Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y Dược THÁI BÌNH LÊ QUỐC PHONG NGHIÊN CỬU DỊCH TẺ HỌC PHÂN TỦ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TIẾT ß-LACTAMASES PHÓ RỘNG KHÁNG KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ THỤ C PHẨM TẠI NHA TRANG NĂM 2013-2014 Chuyên ngành: Y TẾ CÔNG CỘNG Mã số: 60 72 03 01 LUẬN VĂN THẠC SỸ Huóng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM NGỌC KHÁI GS.TS YAMASAK1 SHINJI THÁI BÌNH, 2014 Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu ricng Các số liệu, kết nêu Luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Học viên thực luận văn Lê Quốc Phong Trong suốt trình thực đề tài hoàn thành luận văn, nhận giúp đỡ nhiều cá nhân tổ chức Nhân dịp xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Y tế công cộng, Phòng Quán lý đào tạo sau đại học - Trường Đại học Y Dược Thái Bình tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, triến khai đề tài nghiên cứu hoàn thành luận văn thạc sỹ Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Viện Pasteur Nha Trang Trường Đại học Phủ Osaka - Nhật Bản tạo điều kiện cho sử dụng trang thiết bị máy móc phục vụ cho nghiên cứu Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Ngọc Khái GS.TS Yamasaki Shinji trực tiếp định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thực giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi biết ơn gia đình, bạn bè đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ suốt trình học tập Thái Bình, ngày 20 tháng 10 năm 2014 Tác giả Lê Quốc Phong DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẢT 32 : Phốt phóng xạ 32p p ADN : Deoxyribo Nucleic Acid AM : Kháng sinh ampicillin ARN : Ribonucleic Acid ATVSTP : An toàn vệ sinh thực phẩm BLAST : Basic Local Alignment Search Tool C : Kháng sinh cloramphenicol CAZ : Kháng sinh ceftazidime CAZ-C : Kháng sinh ceftazidime + clavulanic acid CFU : Đơn vị hình thành khuấn lạc (Colony forming unit) CIP : Kháng sinh ciprofloxacin CLSI : Clinical and Laboratory Standards CTX Institute : Kháng sinh cefotaxime CTX-C : Kháng sinh cefotaxime + clavulanic acid CTX-M : Enzyme P-lactamase họ CTX-M DAEC : E coìi gây kết dính lan toả (Diffuse-adherence E coli) DEC : Diaưheagenic Escherichia coỉi (E dNTP : Deoxynucleotide E coli : Escherichia coll coìi gây tiêu chảy) EAEC : E coll bám dính kết tập đường ruột (enteroaggregative E colĩ) EAST1 : Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin EHEC : E coli gây xuất huyết đường ruột (enterohaemorrhagic E coli) EIEC : E coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive E colỉ) EPEC : E coli gây bệnh lý đường ruột (enteropathogenic E coìi) ESBL : enzyme (3-lactamase phổ rộng (Extended-spectrum p-lactamase) ETEC : E coli sinh độc tố ruột (enterotoxigenic E coli) FOS : Kháng sinh fosfomycin FOX : Kháng sinh cefocitin GM : Kháng sinh gentamicin ISO : International Organization for Standardization JICA : Cơ quan Họp tác Quốc tế Nhật Bàn (The Japan Intenational Cooperation Agency ) K : Kháng sinh kanamycin LT : Heat-labile enterotoxin mARN : ARN thông tin MEM : Kháng sinh meropenem MH : Môi trường Muller Hinton NA : Kháng sinh nalidixic acid NDM-1 : New Delhi metallo-beta-lactamase OPU : Đại học Phú Osaka - Nhật Bản (Osaka Prefecture University) PCR : Polymerase chain reaction RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction S : Kháng sinh streptomycin SHV : Enzyme ß-lactamase họ SHV ST : Heat-stable enterotoxin STEC : Nhóm vi khuan E coli sản xuất độc to Shiga toxin SXT TBX : Kháng sinh sulfamethoxazole-trimethoprim : Môi trường tryptone-mật-glucuronid TE : Kháng sinh tetracycline TEM : Enzyme ß-lactamase họ TEM WHO : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) Il l MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỤC CÁC BIÉU ĐÒ Biểu đồ 3.1: Phân bố đặc điểm nguồn gốc thịt lợn (a), thịt gà (b) tôm nuôi Biếu đồ 3.11 Tý lệ lưu hành gen mã hóa ESBL theo thời gian chủng E coli phân lập từ thực phẩm Nha Trang 50 Biểu đồ 3.12 Phân bố gen thị (genetic marker) để xác định đặc điểm phân nhóm phát sinh loài (phylogenetic group) vi khuấn E coli ĐẶT VẤN ĐÈ Các yếu tố nguy từ thực phẩm bệnh lây truyền qua thực phấm vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu Phần lớn bệnh tật người bệnh động vật thực phấm có nguồn gốc động vật nguồn có nguy gây bệnh dày - ruột, vi sinh vật đóng vai trò số này, Escherichia coli một tác nhân gây bệnh phổ biến người vật nuôi [2],[54], Nhiễm trùng E coli ânh hưởng đến hàng trăm nghìn người mồi năm Châu Âu nước khác Chúng không chì gây số bệnh lý thông thường nhiễm trùng đường tiết niệu, mà gây ncn bệnh lý nguy hicm nhiễm trùng máu Nghiêm trọng vi khuấn ngày gia tăng khả đề kháng với nhiều loại kháng sinh Một nghiên cứu Anh cho thấy vi khuẩn E coỉi kháng kháng sinh người có 50% lây truyền từ thực phẩm có nguồn gốc động vật trớ nên mối nguy lớn với sức khoé cộng đồng toàn giới [7], [38], Mặt khác, vi khuẩn E coli sinh enzyme beta-lactamase phố rộng (ESBL) phát sản phấm thịt động vật nhận định có liên quan với việc sử dụng rộng rãi kháng sinh cephalosporin chăn nuôi [9], [36] E coỉỉ mang enzyme kháng lại hầu hết kháng sinh p-lactams, ngoại trừ cephamycins carbapenems [4], [67], Thêm vào đó, có nhiều chủng vi khuấn E coli mang kiểu gcn đa kháng kháng sinh gen lan truyền từ thể hệ vi khuẩn sang hệ vi khuẩn khác [58] Nguy hiểm hơn, vi khuẩn E coli truyền gen kháng kháng sinh cho sang loài vi khuẩn gây bệnh khác Salmonella, shigella [67], làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh quần thể gây khó khăn điều trị lâm sàng, chí dùng kháng sinh hệ cho có tác dụng tốt Con người mang vi khuấn E coỉi sinh ESBL mắc lây truyền từ người sang người khác, chọn lọc qua việc dùng kháng sinh mắc thông qua chuỗi thực phẩm không an toàn [61] Hiện nước ta, nghiên círu có liên quan đến kháng thuốc cúa vi khuấn Escherichia coli bệnh phấm nhiều tác giá thông báo Tuy nhiên, có nghiên cứu đề kháng kháng sinh vi khuấn có nguồn gốc từ thực phẩm nói chung vi khuẩn E coli nói riêng [38] đặc biệt thông tin dịch tễ học phân tử lưu hành gen kháng kháng sinh, gen độc lực chưa thông báo Do đó, cần thiết có nhũng nghiên cứu từ thực phẩm Nha Trang nói riêng Việt Nam nói chung nhằm phân lập vi khuấn Escherichia coỉi từ thực phấm, đánh giá trạng kháng kháng sinh tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học phân tử chúng, góp phần đưa tranh tổng thể dịch tề học mức độ phân tử bao gồm phân bố biếu gen kháng thuốc, lưu hành gen độc lực, cung cấp thông tin sở cho việc thiết lập hệ thống giám sát vi khuẩn kháng kháng sinh Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu dịch tễ học phân tử vi khuẩn Escherichia coli tiết Ịilactamases rộng kháng kháng sinh phân lập từ thực phẩm Nha Trang năm 2013-2014” với mục tiêu sau: Mô tả thực trạng nhiễm đề kháng kháng sinh vi khuấn Escherichia coll tiết P-lactamasc phố rộng (ESBL) thực phẩm (thịt lợn, thịt gà, tôm nuôi) Nha Trang năm 2013-2014 Xác định đặc điểm dịch tễ học phân từ kiểu phân nhóm, kiếu gen khả biểu số gen mã hóa ESBL chủng Escherichia coli tiết p-lactamase phổ rộng Chuong TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các nghiên cún liên quan đến tình hình nhiễm đề kháng kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli sinh p-lactamase phổ rộng thực phấm 1.1.1 Tình hình nhiễm E coli ESBL thực phẩm Escherichia coli Theodor Escherich (1857-1911), nhà vi khuân học người Áo, phát lần vào năm 1885 E coìi thành viên thuộc hệ vi khuấn bình thường đường tiêu hóa, chiếm ti lộ cao số vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Tuy nhiên, số loại E coli sản xuất ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin), hemolysin, enzym phân hủy số kháng sinh (p-lactamase), nên E coli vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu tác nhân gây tiêu chảy (ETEC - Enterotoxigenic E colí), vicm đường tiết niệu (UPEC - Uropathogenic E coìi), viêm đường mật; đứng hàng đàu nguyên gây nhiễm khuẩn huyết, viêm phối trẻ sơ sinh [8], 10 Việc E coli sán sinh enzyme p-lactamase phổ rộng (ESBL) đồng nghĩa với việc vi khuẩn kháng lại với kháng sinh mạnh đặc biệt kháng sinh nhóm beta-lactam từ hệ đến hệ 3, loại kháng sinh mà người ta kỳ vọng thời gian dài có khả diệt chủng vi khuấn gram (-) Ngoài ra, plasmid mang gen ESBL mang kèm gen kháng kháng sinh khác, tạo nên đồng kháng, vi khuấn có ESBL không kháng với beta-lactam mà kháng với nhiều kháng sinh thuộc nhóm khác tetracyclin, fluoquinolon, chloramphenicol sulfamethoxazoltrimethoprim [33] tình hình phân bố E coỉi tiết p-lactamase, nghiên cứu năm 2003 toàn giới thấy rằng: Mỹ tỉ lệ sinh ESBL vi khuẩn E coli 7%, châu Á -Thái Bình Dương, tỉ lệ nhiễm E coli ESBL trung binh 18% Trong đó, Trung Ọuốc Việt Nam quốc gia có tý lệ lưu hành E coli ESBL lâm sàng tưong đối cao, lên đến 50%; quốc gia khác có tỷ lệ E coìi sinh ESBL từ 25%-50% Thái Lan, Singapore, Indonesia A-Rập Saudi; Các nước có tỷ lệ E coỉi sinh ESBL thấp mức 5-10% Nhật Bản, Đài Loan Hàn Quốc [41 ] Trong thực phẩm, nghiên cứu E coli tiết P-lactamase phổ rộng triển khai nhiều nơi, nhiều đối tượng thực phấm khác nhau, tập trung chủ yếu đối tượng thực phấm tươi sốne thịt sản phẩm từ thịt Cụ thể sau: Tại Pháp, theo nghiên cứu Girlich cộng (2007), từ tháng đến tháng 11 năm 2005 có 32/112 mẫu thịt gà nhiễm vi khuấn E coli kháng với kháng sinh ceftazidime cefotaxime [35] Tại Anh, nghiên cứu vào năm 2006 phát số chúng vi khuẩn E coli ESBL mẫu thịt gà nuôi Anh Nghiên cứu cho thấy 9/27 mầu thịt gà nhập khấu 7/40 mẫu thịt gà không rỗ nguồn gốc nhiễm E coli ESBL Các mẫu thịt gà nhập từ Brazil thường xuyên phát có E coli ESBL đặc biệt chủng mang plasmid chứa gen CTX-M E coli mang plasmid phố biền Brazil lại gặp Anh Phân tích gia cầm nhập từ Nam Mỹ vào Anh cho thấy 62/210 nhiễm E coli ESBL [34], Tại Hà Lan, nghiên cứu Overdevest I (2011) mẫu thực phẩm sống có nguồn gốc từ động vật bán lè thị trường nhiễm cho thấy có đến 71/89 (79,8%) mầu thịt gà nhiễm E coli ESBL, 1/57 (1,8%) thịt lợn, thịt bò 4/85 (1,8%) Trong nghiên cứu tác giả đồng thời phân tích mẫu phân người điều trị nhiễm khuấn Bệnh viện gần khu vực thu mẫu thịt gà cho thấy chủng E coli từ phân lập từ thịt gà bệnh nhân có quan hệ di truyền giống [58], Trong nghiên cứu gần Geser N cs (2012) cho thấy tỷ lệ nhiễm E coli tiết ß-lactamase phố rộng Hà Lan trong thịt gà 77% , thịt bò 5%, thịt lợn 2% [34] Tại Đan Mạch, nghiên cứu tiến hành kiểm tra thịt lợn, thịt bò thịt gà nhập khấu cho thấy thịt gà có tỷ lệ nhiễm E coli ESBL cao sản phẩm thịt nhập khâu (chiếm 36%) đó, tý lệ nhiễm E coli ESBL thịt lợn thịt bò mức 1,2% Hầu hết gà nhập khấu vào Đan Mạch có nguồn gốc từ Đức Pháp có tới 34% gà Đức 43% gà từ Pháp dương tính với E coli ESBL Trong đó, gà nội địa Đan Mạch tỷ lệ nhiễm vi khuấn E coli ESBL tương đối thấp 3,3% điều phản ánh mức độ sử dụng kháng sinh nông nghiệp Đan Mạch thấp nhiều so với Pháp Đức [12] Tại Tây Ban Nha, nghiên cứu cúa tác giả Doi Y (2010) cho thấy thịt bán lẻ thị trường phát có vi khuẩn E coli ESBL với 67% (8/12) mẫu thịt gà, 58% (7/12) mẫu gà tây, 25% (3/12) thịt lợn 8% (1/12) thịt bò [28], Tại Hà Lan, tác giả Stuart cs (2012) nghiên cứu 98 mầu thịt gà thông báo có 84% nhiễm E coli tiết ß-lactamase phố rộng [62], Tại Nhật Bàn, nghiên cứu tác giả Hiroi cs (2012), cho thấy tý lệ mang vi khuẩn E coli ESBL gà song 60% Nghiên cứu ràng có liên quan mật thiết gen kháng kháng sinh E coìi từ thịt gà E coli phân lập từ bệnh nhân [43], Tại Thổ Nhĩ Kỳ, nghiên cứu Gundogan N Avci E (2013) 75 mẫu thực phấm gồm thịt bc, thịt gà, sữa tươi phô mai cho thấy tý lệ nhiễm E coỉi 80% (60/75 mẫu dương tính), số có 20/45 chúng E coli mang kiểu hình ESBL, chiếm tỷ lệ 44,4% , đó, thịt gà có tỷ lệ nhiễm E coli ESBL cao [36], Tại Việt Nam, phần lớn nghiên cứu có liên quan đến vi khuấn E coli ESBL tập trung đối tượng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Chẳng hạn như, nghiên cứu tác giả Mai Văn Tuấn thực từ tháng 10 - 12/2006 bệnh viện Trung ương Huế cho thấy ti lệ sinh ESBL 30,4% (65/214 chủng) [21] Tác giả Hoàng Thị Phương Dung thực nghiên cứu từ - 12/2008 bệnh viện Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh cho thấy tỉ lệ sinh ESBL E coỉi 71,2% Cho đến nay, có nghiên cứu Việt Nam E coti sinh ESBL có nguồn gốc thực phẩm Tác giả Van Thi Thu Hao (2007) nghiên Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in FoodProducing Animals", J Vet Med Sci., 74(2), pp 189-195 44 IS07218:207 Microbiology of food and animat feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations 45 ISO 16649-2:2001 Microbiology> of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of betaglucuronidase-positive Escherichia coli - Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide 46 Jain S., Chen L., Dechet A., Hertz A T., Brus D L., Hanley K., Wilson B., Frank J., Greene K D., Parsons M., Bopp C A., Todd R., Hoekstra ML, Mintz E D., Ram R K (2008), "An Outbreak of Enterotoxigenic Escherichia coli: Associated with Sushi Restaurants in Nevada, 2004", Clinical Infectious Diseases, 47, pp 1-7 47 Johnson J R„ Kuskowski M A., O’Bryan T T., Colodner R.„ Raz R (2005), "Virulence Genotype and Phylogenetic Origin in Relation to Antibiotic Resistance Profile among Escherichia co/ZUrinc Sample Isolates from Israeli Women with Acute Uncomplicated Cystitis", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49(1), pp 26-31 48 Johnson J R., Kuskowski M A., Smith K., O'Bryan T T., Tatini S (2005), "Antimicrobial-Resistant and Extraintcstinal Pathogenic Escherichia coli in Retail Foods", JID, 191, pp 1040-1049 49 Kalantar E„ Alikhani M Y„ Naseri M H„ Torabi V (2013), "Antibiotic resistance patterns of STEC and ETEC strains: A study on frozen foods of animal origin and children with acute diarrhea", J Microbiol Infect Dis, 3( 1), pp 31 -35 Kobayashi H., Khai L T L„ Phan T T„ Yamasaki S (2003), "Prevalence of Pathogenic Escherichia coli in a Swine Breeding Environment in Can Tho Province, Vietnam", JARQ, 37(1), pp 59-63 51 Kojima A., Ishii Y., Ishihara K„ Esaki T., Oda C., Tamura Y., Takahashi T., Yamaguchi K (2005), "Extended-Spectrum-i Lactamase-Producing Escherichia coli Strains Isolated from Fann Animals from 1999 to 2002: Report from the Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring Program", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, pp 3533-3537 52 Moseley S., Hug I., Alim A R M A., So M., Motalcbi M S., Falkow S (1980), "Medical Microbiology: Detection of Enterotoxigenic Escherichia coli by DNA Colony Hybridization", The Journal of Infectious Diseases, 142(6), pp 892-898 53 Nataro J P., Kaper J B (1998), "Diarrhcagcnic Escherichia coli", Clinical Microbiology> Reviews, 11 (1), pp 142-201 54 Newell D G., Koopmans M., Verhoef L., Duizer E., Kane A A., Sprang H., Opsteeghb M., Langelaar M., Threfall J., Scheutz F., Giessen J., Kruse H (2010), "Food-borne diseases—The challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge", International Journal of Food Microbiology, 139, pp S3—S15 55 Nijssen S., A Florijn, M J M Bonten, et al (2004), "Beta-lactam susceptibilities and prevalence of ESBL-producing isolates among more than 5000 European Enterobacteriaceae isolates", International Journal of Antimicrobial Agents 24, pp 585-591 56 Olsvik O., Wasteso Y., Lund A., Homes E (1991), "Pathogenic Escherichia coli found in food", Int J Food Microbiol, 12(1), pp 103- 113 57 Osek J (2003), "dentification of the astA gene in enterotoxigenic Escherichia coli strains responsible for diarrhea in pigs", Bull Vet Inst Pulawy, 47, pp 9-15 Overdevest I., Willcmscn 1., Rijnsburgcr M., Eustace A, Xu L., Hawkey P., Heck M., Savelkoul P., Grauls C V., Zwaluw K., Huijsdens, Kluytmans J (2011), "Extended-Spectrum (3-Lactamase Genes of Escherichia coli'm Chicken Meat and Humans, the Netherlands", Emerging Infectious Diseases, 17(7), pp 12161222 58 Paterson D L., Bonomo R A (2005), "Extended-SpectrumLactamases: a Clinical Update", Clinical Microbiology Reviews, 18(4), pp 657-686 59 Samadpour M„ Barbour M W., Nguyen T., Cao T M., Buck F., Dcpavia G A., Mazcngia E., Yang P., Alfi D., Lopes M., Stopforth S D (2006), "Incidence of enterohemorrhagic Escherichia coli, Escherichia coli 0157, Salmonella, and Listeria monocytogenes in retail fresh ground beef, sprouts, and mushrooms", J Food Prot, 69(2), pp 441-443 60 Slama K B., Jouini A., Sallem R B., Somalo S., Sâenz Y., Estepa V., Boudabous A., Torres C (2010), "Prevalence of broad-spectrum cephalosporin-resistant Escherichia coli isolates in food samples in Tunisia, and characterization of intégrons and antimicrobial resistance mechanisms implicated", International Journal of Food Microbiology/, 137, pp 281-286 61 Stuart J C., Munckhof T., Voets G., Scharringa J., Hall M L V (2012), "Comparison of ESBL contamination in organic and conventional retail chicken meat", International Journal of Food Microbiology, 154, pp 212-214 62 Tadesse D A., Zhao S., Tong E„ Ayers S., Singh A., Bartholomew M J., McDermott P F (2012), "Antimicrobial Drug Resistance in Escherichia co/zffom Humans and Food Animals, United States, 1950— 2002", Emerging Infectious Diseases, 18(5), pp 741 -749 63 Tcophilo G N D., Vieira R H S F., Rodrigues D P., Mcnezes F G R (2002), "Escherichia eo/zisolated from seafood: toxicity and plasmid profiles", Int Microbiol (2002) 5: 11-14, 5, pp 11-14 64 Teuber M (1999), "Spread of antibiotic resistance with food-borne pathogens", CMLS Cell.Mol.Lifte Sci, 56, pp 755-763 65 Vieira M A M., Gomes T A T., Ferreira A J P., Knobl T., Moal V L (2010), "Two Atypical Enteropathogenic Escherichia coli Strains Induce the Production of Secreted and Membrane-Bound Mucins To Benefit Their Own Growth at the Apical Surface of Human Mucin Secreting Intestinal HT29-MTX Cells ", Infection and Immunity, 78(3), pp 927-938 66 World Health Organization (2014), Antimicrobial Resistance: Global Report on Surveillance, Printed in France http://en.wikipedia.org/wiki/Pathogenic_Escherich ia_coli#cite_note- Todar-11, "Pathogenic Escherichia coli" Phụ lục PHIÉU THU MẪU VÀ PHONG VÁN NGƯỜI BÁN HÀNG Mã mẫu: .(VS1 -VS350) Hl.Loại mẫu (khoanh tròn): Thịt lợn Thịt gà Tôm nuôi H2 Ngày thu mẫu: / /201 H3 Tên ngưòi bán (thịt lợn/thịt gà/tôm nuôi): H4 Địa ngưòi bán (thịt lợn/thịt gà/tôm nuôi): H5 Nguồn gốc thịt lợn/thịt gà/tôm nuôi / Người bán mua lại từ lò mổ (đối với thịt lợn) từ đầu mổi/đợi lý trung gian (đối gà tôm): (a) Ghi rõ tên, địa lò mổ lợn; đầu mối/đại lý trung gian buôn bán gà/tôm: (b) Thông tin nguồn gốc xuất xứ thịt lợn/thịt gà/tôm bán Không biết Tp Nha Trang-Khánh Hòa Huyện Dicn Khánh-Khánh Hòa Huyện Ninh Hòa-Khánh Hòa Huyện Khánh Sơn-Khánh Hòa Huyện Cam Lâm-Khánh Hòa Cam Ranh-Khánh Hòa Khác (ghi rõ): Người bán (thịt lợn/thịt gà/tỏm nuôi) mua trực tiếp từ trại nuôi lợn/trại nuôi gà/các đìa nuôi tôm Ghi rỗ mua từ đâu, địa chỉ: Phụ lục NGƯỜI PHÓNG VẤN PH1ÉU THU THẬP DŨ LIỆU Phần 1: THÔNG TIN CHUNG Mã số mẫu: (VS1-VS350) Hl.Loại mẫu: Thịt lợn Thịt gà Tôm nuôi Phần KÉT QUẢ PHÂN TÍCH c Phàn lập vi khuẩn E coli Âm tính (kết thúc nhập liệu) Dương tính Cl.l Ncu dương tính số lượng bao nhiêu: CFU/g C2 Xác định vi khuẩn E coli có kiểu hình ESBL E coli âm tính ESBL (kết thúc nhập liệu) E coli dương tính ESBL C3 Kết kháng sinh đồ chủng E coli ESBL (đường kính vòng vô khuấn - mm) C4 Kiểu hình đề kháng kháng sinh: C5 Số kháng sinh đề kháng (0-14): C6 Kiểu gen mà hóa ESBL (nhiều lựa chọn) blacTX-M-l group blaCTX-M-2 group blacTX-M-8 group blacTX-M-9 group blaTEM group blaSHV group Không thuộc nhóm gien C7 Khá biếu gcn mã hóa ESBL (nhiều lựa chọn) bla TX-M-2 group blacTX-M-1 group C blacTX-M-8 group blacTX-M-9 group blaTEM group blasHV aroup Không biểu C8 Gien chi thị phân nhóm phát sinh chủng loại (phylogenetic group) chuA yjaA TspE4.C2 Âm tính với gien C9 Đặc điểm phân nhóm phát: sinh chủng loại (phylogenetic group) A BI B2 D CIO Đặc điểm nhóm phát : sinh chủng loại (phylogenetic subgroup) AO AI BI B22 B23 DI D2 Loại Cl gien elt EAF độc lực lưu hành est eaeA stxl Stx2 bfpA invE eagg 10 astA 11 Daac 12 Âm tính với gicn C12 Thuộc nhóm E coli gây tiêu chảy (ETEC, EPEC, EHEC ): C13 Týp huyết lưu hành (nếu mang gien độc lực): Hoạt động điều tra thu mẫu chợ Đầm - Nha Trang - Khánh Hòa Phân tích mẫu PTN Vi sinh thực phấm - Viện Pasteur Nha Trang (a) Trường Osaka Prefecture University- Nhật Bản (b) Gặp gỡ, trao đối nội dung nghiên cứu với với GS Yamasaki Shinji số học viên Trường Osaka Prefecture University (a); thảo luận kết nghiên cứu với GS Yamasaki Shinji học viên (b) Hình Vi khuẩn E coli mọc khuấn lạc màu xanh trcn môi trường TBX (a) dạng kiểu hình ESBL vi khuẩn E coli: ESBL âm tính (b); ESBL dương tính với cặp đĩa (c) ESBL dương tính vói cặp đĩa (d) Hình Kháng sinh đồ số chủng E coli ESBL phân lập từ tôm nuôi (a), thịt lọn (b) thịt gà (c) M NC g| 7dP* 60Q 400 300— 200_ LOObp 45 PC 10 11 12 13 14 15 16 M _ctx-m-1 / r-ctx-m-Ợ ị TEM r _ ——Ị SHV - ctx-m-8/25 wm '*mr — ~ ** - - ctx-m-2 Hình Kết điện di sản phấm PCR phát gen mã hóa ESBL Đường chạy 1,7: dương tính blacTx-M-9; Đường chạy 2,4, 5, 6, 8,9, 10, 11, 14, 15: dương tính blacTx-M -1 blaiEM; Đường chạy 3: dương tính blacTx-M-ú Đường chạy 16: dương tính blarrx-M-9 bỉaiEMỈ Đường chạy 17: dương tính blan;M blaSHvt Đường chạy 25: dương tính blacrx-M-9, blaTl;M blaSHv; M: thang ADN chuẩn 100 bp; PC: chứng dương; NC: chứng âm; bp: base pair (cặp bazơ nitơ) EC137 Sbjct GGCGCTCTGCGTTCTGTTGCGGCTGGGTAAAATAGGTCACCAGAACCAGCGGCGCACGAC 62 I I ! I I I I II ì ì I I I I I r I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 2119 CCTGCGGCCAGATCACCGCAATATCATTGGTGGTGCCGTAGTCGCCGCTGCCGGTCTT AT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I CCTGCGGCCAGATCACCGCAATATCATTGGTGGTGCCGTAGTCGCCGCTGCCGGTCTT ÃT GGCGCTCTGCGTTCTGTTGCGGCTGGGTAAAATAGGTCACCAGAACCAGCGGCGCACGAC 2060 EC137 Sbjct 2059 EC137 123 CACCCACAGTCCACGACGTCGGTAAGCCGGCCCGAÃTGCTGGCTGCGCCGGTCGTATTGC 182 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII sbjct 1999 CACCCACAGTCCACGACGTCGGTAAGCCGGCCCGAATGCTGGCTGCGCCGGTCGTATTGC 1940 EC137 183 CTTTGAGCCACGTCACCAACTGCGCCCGCTGGGTTTCGCCCAGCGCATGACCCAGCGTAA 242 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII sbjct 1939 CTTTGAGCCACGTCACCAACTGCGCCCGCTGGGTTTCGCCCAGCGCATGACCCAGCGTAA 1880 EC137 243 GCTGACGCAACGTCTGCGCCATCGCCCGCGGCGTGGTGGTGTCTCTCGGGTCGCCGGGAA 302 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct 1879 GCTGACGCAACGTCTGCGCCATCGCCCGCGGCGTGGTGGTGTCTCTCGGGTCGCCGGGAA 1820 EC137 303 TGGCGGTATTCAGCGTAGGTTCAGTGCGATCCAGACGAAACGTCTCATCGCCGATCGCGC 362 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct 1819 TGGCGGTATTCAGCGTAGGTTCAGTGCGATCCAGACGAAACGTCTCATCGCCGATCGCGC 1760 EC137 363 GGGCAAAAGCCGTCACGCCTCCCGGGCCACCGAGCTGGGCAATCAATTTGTTCATGGCGG 422 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II 11 I I I sbjct 1759 GGGCAAAAGCCGTCACGCCTCCCGGGCCACCGAGCTGGGCAATCAATTTGTTCATGGCGG 1700 EC137 423 TATTGTCGCTGTACTGCAACGCGGCCGCGCTCAGTTCTGCCAGCGTCATTGTGCCGTTGA 482 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII sbjct 1699 TATTGTCGCTGTACTGCAÃCGCGGCCGCGCTCAGTTCTGCCAGCGTCATTGTGCCGTTGA 1640 EC137 483 CGTGTTTTTCGGCAATCGGATTGTAGTTAACCAGATCGGCAGGCTTGATCTCGACAGGCT 542 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct 1639 CGTGTTTTTCGGCAATCGGATTGTAGTTAACCAGATCGGCAGGCTTGATCTCGACAGGCT 1580 EC137 543 GATTAAGCAGCTGCTTTTGCGTTTCACTCTGCTTAAGCACCGCCGCGACCGCCATAACTT 602 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjot 1579 GATTAAGCAGCTGCTTTTGCGTTTCACTCTGCTTAAGCACCGCCGCGACCGCCATAACTT 1520 EC137 603 TACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATCACCGCGATAAAGCACCTGCGTATTATCTG 662 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct 1519 TACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATCACCGCGATAAAGCACCTGCGTATTATCTG 1460 EC137 663 CGGTATCGATGAGCGCGACGCCCAGCCGCCCTCCGCTGCTTTTCTCCAGCGCCGCCAGCT 722 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII Sbjct 1459 CGGTATCGATGAGCGCGACGCCCAGCCGCCCTCCGCTGCTTTTCTCCAGCGCCGCCAGCT 1400 EC137 723 TTTGCTGCACCGCACTCGTCTGCGCATAÃAGCGGCGCGCTGCCCAGCAGCAGCGGAATGC 782 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII sbjct 1399 TTTGCTGCACCGCACTCGTCTGCGCATAAAGCGGCGCGCTGCCCAGCAGCAGCGGAATGC 1340 EC137 783 ACGCCGCCGCCGCGAACATCATCCGTTGCACTCTCTTTG 821 IIIII1IIIIIII1IIIII1IIIIIIị1II1IIIII1Ị1 Sbjct 1339 ACGCCGCCGCCGCGAACATCATCCGTTGCACTCTCTTTG 1301 Hình Kết so sánh trình tự gen blacTx-M chủng E coli 0128ab:H21 (EC137) phân lập từ thịt M NC PC 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M lợn Nha Trang với trình tự gen blacTx-M-24 (IDĩ JQỌ03804.1) Genbaiik (Sbjct: trình tự Genbank; EC137 - trình tự cần so sánh) Hình Ket điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát mARiN gen CTX-M-1, CTX-M-9, TEM SHV Ghi chú: Đirờng chạy 10, 12, 20, 22, 23: biếu CTX-M-9; Đường chạy 1, 4, 8, 9, 11, 14, 15, 19: biểu CTX-M-1 TEM; Đường chạy 5, 13, 16, 18, 21: biểu CTX-M-1; Dường chạy 2, 3, 6, 7: biểu CTX-M-9 TEM; M: thang chuẩn lOObp, NC: chứng âm, PC: chứng dương Hình Ket quă điện di sản phấm PCR xác định phylogenetic group chủng vi khuẩn E coli ESBL Đường chạy 1,2, 8, 10, 24: group D; Đường chạy 3, 4, 5,6, 7, 9, 11, 12, 14, 16, 25: group B1 Đường chạy 13, 15,17, 18, 19,20,23, 26: group A; Đường chạy 21,22: group B2 M: thang ADN chuẩn 100 bp; NC: chứng âm; bp: base pair (cặp bazơ nitơ) PC: chứng dương (PC 1: group B2; PC2: group D; PC3: group A; PC4: group B1) 1-36 00437-72 Oĩ/A 73-106 đ3lA 107-142 (ao PQ 37 38 39 40 41 73 74 75 76 77 •