ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ VUI NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TỪ VI KHUẨN Clostridiumsp ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ DÀY BÒ BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN TỐI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội –2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ VUI NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TỪ VI KHUẨN Clostridiumsp ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ DÀY BÒ BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN TỐI Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn kết cố gắng nỗ lực thân suốt trình học tập nghiên cứu Bên cạnh đó, không kể đến hỗ trợ hướng dẫn nhiều cá nhân tập thể giúp hoàn thành công trình nghiên cứu Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, người trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ hướng dẫn tận tình suốt trình thực đề tài Cô động viên khích lệ bảo cho kiến thức, lời khuyên, kinh nghiệm quý báu học tập nghiên cứu.Nhờ vậy, hoàn thành luận văn cách tốt Với lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất Thầy Cô cán bộ, thành viên Bộ môn Vi sinh vật học, Phòng sinh học Nano ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học- ĐHQGHN, Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Ngoài ra, xin chân thành cảm ơn ủng hộ giúp đỡ anh, chị, em sinh viên bạn bè phòng thí nghiệm Hóa sinh Vi sinh môi trường 105T2 suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người thân yêu động viên giúp đỡ mặt vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2017, Học viên Hoàng Thị Vui MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Hiện trạng nguồn lƣợng giới 1.2 Một số nguồn lƣợng thay cho nhiên liệu hóa thạch 1.2.1 Năng lượng từ hệ thống pin nhiên liệu 1.2.2 Nguồn lượng mặt trời 1.2.3 Nguồn lượng gió 1.2.4 Năng lượng từ thủy triều 1.2.5 Thủy điện 1.2.6 Một số nhiên liệu sinh học 1.3 Ứng dụng thực tiễn nhiên liệu hydro 1.4 Một số phƣơng pháp sản xuất hydro 1.5 Phƣơng pháp lên men tối sản xuất hydro 11 1.6 Khả sinh hydro loài Clostridium 13 1.6.1 Tổng quan loài Clostridium sp 13 1.6.2 Khả sinh hydro số loài Clostridium sp 15 1.7 Thách thức triển vọng phƣơng pháp lên men tối 18 1.7.1 Thách thức 18 1.7.2 Triển vọng 18 1.8 Đặc điểm hệ vi sinh vật cỏ 18 1.8.1 Vi khuẩn (Bacteria) 19 1.8.2 Động vật nguyên sinh (Protozoa) 20 1.8.3 Nấm (Fungi) 21 1.9 Một số nguồn chất thuộc hệ 21 1.9.1 Bột bã sắn 21 1.9.2 Bỗng rượu 22 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 Nguyên liệu thiết bị 25 2.1.1 Nguyên liệu 25 2.1.2 Thiết bị 25 2.1.3 Dụng cụ 26 2.2 Môi trƣờng 26 2.2.1 Môi trường PY (1000mL) 26 2.2.2 Môi trường PYA 27 2.2.3 Môi trường PYG (1000 mL) 27 2.2.4 Môi trường với nguồn chất bột bã sắn 28 2.2.5 Môi trường với nguồn chất rượu 29 2.2.6 Các môi trường khác 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy 32 2.3.2 Định danh vi khuẩn theo khóa định loại Bergey 34 2.3.3 Định danh chủng sinh khí hydro dựa vào giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 34 2.3.4 Xác định hoạt tính enzyme chủng Clostridium sp 36 2.4 Các phƣơng pháp phân tích 37 2.4.1 Xác định tổng khí biogas sinh 37 2.4.2 Xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS 38 2.4.3 Định lượng khí hydro mô hình thí nghiệm 38 2.4.4 Xác định thành phần chất hệ 39 2.5 Nghiên cứu trình sản xuất hydro sinh học chủng Clostridium sp 40 2.5.1 So sánh sản lượng hydro chủng Clostridium sp phân lập với số chủng Clostridium khác 40 2.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất đến khả sinh trưởng sinh khí vi sinh vật 40 2.6 Tối ƣu hóa điều kiện lên men để nâng cao sản lƣợng hydro phƣơng pháp đáp ứng bề mặt 40 2.7 Khảo sát khả sinh khí hydro chủng Clostridium sp số nguồn chất thuộc hệ thứ 41 2.7.1 Nguồn chất bột bã sắn 41 2.7.2 Nguồn chất rượu 41 2.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 41 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Kết phân lập định danh chủng Clostridium sp phân lập đƣợc từ dày bò 42 3.1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn 43 3.1.2 Kết định danh khóa phân loại Bergey 45 3.1.3 Kết định danh phương pháp 16S rRNA 46 3.1.4 Hoạt tính enzyme chủng Clostridium sp phân lập 47 3.2 Nghiên cứu trình sản xuất hydro sinh học chủng Clostridium sp 49 3.2.1 So sánh sản lượng hydro chủng Clostridium sp phân lập với số chủng Clostridium khác 49 3.2.2 Khảo sát khả trưởng sinh khí hydo chủng Clostridium sp số nguồn chất có sẵn 53 3.2.2.1 Khả sinh trưởng sinh khí số nguồn chất có sẵn lên men đơn chủng 53 3.2.2.2 Khả sinh trưởng sinh khí số nguồn chất có sẵn lên men kết hợp chủng 56 3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất đến khả sinh trưởng sinh khí lên men kết hợp chủng Clostridium sp 59 3.3 Tối ƣu hóa điều kiện lên men để nâng cao sản lƣợng hydro phƣơng pháp đáp ứng bề mặt 60 3.4 Khảo sát khả sinh khí hydro chủng Clostridium sp số nguồn chất thuộc hệ thứ 64 3.4.1 Khả sinh hydro lên men với bột bã sắn 64 3.4.2 Sản lượng hydro với nguồn chất rượu 67 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 83 Phụ lục 1: Kết giải trình tự 83 Phụ lục 2: Một số kết thí nghiệm 85 Phụ lục 3: Kết đo sắc ký khí số mô hình có sản lƣợng hydro cao 86 Phụ lục 4: Một số hình ảnh thí nghiệm 90 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Nguyên lý hoạt động pin nhiên liệu Hình 1.2: Sơ đồ lên men Clostridium Con đường dẫn tới sản lượng tối đa theo lý thuyết mol H2/ mol glucose toàn chất chuyển hóa thành axit acetic theo đường màu đỏ 12 Hình 1.3: Ảnh hiển vi điện tử C beijerinckii NCIMB 8052 13 Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng phân giải hợp chất hữu trình lên men rượu [ 23 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh hydro 32 Hình 2.2: Phương pháp sục khí nitơ 33 Hình 2.3: Nguyên lý phương pháp cột nước xác định tổng lượng khí sinh từ bể phân hủy kỵ khí 37 Hình 3.1: Đặc điểm hình thái tế bào chủng phân lập 44 Hình 3.2 : Kết điện di sản phẩm nhân gen 16S rRNA kĩ thuật PCR 46 Hình 3.3: Kết xác định hoạt tính enzyme chủng Clostridium sp 48 Hình 3.4: Khả sinh trưởng sinh khí lên men đơn chủng chủng Clostridium sp số nguồn chất có sẵn 54 Hình 3.5 : Khả sinh trưởng sinh khí lên men kết hợp chủng Clostridium sp số nguồn chất có sẵn 57 Hình 3.6: Khả sinh trưởng sinh khí lên men kết hợp chủng Clostridium sp số nguồn chất có sẵn 59 Hình 3.7: Hồi quy đáp ứng ảnh hưởng yếu tố đến sản lượng hydro 63 Hình 3.8: Kết lên men chủng Clostridium sp với bột sắn 65 Hình 3.9: Kết lên men chủng Clostridium sp với rượu 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Clostridium 14 Bảng 1.2 : Khả sản xuất hydro từ số chủng vi sinh vật 15 Bảng 1.3: Sản lượng hydro từ chất khác số loài thuộc chi Clostridium 17 Bảng 3.1: Sản lượng khí hydro mẫu làm giàu lần 43 Bảng 3.2: Tính chất sinh lý hóa sinh chủng phân lập từ dày bò 45 Bảng 3.3 : Kết định danh kỹ thuật sinh học phân tử 47 Bảng 3.4: Kết sản lượng hydro chủng phân lập 50 Bảng 3.5: So sánh sản lượng hydro chủng Clostridium sp phân lập từ dày bò với số chủng Clostridium sp khác 51 Bảng 3.6: Ma trận thực nghiệm kết lên men kết hợp chủng Clostridium sp 61 Bảng 3.7: Phương sai Anova mô hình 62 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ Bp Base pair Btu British Thermal Unit C beijerinckiiST1 Clostridium beijerinckiiST1 C bifermentans ST4 Clostridium bifermentans ST4 C butyricum ST5 Clostridium butyricum ST5 DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2’- deoxyribonucleotide 5’- triphosphate EDTA Ethylenediamintetraacetic acid EtBr Ethidium bromide GC Gas chromatography OD Opical Desity PCR Polymerase chain reaction S Svedberg (đơn vị lắng) TAE Tris – acetate – EDTA VP Voges-Proskauer DNS 3,5-Dinitrosalisylic Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 50 Kataoka N., Miya A., and Kiriyama K (1997), "Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria", Water Science and Technology 36(6-7), pp 41-47 51 Koskinen P.E-P, et al (2008), "Ethanol and hydrogen production by two thermophilic, anaerobic bacteria isolated from Icelandic geothermal areas", Biotechnology and Bioengineering 101(4), pp 679-690 52 Kumar N and Das D (2000), "Enhancement of hydrogen production by Enterobacter cloacae IIT-BT 08", Process Biochemistry 35(6), pp 589-593 53 Khanal SK., et al (2004), "Biological hydrogen production: effects of pH and intermediate products", International journal of hydrogen energy 29(11), pp 1123-1131 54 Liu Y., et al (2008), "Hydrogen production from cellulose by co-culture of Clostridium thermocellum JN4 and Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum GD17", International journal of hydrogen energy 33(12), pp 2927-2933 55 Mangayil R., Santala V., and Karp M (2011), "Fermentative hydrogen production from different sugars by Citrobacter sp CMC-1 in batch culture", international journal of hydrogen energy 36(23), pp 15187-15194 56 Masset J., et al (2010), "Effect of pH on glucose and starch fermentation in batch and sequenced-batch mode with a recently isolated strain of hydrogenproducing Clostridium butyricum CWBI1009", International Journal of Hydrogen Energy 35(8), pp 3371-3378 57 Mei-Ling C., et al (2009), "Biohydrogen production by Clostridium butyricum EB6 from palm oil mill effluent", international journal of hydrogen energy 34(2), pp 764-771 77 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 58 Mei-Ling C., et al (2009), "Biohydrogen production from biomass and industrial wastes by dark fermentation", International Journal of Hydrogen Energy 34(8), pp 3277-3287 59 Mei N., et al (2014), "Fermentative hydrogen production by a new alkaliphilic Clostridium sp.(strain PROH2) isolated from a shallow submarine hydrothermal chimney in Prony Bay, New Caledonia", international journal of hydrogen energy 39(34), pp 19465-19473 60 Mitchell RJ., et al (2009), "Continuous hydrogen and butyric acid fermentation by immobilized Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755: effects of the glucose concentration and hydraulic retention time", Bioresource technology 100(21), pp 5352-5355 61 Mu Y., Wang G., and Han-Qing Y (2006), "Response surface methodological analysis on biohydrogen production by enriched anaerobic cultures", Enzyme and Microbial Technology 38(7), pp 905-913 62 Ngo AT., Nguyen HT., and Bui TVH (2012), "Thermophilic fermentative hydrogen production from xylose by Thermotoga neapolitana DSM 4359", Renewable Energy 37(1), pp 174-179 63 Ortigueira J., et al (2015), "Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass", Fuel 153, 128-134 64 Pallavi S and Anjana P (2013), "" 65 Pan C-M., et al (2008), "Fermentative hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii Fanp3", International journal of hydrogen energy 33(20), pp 5383-5391 78 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 66 Paul V, et al (2011), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes, Vol 3, Springer Science & Business Media 67 Pei-Ying L., et al (2007), "Biological hydrogen production of the genus Clostridium: Metabolic study and mathematical model simulation", International Journal of Hydrogen Energy 32(12), pp 1728-1735 68 Rachman MA., et al (1997), "Enhanced hydrogen production in altered mixed acid fermentation of glucose by Enterobacter aerogenes", Journal of fermentation and bioengineering 83(4), pp 358-363 69 Reith JH., Wijffels RH., and Barten H (2003), Bio-methane and bio-hydrogen: status and perspectives of biological methane and hydrogen production, Dutch Biological Hydrogen Foundation 70 Ren N., et al (2008), "Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16", international journal of hydrogen energy 33(21), pp 6124-6132 71 Sang-Hyoun K., Sun-Kee H., and Hang-Sik S (2006), "Effect of substrate concentration on hydrogen production and 16S rDNA-based analysis of the microbial community in a continuous fermenter", Process Biochemistry 41(1), pp 199-207 72 Schröder C., Selig M., and Schönheit P (1994), "Glucose fermentation to acetate, CO2 and H2 in the anaerobic hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima: involvement of the Embden-Meyerhof pathway", Archives of Microbiology 161(6), pp 460-470 73 Seelert T., Ghosh D., and Yargeau V (2015), "Improving biohydrogen production using Clostridium beijerinckii immobilized with magnetite nanoparticles", Applied microbiology and biotechnology 99(9), pp 4107-4116 79 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 74 Shinsuke S and Tatsuo Y (2007), "Microbial production of hydrogen and ethanol from glycerol‐containing wastes discharged from a biodiesel fuel production plant in a bioelectrochemical reactor with thionine", Biotechnology and bioengineering 98(2), pp 340-348 75 Shing-Der C., et al (2008), "Batch and continuous biohydrogen production from starch hydrolysate by Clostridium species", International Journal of Hydrogen Energy 33(7), pp 1803-1812 76 Sikora A., et al (2013), Lactic acid bacteria in hydrogen-producing consortia: on purpose or by coincidence?, INTECH open science open minds 77 Singh S., et al (2010), "Dark fermentative biohydrogen production by mesophilic bacterial consortia isolated from riverbed sediments", International Journal of Hydrogen Energy 35(19), pp 10645-10652 78 Sinha P and Pandey A (2011), "An evaluative report and challenges for fermentative biohydrogen production", International Journal of Hydrogen Energy 36(13), pp 7460-7478 79 Solange MI (2014), "Brewer's spent grain: a valuable feedstock for industrial applications", Journal of the Science of Food and Agriculture 94(7), pp 12641275 80 Sompong O., et al (2011), "Biohydrogen production from cassava starch processing wastewater by thermophilic mixed cultures", international journal of hydrogen energy 36(5), pp 3409-3416 81 Sreela-Or C., et al (2011), "Optimization of key factors affecting hydrogen production from food waste by anaerobic mixed cultures", International Journal of Hydrogen Energy 36(21), pp 14120-14133 80 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 82 Su H., et al (2009), "Improving hydrogen production from cassava starch by combination of dark and photo fermentation", International Journal of Hydrogen Energy 34(4), pp 1780-1786 83 Taguchi F., et al (1995), "Hydrogen production from continuous fermentation of xylose during growth of Clostridium sp strain No 2", Canadian journal of microbiology 41(6), pp 536-540 84 Tanisho S., Suzuki Y , and Wakao N (1987), "Fermentative hydrogen evolution by Enterobacter aerogenes strain E 82005", International journal of hydrogen energy 12(9), pp 623-627 85 Tonukari N.J (2004), "Cassava and the future of starch", Electronic journal of biotechnology 7(1), pp 5-8 86 Van Niel EWJ., et al (2002), "Distinctive properties of high hydrogen producing extreme thermophiles, Caldicellulosiruptor saccharolyticus and Thermotoga elfii", International Journal of Hydrogen Energy 27(11), pp 13911398 87 Vendruscolo F (2014), "Biohydrogen Production from Starch Residues", World Academy of Science, Engineering and Technology, International Journal of Chemical, Molecular, Nuclear, Materials and Metallurgical Engineering 8(12), pp 1400-1406 88 Wang J and Wan W (2008), "Optimization of fermentative hydrogen production process by response surface methodology", International journal of hydrogen energy 33(23), pp 6976-6984 89 Wang X., et al (2007), "The isolation and microbial community analysis of hydrogen producing bacteria from activated sludge", Journal of applied microbiology 103(5), pp 1415-1423 81 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học 90 Xiaoyi W and Bo J (2009), "Process optimization of biological hydrogen production from molasses by a newly isolated Clostridium butyricum W5", Journal of bioscience and bioengineering 107(2), pp 138-144 91 Xiaoyi W., Bo J., and Mulcah D (2008), "Impact of carbon and nitrogen sources on hydrogen production by a newly isolated Clostridium butyricum W5", International journal of hydrogen energy 33(19), pp 4998-5005 92 Yokoi H., et al (2001), "Microbial hydrogen production from sweet potato starch residue", Journal of bioscience and bioengineering 91(1), pp 58-63 93 Yongfang Z., Guangzhen L., and Jianquan S (2005), "Hydrogen production in batch culture of mixed bacteria with sucrose under different iron concentrations", International Journal of Hydrogen Energy 30(8), pp 855-860 94 Zhao X., et al (2011), "Hydrogen production by the newly isolated Clostridium beijerinckii RZF-1108", Bioresource technology 102(18), pp 8432-8436 82 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết giải trình tự Trình tự 16s rDNA chủng C beijerinckii ST1 …TGGATCCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGNG GATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGC CGGGCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTA AAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACG GCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGA AACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGT CTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGC GTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTC CAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGAC ACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATG… Trình tự 16s rDNA chủng C bifermentans ST4 …CCAAGGCAACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAAC TGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG AAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTG TCCTCAAGGAAGATAATGACGGTACTTGAGGAGGAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCTAGCGTTATCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTG CGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGAAGTGAAAGGCTACGGCTCAACCGTAGTAAGCTTTT GAAACTAGAGAACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAA TGCGTAGATATTAGGAGGAATACCAGTAGCGAAGGCGGCTCTCTGGACTGTAACTGAC ACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG TAAACGATGAGTACTAGGTGTCGGGGGTTACCCCCCTCGGTGCCGCAGCTAACGCATT AAGTACTCCGCCTGGGAAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGA CCCGCACAAGTAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTA AGCTTGACATCCCACTGACCTCTCCCTAATCGGAGATTTCCCTTCGGGGACAGTGGTG ACAGGTGGT… 83 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Trình tự 16s rDNA chủng C butyricum ST5 …TTAAATGCAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACG GGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGA TTAATACCGCATAAGATTGTAGTACCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCT ATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGAC GATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCA ACGCCGCGTGAGTGATGACGGCCTTCGGATTGTAAAACTCTGTCTTTGGGGACGATAA TGACGGTACCCAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG TAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTA AGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTA GAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGG AAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAG CGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACT AGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGC GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACA… Trình tự 16s rDNA chủng E cloacae ST8 …CCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCG GATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATC CCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCC TACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGC CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGAT AAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAA GCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACT GCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCG GTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAG ACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC ACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTA ACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG ACGGGGGCCCGCA… 84 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Phụ lục 2: Một số kết thí nghiệm 1,8 y = 14,29x + 0,142 R² = 0,999 1,6 1,4 OD540 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Hàm lƣợng glucose Đồ thị đƣờng chuẩn phân tích hàm lƣợng glucose Gas vol (mL) H2 N2 CH4 y = 8,7729E-06x R² = 9,9953E-01 y = 2,4909E-06x y = 6,7948E-06x R² = 9,9869E-01 R² = 9,9955E-01 CO2 y = 7,1172E-07x R² = 9,9724E-01 Area Đồ thị đƣờng chuẩn phân tích thành phần khí 85 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Thành phần bột sắn Tổng chất rắn Chất rắn lơ lửng Tổng carbonhydrat 37,8 g/g 32 g/L 9,6 g/L COD Nito tổng 51,3 g/L 0,88 g/L Photpho tổng 0,43 g/L Phụ lục 3: Kết đo sắc ký khí số mô hình có sản lƣợng hydro cao Ảnh đƣờng pitch lên men C beijerinckii ST1 với nguồn chất glucose, hydro đạt 51,7 % 86 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Ảnh đƣờng pitch lên men C bifermentans ST4 với nguồn chất sucrose, hydro đạt 55,3 % Ảnh đƣờng pitch lên men kết hợp chủng ST5 ST4 với nguồn chất glucose, hydro đạt 54,7 % 87 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Ảnh đƣờng pitch lên men kết hợp chủng ST5 ST1 với nguồn chất sucrose, hydro đạt 55,1 % Ảnh đƣờng pitch lên men kết hợp chủng Clostridium sp với nguồn chất sucrose, hydro đạt 61,8 % 88 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Ảnh đƣờng pitch lên men chủng C butyricum ST5 với nguồn chất bột sắn, hydro đạt 59,2 % Ảnh đƣờng pitch lên men kết hợp chủngClostridium sp với nguồn chất rƣợu, hydro đạt 54,5 % 89 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Phụ lục 4: Một số hình ảnh thí nghiệm Ảnh sục khí Nito tạo điều kiện kỵ khí Ảnh trình lên men bể lắc ổn nhiệt 90 Hoàng Thị Vui – CHK23 – Luận văn cao học – Chuyên ngành vi sinh vật học Ảnh làm việc với box cấy kỵ khí 91 ... thời phương pháp đơn giản dễ thực Đề tài: Nghiên cứu sản xuất hydro sinh học từ vi khuẩn Clostridium sp phân lập từ dày bò phương pháp lên men tối nhằm phân lập chủng Clostridium sp từ dày bò nghiên. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HOÀNG THỊ VUI NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT HYDRO SINH HỌC TỪ VI KHUẨN Clostridiumsp ĐƢỢC PHÂN LẬP TỪ DẠ DÀY BÒ BẰNG PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN. .. hầu hết hydro từ chất, tất [34, 77] 1.5 Phƣơng pháp lên men tối sản xuất hydro Lên men tối phương pháp lên men điều kiện kỵ khí thiếu oxy để tạo hydro Trong trình lên men tối, phân tử hydro thường