BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ OANH Mã sinh viên : 1201450 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HÀ OANH Mã sinh viên : 1201450 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh 2.Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minh HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy hướng dẫn bảo tận tình cho suốt trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược trường Đại học Y-Dược Huế, nghiên cứu sinh, người động viên, giúp đỡ nhiều trình thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dược sĩ Phạm Thị Tâm – giảng viên khoa Dược trường Đại học Y- Dược Thái Bình Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Thầy Cô giáo, Kỹ thuật viên môn Hoá Phân Tích - Độc Chất - Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập nghiên cứu Cuối muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 18 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Hà Oanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng : TỔNG QUAN _ Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ thuốc thảo dƣợc hỗ trợ điều trị điều trị tiểu đƣờng Tổng quan nhóm sulfonylurea 1.1.2.1 Glipizid 1.1.2.2 Glimepirid _ 1.1.2.3 Gibenclamid _ 1.1.2.4 Gliclazid Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu _ 1.2.1 Sắc ký lớp mỏng _ Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU _ 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu _ 15 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu _ 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu _ 17 2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng glipizid, glimepirid, glibenclamid gliclazid trộn lẫn chế phẩm đông dược HPTLC 17 2.2.1.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu _ 17 2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký _ 17 2.2.2 Thẩm định phương pháp _ 18 2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _ 20 2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 Chƣơng : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ _ 21 3.1 Xây dựng thẩm định phƣơng pháp HPTLC _ 21 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện HPTLC _ 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu _ 24 3.1.3 Thẩm định phương pháp _ 28 3.1.3.1 Tính chọn lọc 28 3.1.3.2 Tính thích hợp hệ thống _ 29 3.1.2.3 Khoảng tuyến tính 30 3.1.2.4 Độ đúng, độ xác phương pháp 31 3.1.2.5 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng _ 34 3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực _ 36 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 42 4.1 Lựa chọn phƣơng pháp phân tích 42 4.2 Xây dựng phƣơng pháp 43 4.2.1 Điều kiện xử lý mẫu _ 43 4.3 Thẩm định phƣơng pháp _ 44 4.4 Về kết nghiên mẫu thực 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ _ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Phụ lục Phụ lục 1.1 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính Glipizid 1.2 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glimepirid 1.3 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính glibenclamid 1.4 Sắc kí đồ analog đường tuyến tính gliclazid Phụ lục Định lượng mẫu thực DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức (Association of Official Analytical Chemists) Glib Glibenclamid Glic Gliclazid Glim Glimepirid Glip Glipizid LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần mẫu dược liệu tự tạo 16 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết chất phân tích 25 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp HPTLC 30 Bảng 3.4 Kết đánh giá khoảng tuyến tính chất phân tích 31 Bảng 3.5 Đánh giá kết độ lặp lại độ chất phân tích 32 Bảng 3.6 Kết xác định LOD, LOQ chất phân tích 36 Bảng 3.7 Kết định lượng chất mẫu thực 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo Glipizid Hình 1.2 Công thức cấu tạo Glimepirid Hình 1.3 Công thức cấu tạo Glibenclamid Hình 1.4 Công thức cấu tạo Gliclazid Hình 3.1 Kết khảo sát hệ dung môi pha động, 1- Gliclazid; 2-Glibenclamid; 3-Glipid; 4-Glimepirid; 5- hỗn hợp chất chuẩn 21 Hình 3.2 Kết khảo sát hệ n- butylacetat chứa acid formic tỷ lệ 22 Hình 3.3 Sắc kí đồ hệ n-butylacetat chứa 0,5% acid formic, sắc kí nhắc lại 24 Hình 3.4 Kết phổ UV chất phân tích: a- Glip; b- Glim; c- Glib; d- Glic 24 Hình 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết 26 Hình 3.6 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích 27 Hình 3.7 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC :1- trắng ; 2- chuẩn ; 28 3- trắng thêm chuẩn 28 Hình 3.8 Sắc ký đồ analog hỗn hợp hoạt chất xác định tính chọn lọc phương pháp (a)-chất chuẩn; (b)-mẫu placebo tự tạo; (c)- hỗn hợp chuẩn mẫu placebo 29 Hình 3.9 Sắc ký đồ analog xác định LOD của: a- Glip (96 ng/ vết);b- Glim (192 ng/ vết); c-Glib (192 ng/vết); d- Glic(480 ng/ vết) 35 Hình 3.10 Sắc kí đồ phân tích mẫu chế phẩm đông dược thị trường 37 Hình 3.11 Kết chồng phổ mẫu âm tính 38 Hình 3.12 Kết chồng phổ UV mẫu dương tính với Glibenclamid 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, người có xu hướng phòng bệnh, cải thiện sức khỏe điều trị bệnh mãn tính sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Các thuốc đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (TPBVSK) có nguồn gốc tự nhiên mục tiêu mà nhà sản xuất người tiêu dùng nước giới hướng tới Tuy nhiên, tình trạng tân dược trộn trái phép đông dược, TPBVSK từ dược liệu diễn (thành phần có hoạt chất tân dược không công bố nhãn) Đái tháo đường bệnh mạn tính gây tổn hại nghiêm trọng cho nhiều hệ thống thể thời gian dài Theo ước tính Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái tháo đường toàn giới khoảng 90% số đái tháo đường typ II (không phụ thuộc insulin) [19] Trên thị trường dược phẩm, bốn nhóm thuốc tổng hợp bao gồm: sulfonylure, biguanid, thiazolidin thuốc khác sulfonylure, sử dụng phổ biến để điều trị tiểu đường typ II Đã có nghiên cứu công bố thuốc giảm glucose máu thường bị phát trộn lẫn trái phép chế phẩm đông dược metformin, glibenclamid, gliclazid [15], [17]; Nếu sử dụng chế phẩm thời gian dài mà rõ thành phần, liều lượng người sử dụng xuất biểu tác dụng không mong muốn nhiễm toan lactic, tổn thương gan thận, rối loạn tiêu hóa…[20], [21] Do đó, nhu cầu cấp thiết nhằm phát triển phương pháp nhanh chóng để sàng lọc chế phẩm đông dược bị trộn lẫn thuốc tân dược Để góp phần vào công tác kiểm tra phát chất cấm trộn lẫn chế phẩm đông dược, tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp xác định số thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn chế phẩm đông dƣợc sắc ký lớp mỏng hiệu cao” Với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, bước đầu định lượng thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn chế phẩm đông dược sắc ký lớp mỏng hiệu cao Ứng dụng phương pháp để phân tích số mẫu chế phẩm đông dược lưu hành thị trường Thuốc gia 19 HCD20 truyền trị bệnh Mẫu T tiểu đường Ấp Thới Tân A, Xã Trường Chánh Đức Thắng, Thới Lai, Cần Thơ viên/lần lần/ngày (hoàn cứng) Thuốc gia 20 BD21 truyền Mẫu mua trôi (thuốc bột) Thuốc gia 21 HCD22 truyền (hoàn cứng) Gia đình bệnh nhân cung cấp- 5-10viên/lần Mua từ miền Nam 2-3 lần/ngày Số: 001 22 VND23 Diabet (viên nang) NSX: 16/04/15 HD: 15/04/18 SĐK: 1540/2015/ATTP-XNCB Công ty CP Dược liệu vật tư y 2-3 viên/lần lần/ngày tế Hải Phòng Số lô: 050616 23 VND24 T.Đ Kingphar (viên nén) HD: 14/06/2019 SĐK: 6346/2016/ATTP-XNCB Nhà máy Nội Bài- Công ty TNHH viên/lần 2-3 lần/ngày Công nghệ Herbitech Lô SX: 002/16 24 VND25 TĐ Care (viên nang) HD: 15/02/19 SĐK: 22238/2013/ATTP-XNCB Công ty CP Dược phẩm Gia 2-3 viên/lần 2-3 lần/ngày Nguyễn 25 VND26 Nadia Số lô: 14020315 viên/lần (viên nang) HD: 30/03/18 lần/ngày SĐK: 846/2009/YT-CNTC Công ty CP Dược phẩm Hoàng Giang Số lô: 010116 26 VND27 Ích tiểu đường (viên nang) HD: 04/01/19 SĐK: 14751/2014/ATTP-XNCB Công ty CP Dược phẩm Quốc tế viên/lần lần/ngày Abipha Số lô: 5801 27 VND28 Abet (viên nang) HD: 18/01/2018 SĐK: 23235/2014/ATTP-XNCB Công ty TNHH Công nghệ viên/lần lần/ngày Dược phẩm Zorro Số lô: 220315 28 VND29 GYGURMAR (viên nang) HD: 110318 SĐK: 7846/2012/ATTP-XNCB Công ty CP Dược thiết bị y tế viên/lần lần/ngày Hà Tây Số lô: 07/2018/144 29 VND30 Diab Kontrol (viên nén) HD: 30/07/2018 Ngày 2-3 viên Nhà sx: Juva Pharma kft 1-2 viên sáng, NK&PP: Công ty TNHH Phân viên tối phối Huvita Việt Nam 30 VND31 Dây thìa canh SĐK: 10385/2016/ATTP-XNCB Gia Huy Công ty TNHH Dược phẩm Hải (viên nang) Linh viên/lần lần/ngày Số lô: 010916 31 VND32 Dibetcare HD: 26/09/19 viên/lần (viên nang) SĐK:12604/2016/ATTP-XNCB lần/ngày Công ty CP Hoá dược Việt Nam Thuốc gia 32 HCD33 truyền 44 Lãn Ông- Hà Nội (hoàn cứng) Giảo cổ lam 33 TD34 Tuệ Linh (trà túi lọc) 10 viên/lần lần/ngày Số lô: 02/06/16 HD: 08/06/18 SĐK: 14101/2013/ATTP-XNCB 2-4 gói/ngày Công ty TNHH Tuệ Linh Số lô: 010816 34 VND35 Tiểu đường OB (viên nang) HD: 29/08/19 SĐK: 19535/2016/ATTP-XNCB Công ty TNHH Dược phẩm viên/lần lần/ngày USAPHA Số lô: 4070910 35 VND36 Mokemla HD: 09/01/2018 viên/lần (viên nang) SĐK: 5619/2015/ATTP-XNCB lần/ngày Công ty TNHH Dược phẩm T&T Anti diabetic 36 VND37 (Tiểu đường tiêu khát) (viên nang) 37 VND38 Số lô: 010815 HD: 26/08/18 SĐK: 20899/2013/ATTP-XNCB Công ty CP Dược vật tư y tế Hải viên/lần lần/ngày Dương Tiducap Số lô: 161016 2-3 viên/lần (viên nang) HD: 16/10/19 lần/ngày SĐK: 25658/2013/ATTP-XNCB Công ty CP Dược Viko 8-Pháp Số lô: 0020716 38 VND39 DK-betics (viên nang) HD: 120719 SĐK: 270/2015/ATTP-XNCB Ngày 2-4 viên Công ty TNHH MTV Dược khoatrường ĐH Dược Hà Nội 39 HCD40 40 VND41 Tiêu khát hoàn (hoàn cứng) (viên nang) Mua tại: 28 Lãn Ông- Hà Nội Do bệnh nhân cung cấp 5-10 viên/lần 2-3 lần/ngày Phụ lục 1.1 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính Glipizid Lượng chất/ vết (µg) 0.5 Sắc kí đồ analog 1.0 2,0 4.0 1.2 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính glimepirid Lượng chất/ vết (µg) 0,6 0,8 Sắc kí đồ analog 1,2 1,6 1.3 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính glibenclamid Lượng chất/ vết (µg) 1,0 2,0 Sắc kí đồ analog 3,0 4,0 1.4 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính gliclazid Lượng chất/ vết Sắc kí đồ analog (µg) 24 32 Phụ lục Định lƣợng mẫu thực ... phƣơng pháp xác định số thuốc nhóm sulfonylurea trộn lẫn chế phẩm đông dƣợc sắc ký lớp mỏng hiệu cao Với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, bước đầu định lượng thuốc nhóm sulfonylurea. .. THỊ HÀ OANH Mã sinh viên : 1201450 XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC NHÓM SULFONYLUREA TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ... sulfonylurea trộn lẫn chế phẩm đông dược sắc ký lớp mỏng hiệu cao Ứng dụng phương pháp để phân tích số mẫu chế phẩm đông dược lưu hành thị trường Chƣơng : TỔNG QUAN Tổng quan đối tƣợng nghiên cứu Các