết ho t động chu i hô hấp đột biến ADN ty thể dẫn đến s biểu mức trình sản xuất Surperox de k n poptos s tăn i biểu ức ADN nhân Những biến đổi kiểu hình tế bào đ ợc biết đến góp phần vào s hình thành, phát triển củ un t (S n N ều d n b ến đổ tr n ADN t t ể đ ợ x UTĐTT Các biến đổi đ ìn n cs, 2009) đn ó t ể ó l n qu n đến bện un t đột b ến ó t ể dẫn đến t enzyme thuộc chu i hô hấp, dẫn đến việ k ôn đảm bảo năn dòng vận chuyển đ ện tử bìn t tron ó đổi cấu trúc ó t ể làm ản ởng tới ng phức hệ hô hấp ty thể Các biến đổi g m đo n lớn, s thay đổi số sao, biến đổi gen ND1, ND3, COX-1 COX-2 Tuy nhiên, vai trò biến đổi, đo n s t đổi số l ợng ADN ty thể un t òn nhiều đ ều rõ cần tiếp tụ đ ợc nghiên cứu un tron ó UTĐTT 1.3.1 Mất o n lớn ADN ty thể Các đo n lớn ADN ty thể, chủ yếu đo n xảy giữ (khoảng 68%), có tần suất thấp ơn so vớ bệnh ty thể, bện un t đo n trình t lặp t ơn đ ng đột biến đ ểm, nhiên chúng l i góp phần nhiều ơn vào lão ó (C en s 2011b P rk s 2015) T eo Kr s n n s (2008), đo n xảy trình sửa chữa ADN ty thể b sai hỏn (Kr s n n s 2008) Trong lo i đo n lớn t ì đo n 4977 bp đo n phổ biến xả r từ v trí 8470 đến 13447 làm đ en mã ó o pol pept de phức hệ I (ND3, ND4, ND4L ND5), polypeptide (COXIII) phức hệ IV polypeptide phức hệ V (ATP8, ATP6), tARN vận chuyển axitamin Mất đo n 4977 bp xảy giữ đo n trình t lặp dài 13 nu (ACCTCCCTCACCA) đầu v trí 8470–8482 (thuộc gen ATPase 8) 13447–13495 (thuộc gen ND5) (Chen cs, 2011; Dani cs, 2008) Mất đo n 4977 bp đ ợ x un t v đn ó l n qu n đến n ều lo un t p ổi, niêm m c tử cung, th c quản, d dày, gan, thận, tuyến k n un p UTĐTT (D n s 2004, Chen cs, 2011; Ye s 2008; D s 2006; D mber 2015 Ar l s 2007) 1.3.2 Sự t a ổi số ADN ty thể bệnh ung t Số l ợng ADN ty thể t s 2013; Yu s 2007; X UTĐTT (T t r đổ đ ợ đề cập đến lo v un t s 2009; M mbo s 2005) un t ty thể giảm mẫu un t t un t tu ến n ớc b t un t vùn đầu cổ un t tử un un t k ợng thận un t ởng khác lên lo un t n n (Y n s 2004) un (Lee s 2009) Tron số số ADN n un t tu ến d dà p un t un t k v n bu ng trứn t ền liệt tuyến đặc biệt UTĐTT (Lee s 2009) N ADN ty thể â r p ổ (Hos ood s 2010) n s 2012; Qu s 2011; Fen s 2011) un t t ận (Xing cs, 2008) số d n un t v (T n tăn tron un t vậy, s t nội m c đổi số n u s tăn số ADN ty thể để đ p ứng với stress oxi hóa (Lee cs, 2000) Tuy nhiên, thông tin mối liên quan s thay đổi số ADN ty thể vớ đặ đ ểm bệnh h c củ un t òn n ều đ ều rõ ần tiếp tục đ ợc nghiên cứu ổi m t số gen ty thể mã hóa cho protein tham gia chuỗi hô hấp tế bào 1.3.3 Biế Các biến đổi ADN ty thể vùn đ ều khiển vùn mã ó đ ợ x t t k đ nh nhiều lo i ung n u với vai trò gây ức chế phức hệ hô hấp tế bào (OXPHOS) tăn sản xuất ROS đẩy s phát triển tế bào un t mô tr mứ độ nhẹ ơn ó t ể cho phép khối u thích ứng với ng (Brandon cs, 2006) Nghiên cứu tr đâ ND3 làm tăn n u un t v bện n ân n đột biến gen COX-1 làm tăn n u p t tr ển un t ỉ r n đột biến G10398A thuộc gen i Mỹ gốc phi (Canter cs, 2005) hay số t ền liệt tuyến (Petros cs 2004) Đặc biệt, biến đổi gen mã hóa cho protein thuộc phức hệ hô hấp tế bào n hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV đ ợ x en ND1, ND3 thuộc phức đ nh nhiều lo UTĐTT (Yusn t s 2010; Akou ek n s 2011; Yuex o 2016; C un t tron r s 2011; Errichiello cs, 2015) 1.4 NG N ỨU NĐ Tr n đố t ợn n nhữn năm ần đâ Ủ NT T V ệt N m n tu n n n 2012), Huệ cs, 2012), bện un t ỞV TN n ứu biến đổi ADN ty thể đ ợ qu n tâm tron n ứu chủ yếu tập trung vào bện t ần kinh (Huệ cs, v (An s 2015 L n s 2014 Tr n s 2015) Đối vớ bện UTĐTT có công bố Dimberg cs (2014) với số liệu b n đầu đột biến đo n 4977 bp nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc nghiên cứu với nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg cs, 2014) 1.5 Á ƯƠNG Để x Á ÁT đ n đ n l ợn N Đ T BI N GEN TY TH b ến đổ tr n ADN t t ể t PCR-RFLP ả trìn t k ơn p p ó t ể dùn kết ợp vớ n u để tăn độ C p n p dụn số p ơn p p s u: en PCR đ n l ợng (real-time PCR), Southern blot số p ín x ủ kết p ân tí ơn p p ƯƠNG NGU N UV ƯƠNG Á NG N ỨU 2.1 NGUYÊN LI U 2.1.1 Mẫu nghiên cứu Bộ mẫu g m 86 cặp mẫu mô u mô LCU 86 bện n ân UTĐTT Bệnh viện K Hà Nội cung cấp Bệnh viện Quân đội 103 cung cấp mẫu g m 40 cặp mẫu mô u mô LCU kèm theo 40 cặp mẫu m u đ ợc lấy t i hai th 67 mẫu máu củ n m u Trun đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bệnh nhân UTĐTT i khỏe m nh đến hiến máu dùng làm đối chứng Viện huyết h c Truyền ơn cung cấp Các mẫu nghiên cứu đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2016 đ ợc bảo quản tủ -80 C với mẫu mô, -200C với mẫu máu 2.1.2 a Các cặp m ất ợ sử ụ dùn o p ân tí tro ứu PCR-RFLP x đ nh đo n, real-time PCR đ ợc thiết kế b ng phần mềm primer - BLAST NCBI đ ợ đặt tổng hợp từ hãng IDT Invitrogen (Mỹ) C đệm ch y PCR, real-t me PCR n Hot Start PCR Master Mix2x (Thermo Scientific, Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), enzyme cắt giới h n hãng Ferment s (Đứ ) số ó ất k đ t độ t n k ết o p ân tí sn p ân tử 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ Các máy móc dùng nghiên cứu bao g m máy đo n n độ ADN tổng số NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific, Mỹ), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy Biorad (Mỹ), máy real-time PCR Mygopro (IT-IS Life Science, Anh), máy ly tâm, thiết b đ ện di (Biorad), hệ thống chụp ản đ ện d Geldo (B or d) ấu tr t uộ P òn t í n m mó t ết b k t uộ p òn Proteom s S n ệm tr n đ ểm Côn n ệ En me Prote n - Tr n ĐHKH T Nhiên 2.3 ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 T ết N tổng số từ mẫu ôu t i trự tr ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u đ ợc tách b n k t t v ẫu u ết QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp Blood minikit (hãng QIAGEN Đức); Blood Genomic DNA Isolation Mini Kit (hang Norgen, Canada) C b t c ết t eo ớn dẫn nhà sản xuất 2.3.2 Tách chiết ADN plasmid ADN pl sm d đ ợc tách tinh s t eo t eo b n k t QIAprep-miniprep củ Q en C b t ến àn ớn dẫn ủ n sản xuất 2.3.3 Đ ện di kiểm tra ADN tổng số, sản phẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme S có mặt ADN tổng số sản p ẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme đ ợc kiểm tra b n p p p đ ện di gel agarose gel pol 2.3.4 Nhân bả C o n gen ty thể chứa ơn r l m de n uộm et d umbrom e t biến kỹ thuật PCR đo n ADN chứa v trí quan tâm thuộc gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, đo n 4977bp thuộc ADN ty thể đ ợc khuế đ i b ng phản ứng PCR với cặp m đặc hiệu Khuôn cho phản ứng PCR ADN ty thể có ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu bện n ân UTĐTT mẫu máu đối chứng Mất đo n 4977 bp ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng phản ứng PCR sử dụng bốn cặp m i: Mt (g m m i Fmt Rmt), 4977-1 (4977-1F 4977-1R), 4977-2 (4977-2F 4977-2R) 10398 (10398F 10398R) (Dimberg cs, 2014) 2.3.5 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật a ì ều Trong nghiên cứu này, biến đổ (đột biến đ ểm/đ với cặp m i ND1-1, 10398, COX-2.1, COX-1.1 c ứng cắt đ ợc th c với thành phần t eo 2.3.6 Nhân dòng trực tiếp o n gen chứa Chúng tiến hành nhân dòn tinh s ch plasmid m n o n cắt giới h n (PCR-RFLP) ìn đ ợ x đ nh b ng kỹ thuật PCR-RFLP en me giới h n NlaIII, DdeI, HincII Phản ớng dẫn nhà sản xuất t biến vào vector pJet1.2 đo n ADN gen ND1, ND4 HBB để thu plasmid, đo n en tr n để phục vụ cho việc d n đ ng chuẩn để đ n l ợng mức độ đo n số ADN ty thể 2.3 G ả trì tự o ứa t biến đo n ADN gen ND1, ND3 COX-1 COX-2 để khẳn đ nh kết PCR- Giải trình t RFLP, kết nhân dòng kết x đ nh đo n 2.3.9 Tinh s ch sản phẩm PCR Tn s sản p ẩm PCR b n kít QIAqu k el extr t on ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup để thu sản p ẩm t n s 2.3.10 Đ o ợ ứ ải trìn t ADN tr ất o v số ADN ty thể kỹ thuật real-time PCR Mứ độ đo n số s o đ ợ x D a giá tr chu kỳ n ỡng (Ct) x t ếp đ nh b n p ơn p p PCR đ n l ợng (real-time PCR) đ n đ ợc từ cặp m i ND1-2 cặp m i HBB qua phản ứng real- time PCR, số ADN ty thể đ ợc tính toán theo công thức đ ợ t m k ảo từ n n ứu tr (Xia cs, 2009; Gu cs, 2013) 2∆Ct Trong ó: ∆C = CtHBB - CtND1-2 Mứ độ đo n lớn ADN ty thể đ ợ x đ nh b n p ơn p p re l-time PCR Sử dụng hai cặp m i ND1-2 ND4 cho phản ứng real-t me PCR tron ặp m i ND1-2 nhân đ ợ đo n ADN ó kí t ớc 115 bp gen ND1 gen thuộc vùng xảy đo n Cặp m i ND4 nhân đ ợc đo n ADN ó kí t ớc 128 bp gen ND4 gen thuộ vùn t ty thể (He s 2002) N ng xuyên xảy đo n ADN vậy, d a s có mặt củ đo n ADN t uộ en ND4 gen ND1, chúng tô tín đ ợc tỷ lệ % số ADN ty thể không b đo n mẫu nghiên cứu (TLND4/ND1) theo công thức: Từ mứ độ đo n ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng công thức: ện di sản phẩm PCR-RFLP trình tự o n ADN chứa v trí 10398 Hình 3.3 (gel agarose 2%, nhu m EtBr) ếng M: Thang chuẩ N ế ối ch ng âm Giế đối ch d n phẩm cắt enzyme c a plasmid đ ợc gi i trình tự dạng đ ợc trộn lại với nhau, Giếng 1,3: s n phẩm PCR: giếng 2, s n phẩm cắt bằ ng c a mẫu nghiên c oạ ự N Hình 33A cho thấy, giếng mẫu d ng 10398A sản phẩm PCR sau cắt b ng enzyme DdeI o băn ó kí t t ơn ứng 196, 50bp, giếng mẫu d ng 10398G phẩm PCR sau cắt o băn b ng enzyme DdeI ó kí t t ơn ứn 158 bp 50 bp 38 bp (băn 38 bp kí nhỏ n n trô r n oà el) Kết PCR-RFLP đ ợ k ẳn đ n ín x b n t ớc ải trình t (Hình 3B) Tổng hợp kết sàng l c biến đổi A10398G mẫu nghiên cứu n tô x đ n đ ợc mô u có 47/86 mẫu (chiếm 54,7%) mang biến đổi A10398G, mô LCU 49/86 mẫu (chiếm 57%) S khác biệt tần suất A10398G giữ mô u mô LCU k ôn (kiểm đ n χ2) Trên mẫu đối chứng, biến đổ A10398G đ ợ x ơn so với mẫu un t vớ đ nh 31/67 mẫu (chiếm 46,3 %) thấp Sử dụn k ểm ín x F s er K bìn p ơn (χ2) để đ n đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT kết cho thấ A10398G vớ ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05) mối liên quan biến đổi b ến đổ A10398G l n qu n đo n T (P0 05) Trên gen ND3, biến đổ A10398G đ ợ x Al e mer (V nder s 2003; G e un t n qu n đến bện đ nh bệnh thoái hóa thần k n P rk nson s 2005) bệnh chuyển ó (Juo s 2010) Đố vớ bệnh ó công bố l n qu n đến lo b ến đổ nà tu n òn n v trò biến đổi A10398G liên t ống nghiên cứu đặc biệt vớ un t v (C nter s 2005; Cov rrub s s 2008; Ism ell s 2013 Tr n đố t ợn UTĐTT liệu l n qu n đến biến đổi A10398G h n chế 3.1.3 t số v tr ế ổ COX-1 COX-2 ty thể COX-2 B ng cách giải trình t ADN tr c tiếp từ sản phẩm PCR nhân lên từ cặp m i COX-2.1 31 mẫu mô u 31 bện n ân UTĐTT n tô x đ n đ ợc 13 biến đổ tron ó biến đổi làm thay đổi axit amin, tất biến đổ d n đ ng tế bào chất (Hình 3.4) Hình 3.4 t số v tr ế Biế đổ ổ tr COX-2 t t ể mô u bệ â UTĐTT 9 Biến đổi G7853A làm t ế đổi nucleotide đổ đổi axit amin từ Valine (V) thành Isoleucine (I) (Mitomap), xảy với tần suất cao 31 mẫu đ ợc giải trình t (4/31 tr để sàn l c 55 bệnh nhân l i b n p ng hợp) Vì vậy, biến đổ G7853A đ ợ l n ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-2.2 enzyme HincII Kết PCR-RFLP số mẫu đ ợc minh h a Hình 3.5 Hình 3.5 ệ sả p ẩ R-R o N COX-2 (gel agarose 2,5% nhu m EtBr) Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp Giếng (+) ối ch d n phẩ đ ợc cắt enzyme c a mẫu có biế đổ đ ợc khẳ định gi i trình tự); giếng:1,3,5,7,9,11: S n phẩm PCR; giếng: 2,4,6,8,10,12: S n phẩm cắt enzyme HincII ng Hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR (giến 11) ó kí k ôn t ơn ứn 472 bp băn rõ ó băn p ụ, chứng tỏ cặp m i COX-2 đ ợc thiết kế đặc hiệu Sản phẩm cắt en me t ơn ứng giếng 2, 4, 8, 10 12 t u đ ợ băn ó kí t t ơn ứng 257, 215 bp mẫu có biến đổi, giến t u đ ợ băn 215 144 113 bp mẫu biến đổi Tổng hợp kết giải trình t kết phân tích PCR- RFLP x đ nh 16/86 (chiếm 18,6%) bệnh nhân có biến đổi G7853A mô u LCU Trên mô u, tần suất biến đổi G7853A (15,1%) thấp ơn so với mô LCU (21,3%) Tuy nhiên, s khác biệt nà k ôn đối chứng, biến đổ G7853A đ ợ x Biến đổ G7853A l n qu n vớ ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05) Trên mẫu đ nh 13/67 mẫu (chiếm 19,4 %), thấp ơn so với mẫu un t tín đo n T bện n ân UTĐTT (P0,05) COX-1 T ơn t p ơn p p sàn l c biến đổi gen COX-2 gen COX-1 đ n đ ợc 17 biến đổ tron ó b ến đổi làm t đổ x t m n t uộ n tô x en COX-1 t t ể (Hình 3.6) Đặc biệt, biến đổi C6340T t n t i d ng d tế bào chất (kết giải trình t n oà đỉnh T có đỉnh C p í d ới (Hình 3.6C) Vì vậy, biến đổi đ ợc l a ch n sàng l c bệnh nhân l i b ng p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-1.2 enzyme BccI để x Hình 3.6 M t số v trí biế ế đổ ế đổ ế đổ đ nh tần suất biến đổi ổi gen COX-1 ty thể 99 Tổng hợp kết sàng l c biến đổi C6340T b n p ơn p p ải trình t PCR-RFLP cho thấy, mô u có 1/86 (1,16%) mẫu biến đổi hoàn toàn từ C thành T, 1/86 mẫu (1,16%) biến đổi d n d tế bào ất Trên mô LCU có 1/86 mẫu biến đổi hoàn toàn 2/86 mẫu có biến đổi d n d tế bào Tính chung, có 3/86 bệnh nhân có biến đổi C6340T mô u mô LCU N ất vậy, biến đổi C6340T xảy với tần suất thấp t n t i d n đ ng tế vào chất d tế bào chất bện n ân UTĐTT n i Việt Nam C o đến nay, giớ ó n ững công bố l n qu n đến số biến đổi gen COX-1 ty thể bện un t v UTĐTT un t t ền liệt tuyến (Ghatak cs, 2014; Namslauer cs, 2008; Chihara cs, 2011 Arnold cs, 2013) Có biến đổi gây hậu làm t đổi cấu trúc phân tử protein (Chihara cs, 2011) làm giảm ho t động phức hệ hô hấp tăn sản xuất gốc ROS nguyên nhân dẫn đến tăn tr ởng khối u ống nghiệm (Arnold cs, 2013) Tóm l n tô sàn l x đ n đ ợc tần suất xuất biến đổi A4164G, A10398G C6340T G7853A t ơn ứng gen ND1, ND3, COX-1 COX-2 ty thể nhóm bện n ân UTĐTT n i Việt N m Đã đ n đ ợc mối liên quan biến đổi A4164G, A10398G, G7853A vớ đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT Đặc biệt x đ n đ ợc biến đổi A4164G A10398G G7853A l n qu n đến mứ độ xâm lấn khối u (gia đo n T) với tần suất cao đo n T1, hai biến đổ A4164G A10398G ó xu ớn đ k m vớ n u N vậy, với kết cho r ng biến đổi A4164G, A10398G, G7853A đón v trò tron đo n đầu xâm lấn khối u UTĐTT 3.2 ẤT Đ ẠN ỚN Ủ NT T V UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Mất đo n lớn ADN ty thể đặ b ệt đo n 4977 bp đ ợ x lo i bện n bệnh ty thể, chuyển ó un t tron đn ó l n qu n đến nhiều ó UTĐTT (http://www.mitomap.org; http://www MitoBreak; C en s 2011; D mbe s 2014; Lee s 2009) Đặc biệt, số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đo n có s khác chủng tộ n i khác (Dimbeg cs, 2014; Dimbeg cs, 2015) Do vậy, với nghiên cứu khảo sát tỷ lệ đ n l ợng mứ độ đo n lớn ADN ty thể, tập trung vào đo n 4977 bp đ ng th i tìm hiểu mối liên quan đo n vớ đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT Việt Nam 3.2.1 Phát o n 4977 bp m t số o n lớn khác bệ tràng 3.2.1.1 X ịnh mấ â u t i trực o n 4977 bp Mất đo n 4977 bp ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng phản ứng PCR sử dụng bốn cặp m i: Mt (Fmt Rmt), 4977-1 (4977-1F 4977-1R), 4977-2 (4977-2F 4977-2R) 10398 (10398F 10398R) (Dimberg cs, 2014) với khuôn ADN ty thể có ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu nghiên cứu Tron sản phẩm cặp m i Mt (433bp) để x đ nh s có mặt ADN ty thể ADN tổng số, sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-1 đ ợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp m i 4977-2 (PCR l ng), sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-2 (381 bp) để x t ớc 246 bp từ m cặp m 10398 để x đ nh có đo n 4977 bp, sản phảm PCR kích đ nh ADN không b đo n 4977 bp Kết PCR từ đ ợc minh h a Hình 3.7 Hình 3.7 ện di sản phẩ R từ ặp t -2 103 (gel agarose %, nhu m EtBr) t số ẫu nghiên cứu Hình A: Giếng M: thang ADN chuẩn 250 bp Giế ối ch d n phẩm PCR c a cặp mồi Mt, 49779 đ ợ định gi i trình tự Giếng 2, 4, 6: s n phẩm PCR từ cặp Mt, 49779 ng mẫu nghiên c u Hình B: Giếng M: thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 1: s n phẩm PCR c a mồi Mt, giếng 2-5: S n phẩm PCR từ cặp mồi 4977-2, giế đối ch ng âm mt có băn s n Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm PCR từ cặp m đặc hiệu kí t đ n t eo đối chứn d ơn ( ếng 1, Hình 3.7A) đ ều ứng tỏ ADN tổng số có ADN ty thể Phần lớn mẫu nghiên cứu ó băn 381 bp ( ếng Hình 3.7A; giếng 2, 3, Hình 3.7B) N vậy, kết khẳn đ nh mẫu phân tích có ADN ty thể b đo n 4977 bp Thống kê kết sàng l c từ 86 ặp mẫu mô un t Bệnh viện K cung cấp, 67 mẫu m u đối chứn n tô x đ nh có 60 bệnh nhân có đo n đ ng th i mô u LCU Tỷ lệ đo n 4977 bp mô u 73/86 mẫu (84,9 ) o ơn so với mô LCU (61/86 mẫu), nhóm bện n ân o ơn so vớ n óm đối chứng (10/67 mẫu) (P0,05) (kiểm đ nh xác Fisher) Kết nà n i Việt ó n ữn đ ểm t ơn đ ng với kết nghiên cứu Chen cs (2011) Tuy nhiên, khác so với kết Chen cs (2011), không tìm thấy s khác biệt tỷ lệ đo n t eo độ tuổi Bên c n kết nghiên cứu r ng đo n 4977 bp đo n phổ biến bện UTĐTT n phù hợp so vớ i Việt N m N ỉ vậy, kết nà ôn bố tr ớc tính phổ biến lo đột biến nhiều lo un t vú (Dimbeg cs, 2015, un t n n n un t p ổi (Dai cs, 2006, UTĐTT (D mber s 2014; C en s 2011) Đặc biệt, tỷ lệ đo n 4977 bp bện n ân UTĐTT n t k i Việt N m o ơn so với lo i ung đ ợc công bố tr đâ (C en s 2011; Dimbeg cs, 2015; Dani cs, 2004) Tóm l i, đo n 4977 bp lo i đo n phổ biến, tỷ lệ cao mô un t n ân UTĐTT n ủ nhóm bệnh i Việt Nam t n tai d ng d tế bào chất Tỷ lệ đo n mô u t ốn k so vớ mô LCU (p0,05) (Kiểm đ nh Man-Whitney, Kruskal-Wallis) Kết nghiên cứu khác so với nghiên cứu Chen cs (2011), nhóm nghiên cứu mứ độ đo n giảm theo s tăn (C en s 211) n n l ủ đo n bệnh (P=0,031) bệnh UTĐTT n t ơn đ ng với kết nghiên cứu tr n đối t ợn un t (2008), mứ độ đo n k ôn l n qu n đến đặ đ ểm n ỉ r ng i Trung Quốc v Ye cs độ tuổi, mứ độ biệt ó đo n bệnh (Ye cs, 2008) 3.4 SỰ T Đ IS B N SAO ADN TY TH Ở B N N ÂN UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG S t đổ số s o ADN t t ể ó t ể làm tăn ảm n u mắc số lo un t l n qu n đến số đặ đ ểm bệnh h c củ un t (L n cs, 2011; Xing cs, 2008, Hu cs, 2016; Mi cs, 2015) Mặt khác, số l ợng ADN ty thể mứ độ đo n có mối liên quan với (Chen cs, 2011) Vì vậy, nghiên cứu này, song song vớ x đ nh mứ độ đo n lớn ADN ty thể, n tô n t ến àn đ n l ợng số ADN ty thể t ơn đối mẫu nghiên cứu b n p ơn p p re l-time PCR vớ ặp m ND1-2 HBB qu đ n mối liên quan s t đổi số ADN ty thể vớ đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT T ơn t cách d n p ơn trìn đ ng chuẩn ND1 ND4 n tô d n đ ợ đ = -3,49x+35,82, hệ số t ơn qu n R =0,993, hiệu suất khuế thiên từ 0,4-1,2 Từ thông số củ đ số ADN ty thể đ t hiệu o đ i 93,08%, hệ số biến ng chuẩn cho thấ xâ d n đ ợ p ín x ng chuẩn HBB có ơn p p đ n l ợng ổn đ n để áp dụng cho việ đ n l ợng số ADN ty thể mẫu nghiên cứu D a vào giá tr chu kỳ n t ơn đố n tô x ỡn x đn đ n đ ợc qua phản ứng real-time PCR, công thức tính số ó 48/86 ( ếm 55 ) bện n ân UTĐTT ó số s o t ơn đối mô u t ấp ơn so với mô LCU, 38/86 (chiếm 44 ) bện n ân ó số s o ADN t t ể t ơn đối mô u o ơn so với mô LCU Giá tr trung v khoảng tứ phân v số s o ADN t t ể tr n mô u LCU t ơn ứng 858,37 (537,01-1333,04) 949,83 (622,43-1544,89) S khác biệt số t ơn đối giữ mô u mô LCU ó ý n ĩ t ống kê (P0,05) Để trả l i câu hỏi: (1) có mố t ơn qu n mứ độ đo n, số ADN ty thể mẫu mô máu ngo i vi bện n ân UTĐTT (2) ó mố t ơn qu n đo n k ôn (3) n u ữa số mứ độ mắ UTĐTT ó l n qu n với mứ độ đo n, số ADN ty thể hay không? cần phân tích mứ độ đo n, số ADN ty thể mẫu mô, mẫu máu bệnh n ân un t Tu n đ k mn n độ 103 n mẫu bệnh viện K cung cấp g m có mô u LCU, mẫu máu âu ỏi nêu đ ợc trả l Đ ợc s p đỡ củ b sĩ Bệnh viện Quân n tô t u t ập bổ sun đ ợc mẫu g m 40 cặp mẫu mô u, mô LCU 40 bệnh nhân UTĐTT Đặc biệt, mẫu máu ngo i vi t i hai th đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bệnh nhân đ ợc cung cấp kèm theo mẫu mô đ ều giúp cho việ đ n mố t ơn qu n so s n mứ độ đo n mẫu mô máu bệnh nhân Mặt khác kết hợp với kết p ân tí chứng x đn đ ợ n u mắ UTĐTT ó u ản tr n m u đối ởng mứ độ đo n, số ADN ty thể hay không 3.5 M TƯƠNG QU N V V UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÒ ỦA MẤT Đ ẠN, S B N SAO VỚ NGU Ơ Mứ độ đo n lớn, số ADN ty thể mô u, LCU, mẫu m u đ ợc lấy t i hai th ẮC đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bện n ân UTĐTT Bệnh viện Quân đội 103 mẫu đối chứng đ ợc x đ nh b n p ơn p p re l-time PCR Đối với mẫu đối chứng, mứ độ đo n đ ợ x 17 mẫu (là mẫu đ ợ x đ nh có đo n b n p đ nh ơn p p PCR l ng), số s o đ ợc xác đ nh 67 mẫu Kết cho thấy, mứ độ đo n máu bện n ân UTĐTT o ơn m u đối chứng (P0,05) Đối với số ADN ty thể, có s khác biệt so sánh mô máu bện n ân un t mô un t ữa máu bện n ân un t o ơn so vớ m u un t m u đối chứng (P

Ngày đăng: 26/10/2017, 09:28

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan