Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - T NĐ Ở N NG N ỨU Ủ TS G NT T UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Chuyên ngành: S v vật Mã số: 62420104 ỰT T TẮT UẬN ÁN TI N SĨ SINH HỌC Hà N i – 2017 ô trì N ợc hoàn thành t i: Tr n Đ ớng dẫn khoa h c: K o T n n ĐHQGHN PGS TS Tr n H n T TS Tô T n T Phản biện: Phản biện: Phản biện: Luận án đ ợc bảo vệ tr ớc Hộ đ ng cấp sở chấm luận án tiến sĩ vào h i gi p t n t n năm 201 Có thể tìm hiểu luận án t i: -T v ện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - T v ện Đ i h c Quốc gia Hà Nội pt i MỞ ĐẦU Un t đ i tr thứ t un t tràn (UTĐTT) đứng thứ ba mứ độ phổ biến nguyên nhân gây tử vong cao toàn cầu (Arnold cs, 2016) Nhiều yếu tố n u â bện n ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống vận động, l m dụng thuốc chất kí nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo UTĐTT đứng thứ năm s u un t bện n ân t n đìn (Amer n C n er So et n p ổi, d dà un t đ ều cho thấy khả năn o đặc biệt ẩn đo n bệnh đặc thù 2014-2016) Ở Việt Nam, v độ phổ biến (Globocan, 2012) Tuy ó t n l ợng tốt đ ợc chẩn đo n đ ều tr bệnh nhân tử von UTĐTT mứ t í ế độ đo n sớm song tỷ lệ n ớc chậm phát triển (globocan, 2012), đo n sớm h n chế Do vậy, việc tìm dấu hiệu chẩn đo n bệnh sớm đ ợc quan tâm nhiều tron ó ớng nghiên cứu mối liên quan s biến đổi ADN ty thể với bệnh Dữ liệu ôn bố cho thấy, biến đổi ADN ty thể tế bào ung t un ấp hiểu biết bệnh sinh khối u hứa hẹn sở tiềm năn l ợn đ ều tr un t Đ ợ ot n (Br ndon s 2006; Carew cs, 2002) o “n m ” sản xuất năn l ợng, ty thể có vai trò quan tr ng cho m i ho t động sống tế bào t ể Đặc biệt, ty thể có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân Ở n ty thể ó kí t i, ADN ớc 16.569 bp, sợ đô d ng m ch vòng chứa 37 gen đ ợ đ ều khiển chung vùng đ ều khiển D-loop ADN ty thể trình t intron, protein bảo vệ Histone Hơn nữ chế sửa chữa sai hỏng ty thể òn đơn ản nên dễ b t động biến đổi (Aral cs, 2007) S biến đổi gây thiếu hụt hay rối lo n ho t động năn lo n bệnh tật Những nghiên cứu gần đâ ty thể qu â r n ững rối o t ấy, biến đổi ADN ty thể gây khiếm khuyết phức hệ hô hấp l n qu n đến nhiều lo un t Brandon cs, 2006) Cụ thể ơn số đột biến đ ìn (S n s 2009; Czarnecka s, 2007, gen ND1, ND3 thuộc phức hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV, đo n lớn s t đ ợ x đ nh nhiều lo un t đổi số ADN ty thể tron ó UTĐTT (Br ndon s 2006 Czarnecka s, 2007; Lee cs, 2009) Hơn nữa, số công bố cho thấy s biến đổi ADN ty thể mối liên quan với bện ó tín đặ tr n t eo vùn đ a lý chủng tộc (Dimberg cs, 2014; Canter cs, 2005) Tr n đối t ợn n V ệt N m n n ứu t eo ớn nà n đ ợ qu n tâm tron n ữn năm ần đâ tu nhiên, chủ yếu tập trung vào bện t ần kinh (Huệ cs, 2012), Huệ cs, 2012[Error! Reference source not found.]), bện un t v (An s 2015 L n s 2014 Tr n s 2015) Đối vớ bện UTĐTT có công bố Dimberg cs (2014) với số liệu b n đầu đột biến đo n 4977 bp nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc khảo sát nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg cs, 2014 Do vậy, nghiên cứu với ph m vi rộng mứ độ sâu ơn tr n đối t ợng bệnh nhân Việt Nam mối liên quan s biến đổi ADN ty thể với bện UTĐTT đặc biệt với đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT ó ý n ĩ giúp hiểu thêm ế bệnh h c tiến triển UTĐTT ó t ể sở cho việc tìm th ADN ty thể để nhận biết bệnh sớm Từ th c tế nà n tô t c đề tài luận án: “ ” với hai mục tiêu: Khảo sát số d ng biến đổ (đột biến đ ìn ) gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, đo n 4977 bp mứ độ đo n lớn số s o ADN t t ể mẫu mô mẫu m u ủ n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m Tìm hiểu mối liên quan d ng biến đổi gen, tỷ lệ đo n 4977 bp, mứ độ đo n lớn s t đổi số l ợng ADN ty thể với số đặ đ ểm bệnh h c bệnh UTĐTT Việt N m qu tìm r n ữn b ến đổ t ềm năn ó t ể phát triển thành th trợ ẩn đo n t n l ợn bện Đ ợng nghiên c ị m th c hi n ề tài luận án Nghiên cứu đ ợc th c mẫu mô u mô lân ận u (LCU) số mẫu m u đ ợ un k m t eo mẫu mô nhóm bện n ân UTĐTT Mẫu mô mẫu máu bện n ân un t cung cấp từ K o ả p ẫu bện đ ợc Bệnh viện K Hà Nội Bệnh viện Quân y 103 từ năm 2012 - 2016 Mẫu máu củ n i khỏe m n bìn t truyền m u Trun ơn un ấp n (m u đối chứn ) K o Sàn l m u V ện huyết h c ấp Các nghiên cứu luận n đ ợc th c t i Phòng Proteomics Sinh h c cấu trúc thuộc Phòng Thí nghiệm tr n đ ểm Công nghệ Enzyme Protein, Bộ môn Sinh lý h c Sinh h Sinh h Tr Đ o n i, Khoa n ĐHKH T nhiên – ĐHQG Hà Nội c nghiên c u Đố t ợng tham gia nghiên cứu hoàn toàn t nguyện Quy trình lấy mẫu t eo đ n qu đ nh Bệnh viện Các thông tin cá nhân bệnh nhân tham gia nghiên cứu đ ợc mã hóa bảo mật Ý - ĩ k o ọc th c tiễn c Kết ủ luận n un đo n lớn, s t ề ậ ấp liệu biến đổi số gen ty thể, tỷ lệ mứ độ đổ số l ợng ADN ty thể n óm bện n ân UTĐTT V ệt N m Đâ ngu n liệu tham khảo quan tr ng cho nghiên cứu bệnh h c phân tử củ UTĐTT - Luận n xâ d n đ ợ p ơn p p x đn đột b ến đ ểm đột b ến đo n đ n l ợn mứ độ đo n số s o ADN t t ể t ơn đố sở n - C n ứu x t n kết ủ n n ứu nà ó t ể đ ợc sử dụn làm sở k o ởn đo n 4977 bp mứ độ đo n lớn s t Đó - en ND1, ND3, COX-1, COX-2 đến n u óp ới c ề t ợn bện UTĐTT b n - ơn p p Đề tà luận n n o ủ số b ến đổi ADN ty thể n p n ứu t ếp tỷ lệ đột b ến mắ t ến tr ển ủ UTĐTT n ứu đầu t n x ơn p p PCR p ả trìn t en p đ n tỷ lệ mứ độ đo n lớn s en ND1, ND3, COX-1 COX-2 tr n đố ơn p p đ ìn ều dà đo n cắt giới h n ơn p p re l-t me PCR V ệt N m n ứu cung cấp liệu mố l n qu n 4977 bp mứ độ đo n lớn s t ữ tỷ lệ đột b ến đo n đổ số s o ADN t t ể số v trí biến đổi ủ gen ND1 (A4164G), ND3 (A1398G), COX-1 (C6340T) COX-2 (G7853A) vớ ủ bện UTĐTT n liên quan vớ n đổ số s o ADN t t ể số đột b ến đ ểm đổ số s o ADN t t ể số biến đổi ủ (PCR-RFLP) p ó t ể đ ợ áp dụn ậ Đề tà luận n tron n ữn n t ơn p p nà ệm có liên quan Việt Nam t eo: xâ d n mô ìn d đo n ản tr n p đặ đ ểm bện V ệt N m Tron đó, biến đổ A4164G A10398G G7853A đo n T bệnh, biến đổi A4164G, G7853A liên quan với giớ tín biến đổ A4164G A10398G ó xu Đặc biệt, ớn đ k m n u xảy với tần suất cao giai đo n T1, giảm dần đo n T 2, T3 T4 Mứ độ đo n lớn liên quan với v trí un t độ biệt hóa, số ADN ty thể l n qu n đến v trí un t - Đề tà luận n n mứ độ xâm lấn khối u n ứu phát đo n mớ 5094 bp 5169 bp 5104 bp ADN ty thể Đặc biệt, việ tăn mứ độ đo n yếu tố làm tăn n u t ơn qu n n mắ UTĐTT ó mối ch mứ độ đo n số ADN ty thể mô LCU bện UTĐTT ƯƠNG T NG QUAN TÀI LI U 1.1 UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Thực tr ng mắ u t i trực tràng Un t đ i tr tràn (UTĐTT) đứng thứ ba mứ độ phổ biến nguyên nhân gây tử vong cao thứ t un t tr n toàn ầu (Arnold cs, 2016) T i Việt Nam, số ca bện UTĐTT đ ợc chẩn đo n chiếm tỷ lệ khoảng 7% tổng số un t đ ợc xếp vào v trí thứ năm s u un t n un t p ổ un t d dà un t v Tỷ lệ tử von UTĐTT ếm khoảng 6,3%, cao thứ t s u t gan, un t p ổ un t d dày (Globocan, 2012) Nhìn chung, tỷ lệ mắc tử vong bện UTĐTT đ n nhập thấp trung bình, ổn đ n ó xu ớng giảm ó xu ớn tăn quốc gia có thu n ớc có thu nhập cao (Arnold cs, 2016) Tuy nhiên, tỷ lệ mắc tử vong cao cho thấ đâ ăn bệnh nguy hiểm đ n n nặng toàn cầu 1.1.2 Các hệ thố p â a o n bệ Có nhiều hệ thốn p ân vào kí t ou t đo n cho ung t i trực tràng Đối vớ UTĐTT t ng p ân đo n un t d a ớc khối u (T), mứ độ lâ l n đến h ch b ch huyết (N) s diện củ d ăn (M) (Tumor- lymph Node – Metastases, TNM) (American Cancer Society, 2016), (Compto cs, 2004) 1.1.3 Các yếu tố u â u Nhiều yếu tố n u t trự tr â bện n vận động, l m dụng thuốc chất kí t í ế độ ăn uống thiếu lành m nh, s lão hóa, lối sống đặc thù nghề nghiệp hay hội chứn đ pol p t eo (American Cancer Society, 2014-2016) Đặ b ệt số biến đổi tr n ADN t t ể n đ ìn đo n, s t đổi số ADN t (Br ndon s 2006 Czarnecka s 2007; Lee cs, 2009) 1.2 TY TH NGƯỜI 1.2.1 ấu tr v ứ n đ ợ x đn đình đột biến đ ểm, ó l n qu n đến n u mắc ung t t ể Ty thể bào quan có mặt tế bào chất hầu hết tế bào nhân thật, có nhiều hình d ng khác Ty thể g m hai lớp màng lipoprotein, hai lớp màng khoang gian màng, bên hai màng chất Ty thể “nhà máy” năn l ợng tế bào, tham gia vào trình apoptosis (quá trình tế bào chết t eo u trìn ) (Du s 2000; L u s 1996; W n s 2016 qu trìn lão ó ủ ơt ể (Bratic, 2013) đ ều chỉnh tín hiệu canxi (Rizzuto, 2012) số khác Nhiều nghiên cứu r ng, biến đổi hệ gen ty thể ó l n qu n đến việc phát sinh số bệnh ty thể bện un t (Dimauro, 2007; Bradon cs, 2006; Chatterjee cs, 2006) 1.2.2 Hệ gen ty thể Bào quan ty thể có hệ gen riêng nhân độc lập với hệ gen nhân ADN ty thể n d ng m ch vòng, sợ đô ó kí t it nt iở ớc 16.569 bp, bao g m 37 gen, mã hóa cho phân tử rRNA (12S, 16S), 22 phân tử tRNA 13 phân tử protein thuộc phức hợp chu i hô hấp (Anderson s 1981) 1.2.3 Hiệ t ợng d tế bào chất v ỡng biểu t biến ADN ty thể Do hệ gen ty thể có nhiều sao: vài ty thể, hàng nghìn tế bào Vì vậy, ADN ty thể có hai d ng t n t đ ng tế bào chất d tế bào chất Đ ng tế bào chất (homoplasmy) tr ng thái t n t i mà tế bào mô qu n tất ADN ty thể giống D tế bào chất (Heteroplasmy) t n t biến tế bào mô qu n 1.3 Đ T N NT T Một số nghiên cứu đ ng th i ADN d ng bìn t ng d n đột t ể (DiMauro cs, 2007) V N UNG T Ư ỉ r ng, gốc t ho t động chứa oxi (Reactive oxygen species, ROS) l n qu n đến s tăn tr ởng tế bào, s chết tế bào, s sinh sản, hình thành m ch, s p t s n t ến tr ển d ăn ủ un t (Desouki cs, 2005[Error! Reference source not found.], Ishikawa K, 2008) ROS sản phẩm phụ trình hô hấp ty thể (oxidative phosphorylation, OXPHOS), có từ - 4% oxi tiêu thụ hô hấp ty thể t ì đ ợc chuyển thành ROS (Desouki cs, 2005) Hơn nữa, đột biến ADN ty thể làm nhiên, s tăn tăn ROS nội sinh l t ốc ROS (Carew cs, 2012; Brandon cs, 2006), động trở l i gây tổn h i thêm cho ADN ty thể ADN nhân (Carew cs, 2012) Ngoài ra, s ho t động NADPH-ox d se (Nox1) đ n kể ROS tế bào Nox1 l đ ợc kiểm soát s ho t động gen ty thể, s kiểm soát gen ty thể góp phần t o khối u số lo un t trứng (Desouki s 2005) N n un t v un t vậy, ho t động số biến đổi ADN ty thể ản tr c tiếp đến việc t o ROS t phát sinh phát triển un t n t o l ợng động thông qua Nox1 từ ó t ể ản bu ng ởng ởn đến trình Mặt khác, khiếm khuyết ho t động chu i hô hấp đột biến ADN ty thể dẫn đến s biểu mức trình sản xuất Surperox de k n poptos s tăn i biểu ức ADN nhân Những biến đổi kiểu hình tế bào đ ợc biết đến góp phần vào s hình thành, phát triển củ un t (S n N ều d n b ến đổ tr n ADN t t ể đ ợ x UTĐTT Các biến đổi đ ìn n cs, 2009) đn ó t ể ó l n qu n đến bện un t đột b ến ó t ể dẫn đến t enzyme thuộc chu i hô hấp, dẫn đến việ k ôn đảm bảo năn dòng vận chuyển đ ện tử bìn t tron ó đổi cấu trúc ó t ể làm ản ởng tới ng phức hệ hô hấp ty thể Các biến đổi g m đo n lớn, s thay đổi số sao, biến đổi gen ND1, ND3, COX-1 COX-2 Tuy nhiên, vai trò biến đổi, đo n s t đổi số l ợng ADN ty thể un t òn nhiều đ ều rõ cần tiếp tụ đ ợc nghiên cứu un tron ó UTĐTT 1.3.1 Mất o n lớn ADN ty thể Các đo n lớn ADN ty thể, chủ yếu đo n xảy giữ (khoảng 68%), có tần suất thấp ơn so vớ bệnh ty thể, bện un t đo n trình t lặp t ơn đ ng đột biến đ ểm, nhiên chúng l i góp phần nhiều ơn vào lão ó (C en s 2011b P rk s 2015) T eo Kr s n n s (2008), đo n xảy trình sửa chữa ADN ty thể b sai hỏn (Kr s n n s 2008) Trong lo i đo n lớn t ì đo n 4977 bp đo n phổ biến xả r từ v trí 8470 đến 13447 làm đ en mã ó o pol pept de phức hệ I (ND3, ND4, ND4L ND5), polypeptide (COXIII) phức hệ IV polypeptide phức hệ V (ATP8, ATP6), tARN vận chuyển axitamin Mất đo n 4977 bp xảy giữ đo n trình t lặp dài 13 nu (ACCTCCCTCACCA) đầu v trí 8470–8482 (thuộc gen ATPase 8) 13447–13495 (thuộc gen ND5) (Chen cs, 2011; Dani cs, 2008) Mất đo n 4977 bp đ ợ x un t v đn ó l n qu n đến n ều lo un t p ổi, niêm m c tử cung, th c quản, d dày, gan, thận, tuyến k n un p UTĐTT (D n s 2004, Chen cs, 2011; Ye s 2008; D s 2006; D mber 2015 Ar l s 2007) 1.3.2 Sự t a ổi số ADN ty thể bệnh ung t Số l ợng ADN ty thể t s 2013; Yu s 2007; X UTĐTT (T t r đổ đ ợ đề cập đến lo v un t s 2009; M mbo s 2005) un t ty thể giảm mẫu un t t un t tu ến n ớc b t un t vùn đầu cổ un t tử un un t k ợng thận un t ởng khác lên lo un t n n (Y n s 2004) un (Lee s 2009) Tron số số ADN n un t tu ến d dà p un t un t k v n bu ng trứn t ền liệt tuyến đặc biệt UTĐTT (Lee s 2009) N ADN ty thể â r p ổ (Hos ood s 2010) n s 2012; Qu s 2011; Fen s 2011) un t t ận (Xing cs, 2008) số d n un t v (T n tăn tron un t vậy, s t nội m c đổi số n u s tăn số ADN ty thể để đ p ứng với stress oxi hóa (Lee cs, 2000) Tuy nhiên, thông tin mối liên quan s thay đổi số ADN ty thể vớ đặ đ ểm bệnh h c củ un t òn n ều đ ều rõ ần tiếp tục đ ợc nghiên cứu ổi m t số gen ty thể mã hóa cho protein tham gia chuỗi hô hấp tế bào 1.3.3 Biế Các biến đổi ADN ty thể vùn đ ều khiển vùn mã ó đ ợ x t t k đ nh nhiều lo i ung n u với vai trò gây ức chế phức hệ hô hấp tế bào (OXPHOS) tăn sản xuất ROS đẩy s phát triển tế bào un t mô tr mứ độ nhẹ ơn ó t ể cho phép khối u thích ứng với ng (Brandon cs, 2006) Nghiên cứu tr đâ ND3 làm tăn n u un t v bện n ân n đột biến gen COX-1 làm tăn n u p t tr ển un t ỉ r n đột biến G10398A thuộc gen i Mỹ gốc phi (Canter cs, 2005) hay số t ền liệt tuyến (Petros cs 2004) Đặc biệt, biến đổi gen mã hóa cho protein thuộc phức hệ hô hấp tế bào n hệ hô hấp I, COX-1, COX-2 thuộc phức hệ hô hấp IV đ ợ x en ND1, ND3 thuộc phức đ nh nhiều lo UTĐTT (Yusn t s 2010; Akou ek n s 2011; Yuex o 2016; C un t tron r s 2011; Errichiello cs, 2015) 1.4 NG N ỨU NĐ Tr n đố t ợn n nhữn năm ần đâ Ủ NT T V ệt N m n tu n n n 2012), Huệ cs, 2012), bện un t ỞV TN n ứu biến đổi ADN ty thể đ ợ qu n tâm tron n ứu chủ yếu tập trung vào bện t ần kinh (Huệ cs, v (An s 2015 L n s 2014 Tr n s 2015) Đối vớ bện UTĐTT có công bố Dimberg cs (2014) với số liệu b n đầu đột biến đo n 4977 bp nhóm bệnh nhân Việt N m đ ợc nghiên cứu với nhóm bệnh nhân Thụy Đ ển (Dimberg cs, 2014) 1.5 Á ƯƠNG Để x Á ÁT đ n đ n l ợn N Đ T BI N GEN TY TH b ến đổ tr n ADN t t ể t PCR-RFLP ả trìn t k ơn p p ó t ể dùn kết ợp vớ n u để tăn độ C p n p dụn số p ơn p p s u: en PCR đ n l ợng (real-time PCR), Southern blot số p ín x ủ kết p ân tí ơn p p ƯƠNG NGU N UV ƯƠNG Á NG N ỨU 2.1 NGUYÊN LI U 2.1.1 Mẫu nghiên cứu Bộ mẫu g m 86 cặp mẫu mô u mô LCU 86 bện n ân UTĐTT Bệnh viện K Hà Nội cung cấp Bệnh viện Quân đội 103 cung cấp mẫu g m 40 cặp mẫu mô u mô LCU kèm theo 40 cặp mẫu m u đ ợc lấy t i hai th 67 mẫu máu củ n m u Trun đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bệnh nhân UTĐTT i khỏe m nh đến hiến máu dùng làm đối chứng Viện huyết h c Truyền ơn cung cấp Các mẫu nghiên cứu đ ợc thu thập từ năm 2012 - 2016 đ ợc bảo quản tủ -80 C với mẫu mô, -200C với mẫu máu 2.1.2 a Các cặp m ất ợ sử ụ dùn o p ân tí tro ứu PCR-RFLP x đ nh đo n, real-time PCR đ ợc thiết kế b ng phần mềm primer - BLAST NCBI đ ợ đặt tổng hợp từ hãng IDT Invitrogen (Mỹ) C đệm ch y PCR, real-t me PCR n Hot Start PCR Master Mix2x (Thermo Scientific, Mỹ, qPCR BIO SyGreen Mix LO-ROX 2X (Biosystem), enzyme cắt giới h n hãng Ferment s (Đứ ) số ó ất k đ t độ t n k ết o p ân tí sn p ân tử 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THI T BỊ Các máy móc dùng nghiên cứu bao g m máy đo n n độ ADN tổng số NanoDropTM 2000c (Thermo Scientific, Mỹ), máy nhân gen PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ), máy Biorad (Mỹ), máy real-time PCR Mygopro (IT-IS Life Science, Anh), máy ly tâm, thiết b đ ện di (Biorad), hệ thống chụp ản đ ện d Geldo (B or d) ấu tr t uộ P òn t í n m mó t ết b k t uộ p òn Proteom s S n ệm tr n đ ểm Côn n ệ En me Prote n - Tr n ĐHKH T Nhiên 2.3 ƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 T ết N tổng số từ mẫu ôu t i trự tr ADN tổng số từ mẫu mô mẫu m u đ ợc tách b n k t t v ẫu u ết QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp Blood minikit (hãng QIAGEN Đức); Blood Genomic DNA Isolation Mini Kit (hang Norgen, Canada) C b t c ết t eo ớn dẫn nhà sản xuất 2.3.2 Tách chiết ADN plasmid ADN pl sm d đ ợc tách tinh s t eo t eo b n k t QIAprep-miniprep củ Q en C b t ến àn ớn dẫn ủ n sản xuất 2.3.3 Đ ện di kiểm tra ADN tổng số, sản phẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme S có mặt ADN tổng số sản p ẩm PCR, sản phẩm cắt enzyme đ ợc kiểm tra b n p p p đ ện di gel agarose gel pol 2.3.4 Nhân bả C o n gen ty thể chứa ơn r l m de n uộm et d umbrom e t biến kỹ thuật PCR đo n ADN chứa v trí quan tâm thuộc gen ND1, ND3, COX-1, COX-2, đo n 4977bp thuộc ADN ty thể đ ợc khuế đ i b ng phản ứng PCR với cặp m đặc hiệu Khuôn cho phản ứng PCR ADN ty thể có ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu mô, máu bện n ân UTĐTT mẫu máu đối chứng Mất đo n 4977 bp ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng phản ứng PCR sử dụng bốn cặp m i: Mt (g m m i Fmt Rmt), 4977-1 (4977-1F 4977-1R), 4977-2 (4977-2F 4977-2R) 10398 (10398F 10398R) (Dimberg cs, 2014) 2.3.5 Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật a ì ều Trong nghiên cứu này, biến đổ (đột biến đ ểm/đ với cặp m i ND1-1, 10398, COX-2.1, COX-1.1 c ứng cắt đ ợc th c với thành phần t eo 2.3.6 Nhân dòng trực tiếp o n gen chứa Chúng tiến hành nhân dòn tinh s ch plasmid m n o n cắt giới h n (PCR-RFLP) ìn đ ợ x đ nh b ng kỹ thuật PCR-RFLP en me giới h n NlaIII, DdeI, HincII Phản ớng dẫn nhà sản xuất t biến vào vector pJet1.2 đo n ADN gen ND1, ND4 HBB để thu plasmid, đo n en tr n để phục vụ cho việc d n đ ng chuẩn để đ n l ợng mức độ đo n số ADN ty thể 2.3 G ả trì tự o ứa t biến đo n ADN gen ND1, ND3 COX-1 COX-2 để khẳn đ nh kết PCR- Giải trình t RFLP, kết nhân dòng kết x đ nh đo n 2.3.9 Tinh s ch sản phẩm PCR Tn s sản p ẩm PCR b n kít QIAqu k el extr t on ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup để thu sản p ẩm t n s 2.3.10 Đ o ợ ứ ải trìn t ADN tr ất o v số ADN ty thể kỹ thuật real-time PCR Mứ độ đo n số s o đ ợ x D a giá tr chu kỳ n ỡng (Ct) x t ếp đ nh b n p ơn p p PCR đ n l ợng (real-time PCR) đ n đ ợc từ cặp m i ND1-2 cặp m i HBB qua phản ứng real- time PCR, số ADN ty thể đ ợc tính toán theo công thức đ ợ t m k ảo từ n n ứu tr (Xia cs, 2009; Gu cs, 2013) 2∆Ct Trong ó: ∆C = CtHBB - CtND1-2 Mứ độ đo n lớn ADN ty thể đ ợ x đ nh b n p ơn p p re l-time PCR Sử dụng hai cặp m i ND1-2 ND4 cho phản ứng real-t me PCR tron ặp m i ND1-2 nhân đ ợ đo n ADN ó kí t ớc 115 bp gen ND1 gen thuộc vùng xảy đo n Cặp m i ND4 nhân đ ợc đo n ADN ó kí t ớc 128 bp gen ND4 gen thuộ vùn t ty thể (He s 2002) N ng xuyên xảy đo n ADN vậy, d a s có mặt củ đo n ADN t uộ en ND4 gen ND1, chúng tô tín đ ợc tỷ lệ % số ADN ty thể không b đo n mẫu nghiên cứu (TLND4/ND1) theo công thức: Từ mứ độ đo n ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng công thức: ện di sản phẩm PCR-RFLP trình tự o n ADN chứa v trí 10398 Hình 3.3 (gel agarose 2%, nhu m EtBr) ếng M: Thang chuẩ N ế ối ch ng âm Giế đối ch d n phẩm cắt enzyme c a plasmid đ ợc gi i trình tự dạng đ ợc trộn lại với nhau, Giếng 1,3: s n phẩm PCR: giếng 2, s n phẩm cắt bằ ng c a mẫu nghiên c oạ ự N Hình 33A cho thấy, giếng mẫu d ng 10398A sản phẩm PCR sau cắt b ng enzyme DdeI o băn ó kí t t ơn ứng 196, 50bp, giếng mẫu d ng 10398G phẩm PCR sau cắt o băn b ng enzyme DdeI ó kí t t ơn ứn 158 bp 50 bp 38 bp (băn 38 bp kí nhỏ n n trô r n oà el) Kết PCR-RFLP đ ợ k ẳn đ n ín x b n t ớc ải trình t (Hình 3B) Tổng hợp kết sàng l c biến đổi A10398G mẫu nghiên cứu n tô x đ n đ ợc mô u có 47/86 mẫu (chiếm 54,7%) mang biến đổi A10398G, mô LCU 49/86 mẫu (chiếm 57%) S khác biệt tần suất A10398G giữ mô u mô LCU k ôn (kiểm đ n χ2) Trên mẫu đối chứng, biến đổ A10398G đ ợ x ơn so với mẫu un t vớ đ nh 31/67 mẫu (chiếm 46,3 %) thấp Sử dụn k ểm ín x F s er K bìn p ơn (χ2) để đ n đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT kết cho thấ A10398G vớ ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05) mối liên quan biến đổi b ến đổ A10398G l n qu n đo n T (P0 05) Trên gen ND3, biến đổ A10398G đ ợ x Al e mer (V nder s 2003; G e un t n qu n đến bện đ nh bệnh thoái hóa thần k n P rk nson s 2005) bệnh chuyển ó (Juo s 2010) Đố vớ bệnh ó công bố l n qu n đến lo b ến đổ nà tu n òn n v trò biến đổi A10398G liên t ống nghiên cứu đặc biệt vớ un t v (C nter s 2005; Cov rrub s s 2008; Ism ell s 2013 Tr n đố t ợn UTĐTT liệu l n qu n đến biến đổi A10398G h n chế 3.1.3 t số v tr ế ổ COX-1 COX-2 ty thể COX-2 B ng cách giải trình t ADN tr c tiếp từ sản phẩm PCR nhân lên từ cặp m i COX-2.1 31 mẫu mô u 31 bện n ân UTĐTT n tô x đ n đ ợc 13 biến đổ tron ó biến đổi làm thay đổi axit amin, tất biến đổ d n đ ng tế bào chất (Hình 3.4) Hình 3.4 t số v tr ế Biế đổ ổ tr COX-2 t t ể mô u bệ â UTĐTT 9 Biến đổi G7853A làm t ế đổi nucleotide đổ đổi axit amin từ Valine (V) thành Isoleucine (I) (Mitomap), xảy với tần suất cao 31 mẫu đ ợc giải trình t (4/31 tr để sàn l c 55 bệnh nhân l i b n p ng hợp) Vì vậy, biến đổ G7853A đ ợ l n ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-2.2 enzyme HincII Kết PCR-RFLP số mẫu đ ợc minh h a Hình 3.5 Hình 3.5 ệ sả p ẩ R-R o N COX-2 (gel agarose 2,5% nhu m EtBr) Giếng M: Thang ADN chuẩn 50bp Giếng (+) ối ch d n phẩ đ ợc cắt enzyme c a mẫu có biế đổ đ ợc khẳ định gi i trình tự); giếng:1,3,5,7,9,11: S n phẩm PCR; giếng: 2,4,6,8,10,12: S n phẩm cắt enzyme HincII ng Hình 3.5 cho thấy, sản phẩm PCR (giến 11) ó kí k ôn t ơn ứn 472 bp băn rõ ó băn p ụ, chứng tỏ cặp m i COX-2 đ ợc thiết kế đặc hiệu Sản phẩm cắt en me t ơn ứng giếng 2, 4, 8, 10 12 t u đ ợ băn ó kí t t ơn ứng 257, 215 bp mẫu có biến đổi, giến t u đ ợ băn 215 144 113 bp mẫu biến đổi Tổng hợp kết giải trình t kết phân tích PCR- RFLP x đ nh 16/86 (chiếm 18,6%) bệnh nhân có biến đổi G7853A mô u LCU Trên mô u, tần suất biến đổi G7853A (15,1%) thấp ơn so với mô LCU (21,3%) Tuy nhiên, s khác biệt nà k ôn đối chứng, biến đổ G7853A đ ợ x Biến đổ G7853A l n qu n vớ ó ý n ĩ t ống kê (P>0,05) Trên mẫu đ nh 13/67 mẫu (chiếm 19,4 %), thấp ơn so với mẫu un t tín đo n T bện n ân UTĐTT (P0,05) COX-1 T ơn t p ơn p p sàn l c biến đổi gen COX-2 gen COX-1 đ n đ ợc 17 biến đổ tron ó b ến đổi làm t đổ x t m n t uộ n tô x en COX-1 t t ể (Hình 3.6) Đặc biệt, biến đổi C6340T t n t i d ng d tế bào chất (kết giải trình t n oà đỉnh T có đỉnh C p í d ới (Hình 3.6C) Vì vậy, biến đổi đ ợc l a ch n sàng l c bệnh nhân l i b ng p ơn p p PCR-RFLP với cặp m i COX-1.2 enzyme BccI để x Hình 3.6 M t số v trí biế ế đổ ế đổ ế đổ đ nh tần suất biến đổi ổi gen COX-1 ty thể 99 Tổng hợp kết sàng l c biến đổi C6340T b n p ơn p p ải trình t PCR-RFLP cho thấy, mô u có 1/86 (1,16%) mẫu biến đổi hoàn toàn từ C thành T, 1/86 mẫu (1,16%) biến đổi d n d tế bào ất Trên mô LCU có 1/86 mẫu biến đổi hoàn toàn 2/86 mẫu có biến đổi d n d tế bào Tính chung, có 3/86 bệnh nhân có biến đổi C6340T mô u mô LCU N ất vậy, biến đổi C6340T xảy với tần suất thấp t n t i d n đ ng tế vào chất d tế bào chất bện n ân UTĐTT n i Việt Nam C o đến nay, giớ ó n ững công bố l n qu n đến số biến đổi gen COX-1 ty thể bện un t v UTĐTT un t t ền liệt tuyến (Ghatak cs, 2014; Namslauer cs, 2008; Chihara cs, 2011 Arnold cs, 2013) Có biến đổi gây hậu làm t đổi cấu trúc phân tử protein (Chihara cs, 2011) làm giảm ho t động phức hệ hô hấp tăn sản xuất gốc ROS nguyên nhân dẫn đến tăn tr ởng khối u ống nghiệm (Arnold cs, 2013) Tóm l n tô sàn l x đ n đ ợc tần suất xuất biến đổi A4164G, A10398G C6340T G7853A t ơn ứng gen ND1, ND3, COX-1 COX-2 ty thể nhóm bện n ân UTĐTT n i Việt N m Đã đ n đ ợc mối liên quan biến đổi A4164G, A10398G, G7853A vớ đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT Đặc biệt x đ n đ ợc biến đổi A4164G A10398G G7853A l n qu n đến mứ độ xâm lấn khối u (gia đo n T) với tần suất cao đo n T1, hai biến đổ A4164G A10398G ó xu ớn đ k m vớ n u N vậy, với kết cho r ng biến đổi A4164G, A10398G, G7853A đón v trò tron đo n đầu xâm lấn khối u UTĐTT 3.2 ẤT Đ ẠN ỚN Ủ NT T V UNG T Ư ĐẠ TRỰ TR NG Mất đo n lớn ADN ty thể đặ b ệt đo n 4977 bp đ ợ x lo i bện n bệnh ty thể, chuyển ó un t tron đn ó l n qu n đến nhiều ó UTĐTT (http://www.mitomap.org; http://www MitoBreak; C en s 2011; D mbe s 2014; Lee s 2009) Đặc biệt, số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đo n có s khác chủng tộ n i khác (Dimbeg cs, 2014; Dimbeg cs, 2015) Do vậy, với nghiên cứu khảo sát tỷ lệ đ n l ợng mứ độ đo n lớn ADN ty thể, tập trung vào đo n 4977 bp đ ng th i tìm hiểu mối liên quan đo n vớ đặ đ ểm bệnh h c bện UTĐTT Việt Nam 3.2.1 Phát o n 4977 bp m t số o n lớn khác bệ tràng 3.2.1.1 X ịnh mấ â u t i trực o n 4977 bp Mất đo n 4977 bp ADN ty thể đ ợ x đ nh b ng phản ứng PCR sử dụng bốn cặp m i: Mt (Fmt Rmt), 4977-1 (4977-1F 4977-1R), 4977-2 (4977-2F 4977-2R) 10398 (10398F 10398R) (Dimberg cs, 2014) với khuôn ADN ty thể có ADN tổng số đ ợc tách chiết từ mẫu nghiên cứu Tron sản phẩm cặp m i Mt (433bp) để x đ nh s có mặt ADN ty thể ADN tổng số, sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-1 đ ợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp m i 4977-2 (PCR l ng), sản phẩm PCR từ cặp m i 4977-2 (381 bp) để x t ớc 246 bp từ m cặp m 10398 để x đ nh có đo n 4977 bp, sản phảm PCR kích đ nh ADN không b đo n 4977 bp Kết PCR từ đ ợc minh h a Hình 3.7 Hình 3.7 ện di sản phẩ R từ ặp t -2 103 (gel agarose %, nhu m EtBr) t số ẫu nghiên cứu Hình A: Giếng M: thang ADN chuẩn 250 bp Giế ối ch d n phẩm PCR c a cặp mồi Mt, 49779 đ ợ định gi i trình tự Giếng 2, 4, 6: s n phẩm PCR từ cặp Mt, 49779 ng mẫu nghiên c u Hình B: Giếng M: thang ADN chuẩn 50 bp, Giếng 1: s n phẩm PCR c a mồi Mt, giếng 2-5: S n phẩm PCR từ cặp mồi 4977-2, giế đối ch ng âm mt có băn s n Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm PCR từ cặp m đặc hiệu kí t đ n t eo đối chứn d ơn ( ếng 1, Hình 3.7A) đ ều ứng tỏ ADN tổng số có ADN ty thể Phần lớn mẫu nghiên cứu ó băn 381 bp ( ếng Hình 3.7A; giếng 2, 3, Hình 3.7B) N vậy, kết khẳn đ nh mẫu phân tích có ADN ty thể b đo n 4977 bp Thống kê kết sàng l c từ 86 ặp mẫu mô un t Bệnh viện K cung cấp, 67 mẫu m u đối chứn n tô x đ nh có 60 bệnh nhân có đo n đ ng th i mô u LCU Tỷ lệ đo n 4977 bp mô u 73/86 mẫu (84,9 ) o ơn so với mô LCU (61/86 mẫu), nhóm bện n ân o ơn so vớ n óm đối chứng (10/67 mẫu) (P0,05) (kiểm đ nh xác Fisher) Kết nà n i Việt ó n ữn đ ểm t ơn đ ng với kết nghiên cứu Chen cs (2011) Tuy nhiên, khác so với kết Chen cs (2011), không tìm thấy s khác biệt tỷ lệ đo n t eo độ tuổi Bên c n kết nghiên cứu r ng đo n 4977 bp đo n phổ biến bện UTĐTT n phù hợp so vớ i Việt N m N ỉ vậy, kết nà ôn bố tr ớc tính phổ biến lo đột biến nhiều lo un t vú (Dimbeg cs, 2015, un t n n n un t p ổi (Dai cs, 2006, UTĐTT (D mber s 2014; C en s 2011) Đặc biệt, tỷ lệ đo n 4977 bp bện n ân UTĐTT n t k i Việt N m o ơn so với lo i ung đ ợc công bố tr đâ (C en s 2011; Dimbeg cs, 2015; Dani cs, 2004) Tóm l i, đo n 4977 bp lo i đo n phổ biến, tỷ lệ cao mô un t n ân UTĐTT n ủ nhóm bệnh i Việt Nam t n tai d ng d tế bào chất Tỷ lệ đo n mô u t ốn k so vớ mô LCU (p0,05) (Kiểm đ nh Man-Whitney, Kruskal-Wallis) Kết nghiên cứu khác so với nghiên cứu Chen cs (2011), nhóm nghiên cứu mứ độ đo n giảm theo s tăn (C en s 211) n n l ủ đo n bệnh (P=0,031) bệnh UTĐTT n t ơn đ ng với kết nghiên cứu tr n đối t ợn un t (2008), mứ độ đo n k ôn l n qu n đến đặ đ ểm n ỉ r ng i Trung Quốc v Ye cs độ tuổi, mứ độ biệt ó đo n bệnh (Ye cs, 2008) 3.4 SỰ T Đ IS B N SAO ADN TY TH Ở B N N ÂN UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG S t đổ số s o ADN t t ể ó t ể làm tăn ảm n u mắc số lo un t l n qu n đến số đặ đ ểm bệnh h c củ un t (L n cs, 2011; Xing cs, 2008, Hu cs, 2016; Mi cs, 2015) Mặt khác, số l ợng ADN ty thể mứ độ đo n có mối liên quan với (Chen cs, 2011) Vì vậy, nghiên cứu này, song song vớ x đ nh mứ độ đo n lớn ADN ty thể, n tô n t ến àn đ n l ợng số ADN ty thể t ơn đối mẫu nghiên cứu b n p ơn p p re l-time PCR vớ ặp m ND1-2 HBB qu đ n mối liên quan s t đổi số ADN ty thể vớ đặ đ ểm bệnh h c củ UTĐTT T ơn t cách d n p ơn trìn đ ng chuẩn ND1 ND4 n tô d n đ ợ đ = -3,49x+35,82, hệ số t ơn qu n R =0,993, hiệu suất khuế thiên từ 0,4-1,2 Từ thông số củ đ số ADN ty thể đ t hiệu o đ i 93,08%, hệ số biến ng chuẩn cho thấ xâ d n đ ợ p ín x ng chuẩn HBB có ơn p p đ n l ợng ổn đ n để áp dụng cho việ đ n l ợng số ADN ty thể mẫu nghiên cứu D a vào giá tr chu kỳ n t ơn đố n tô x ỡn x đn đ n đ ợc qua phản ứng real-time PCR, công thức tính số ó 48/86 ( ếm 55 ) bện n ân UTĐTT ó số s o t ơn đối mô u t ấp ơn so với mô LCU, 38/86 (chiếm 44 ) bện n ân ó số s o ADN t t ể t ơn đối mô u o ơn so với mô LCU Giá tr trung v khoảng tứ phân v số s o ADN t t ể tr n mô u LCU t ơn ứng 858,37 (537,01-1333,04) 949,83 (622,43-1544,89) S khác biệt số t ơn đối giữ mô u mô LCU ó ý n ĩ t ống kê (P0,05) Để trả l i câu hỏi: (1) có mố t ơn qu n mứ độ đo n, số ADN ty thể mẫu mô máu ngo i vi bện n ân UTĐTT (2) ó mố t ơn qu n đo n k ôn (3) n u ữa số mứ độ mắ UTĐTT ó l n qu n với mứ độ đo n, số ADN ty thể hay không? cần phân tích mứ độ đo n, số ADN ty thể mẫu mô, mẫu máu bệnh n ân un t Tu n đ k mn n độ 103 n mẫu bệnh viện K cung cấp g m có mô u LCU, mẫu máu âu ỏi nêu đ ợc trả l Đ ợc s p đỡ củ b sĩ Bệnh viện Quân n tô t u t ập bổ sun đ ợc mẫu g m 40 cặp mẫu mô u, mô LCU 40 bệnh nhân UTĐTT Đặc biệt, mẫu máu ngo i vi t i hai th đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bệnh nhân đ ợc cung cấp kèm theo mẫu mô đ ều giúp cho việ đ n mố t ơn qu n so s n mứ độ đo n mẫu mô máu bệnh nhân Mặt khác kết hợp với kết p ân tí chứng x đn đ ợ n u mắ UTĐTT ó u ản tr n m u đối ởng mứ độ đo n, số ADN ty thể hay không 3.5 M TƯƠNG QU N V V UNG T Ư ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÒ ỦA MẤT Đ ẠN, S B N SAO VỚ NGU Ơ Mứ độ đo n lớn, số ADN ty thể mô u, LCU, mẫu m u đ ợc lấy t i hai th ẮC đ ểm tr ớc sau phẫu thuật 40 bện n ân UTĐTT Bệnh viện Quân đội 103 mẫu đối chứng đ ợc x đ nh b n p ơn p p re l-time PCR Đối với mẫu đối chứng, mứ độ đo n đ ợ x 17 mẫu (là mẫu đ ợ x đ nh có đo n b n p đ nh ơn p p PCR l ng), số s o đ ợc xác đ nh 67 mẫu Kết cho thấy, mứ độ đo n máu bện n ân UTĐTT o ơn m u đối chứng (P0,05) Đối với số ADN ty thể, có s khác biệt so sánh mô máu bện n ân un t mô un t ữa máu bện n ân un t o ơn so vớ m u un t m u đối chứng (P
Ngày đăng: 26/10/2017, 09:28
Xem thêm: NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG TT , NGHIÊN cứu BIẾN đổi của một số GEN TY THỂ ở BỆNH UNG THƯ đại TRỰC TRÀNG TT