BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THỊ BÍCH NGA MÃ SINH VIÊN: 1201398 TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ HMG-COA REUCTASE IN VITRO VÀ ÁP DỤNG SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THỊ BÍCH NGA MÃ SINH VIÊN: 1201398 TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ HMG-COA REUCTASE IN VITRO VÀ ÁP DỤNG SÀNG LỌC MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thùy Dương Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thùy Dương, DS Phạm Đức Vịnh – Bộ môn Dược Lực – Trường Đại học Dược Hà Nội, người cô, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên bạn em nghiên cứu khoa học Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện tốt nhất, nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ, động viên để em hồn thành khóa luận Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Ban giám hiệu, Phịng đào tạo thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt năm năm em học tập trường Cuối em xin cảm ơn gia đình, bạn bè, người ln theo sát chăm lo, động viên khích lệ em trình học tập thực đề tài vừa qua Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Hồ Thị Bích Nga MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Mối quan hệ rối loạn lipid máu, tăng cholesterol enzym HMG-CoA reductase 1.1.1 Định nghĩa rối loạn lipid máu 1.1.2 Tăng cholesterol vai trò enzym HMG-CoA reductase 1.1.3 Thuốc ức chế HMG-CoA reductase 1.2 Enzym HMG-CoA reductase 1.2.1 Nguồn gốc, phân bố 1.2.2 Cấu trúc, chế hoạt động 1.2.3 Động học enzym .10 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym 11 1.3 Các phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro 13 1.3.1 Phương pháp quang phổ 13 1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 13 1.3.3 Kỹ thuật đồng vị phóng xạ (RI) 14 1.3.4 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 14 1.4 Các nghiên cứu tìm kiếm dược liệu theo hướng điều trị rối loạn lipid máu ức chế HMG-CoA reductase 15 1.4.1 Các nghiên cứu giới 15 1.4.2 Các nghiên cứu Việt Nam 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Chuẩn bị mẫu dược liệu 19 2.2 Phương tiện nghiên cứu 19 2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2 Thiết bị dụng cụ 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng .21 2.4.2 Áp dụng sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng số dược liệu 26 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .29 3.1 Kết 29 3.1.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng 29 3.1.2 Áp dụng sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng số dược liệu 36 3.2 Bàn luận 38 3.2.1 Về triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng 38 3.2.2 Về sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng số dược liệu 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CoA-SH, CoA Coenzym A DMSO Dimethyl sulfoxid DTT Dithiothreitol EDTA Acid ethylen diamin tetraacetic HDL-C Lipoprotein tỷ trọng cao HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A HMG-CoA reductase 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A reductase HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% LDL-C Lipoprotein tỷ trọng thấp LS-CM/CM Sắc kí lỏng khối phổ MVA Acid mevalonic MVAL Mevalonolacton NADPH Nicotinamid adenin dinucleotid phosphat OD Mật độ quang RLLPM Rối loạn lipid máu TG Triglycerid TLTK Tài liệu tham khảo VLDL-C Lipoprotein tỷ trọng thấp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hiệu làm giảm LDL-C tương đối mức liều statin Bảng 2.1 Danh sách dược liệu dùng nghiên cứu 18 Bảng 3.1 Tốc độ tiêu thụ NADPH thời gian khảo sát nồng độ enzym khác 30 Bảng 3.2 Tốc độ tiêu thụ NADPH thời gian khảo sát nhiệt độ khác .32 Bảng 3.3 Ảnh hưởng atorvastatin lên hoạt tính HMG-CoA reductase nồng độ khác 34 Bảng 3.4 Kết đánh giá ảnh hưởng 10 dược liệu nồng độ 100 µg/ml đến hoạt tính HMG-CoA reductase 36 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Sơ đồ tổng hợp cholesterol Hình 1.2 Cấu trúc HMG-CoA reductase người vị trí gắn HMG-CoA, NADP tetramer (A: Mặt trước, B: Mặt sau) Hình 1.3 Cấu trúc monomer HMG-CoA reductase người .9 Hình 1.4 Cơ chế hoạt động HMG-CoA reductase 10 Hình 1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzym HMG-CoA reductase 12 Hình 2.1 Quy trình thí ngiệm khảo sát động học enzym 22 Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng xúc tác enzym HMG-CoA reductase .23 Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất HMG-CoA đến phản ứng enzym HMG-CoA reductase 24 Hình 2.4 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase atorvastatin 25 Hình 2.5 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase mẫu thử dược liệu 27 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn thay đổi mật độ quang theo thời gian với dung dịch enzym có nồng độ khác .29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn thay đổi mật độ quang theo thời gian nhiệt độ khác 31 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc theo thời gian tốc độ tiêu thụ NADPH nồng độ HMG-CoA khác 33 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ức chế HMG-CoA reductase artovastatin nồng độ khác 35 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ức chế HMG-CoA reductase mẫu thử dược liệu nồng độ 100 µg/ml 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Cholesterol thành phần quan trọng tất màng tế bào nhân chuẩn Trong máu, cholesterol vận chuyển dạng kết hợp với protein hay gọi lipoprotein Duy trì cân nồng độ cholesterol có vai trò quan trọng phát triển thể khỏe mạnh Mất cân nồng độ cholesterol gây nhiều bệnh lý Trong đó, cholesterol máu tăng yếu tố nguy phát triển bệnh lý mạch vành (CAD) đồng thời làm tăng phát triển gốc tự do, đóng vai trò phát sinh bệnh lý khác bệnh mạch vành ung thư, viêm [17], [22] Hiện bệnh lý tim mạch chiếm 1/3 tổng số ca tử vong toàn giới, chuyên gia dự báo đến năm 2020, bệnh lý tim mạch nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tàn tật toàn giới [34], [46] Các thuốc hóa dược điều trị rối loạn lipid máu sử dụng tương đối rộng rãi bao gồm statin, nhựa gắn acid mật (resin), fibrat, acid nicotinic … Trong đó, statin nhóm thuốc đầu tay sử dụng cho bệnh nhân tăng cholesterol máu với khả dung nạp tốt Đích tác dụng statin enzym HMG-CoA reductase, enzym đóng vai trò then chốt trình tổng hợp cholesterol Điều gợi ý q trình phát triển thuốc lựa chọn hướng nghiên cứu ức chế hoạt động enzym Để bổ sung, hỗ trợ cho hóa dược, nguồn nguyên liệu sinh học ngày quan tâm nghiên cứu điều trị bệnh rối loạn lipid máu Trên giới có nhiều nghiên cứu để tìm kiếm dược liệu có tác dụng ức chế HMG-CoA reductase điều trị bệnh lý liên quan đến tăng cholesterol [33], [53] Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu sinh học phong phú, với kinh nghiệm lâu đời sử dụng thuốc YHCT để điều trị bệnh lý liên quan, cung cấp nguồn có giá trị cho sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase Tuy nhiên, chưa có công bố liên quan đến phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase nước Xuất phát từ thực tế vậy, với mong muốn xây dựng phương pháp sàng lọc, xác định nhanh dược liệu có tiềm điều trị rối loạn lipid máu thông qua ức chế enzym HMG-CoA reductase, thực đề tài “Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro áp dụng sàng lọc số dược liệu” với hai mục tiêu: Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro đĩa 96 giếng Áp dụng phương pháp triển khai để sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase số dược liệu có tiềm điều trị tăng cholesterol máu • Về kết triển khai phương pháp - Lựa chọn nồng độ enzym thích hợp cho phản ứng Các nghiên cứu trước đây, tiến hành phương pháp đo quang cuvet (thể tích 1ml), nồng độ enzym sử dụng từ 0,0025 – 0,0035 mg/ml, tiến hành đĩa 96 giếng (thể tích nhỏ 200 µl), nồng độ enzym sử dụng từ 0,005 – 0,007 mg/ml [37], [70], [83] Phương pháp đo quang đĩa 96 giếng đo nhiều mẫu lúc thuận lợi cho khảo sát nên thí nghiệm đo đĩa 96 giếng Loại đĩa sử dụng đĩa UV 96 giếng Costar 3635 đo độ hấp thụ bước sóng tử ngoại, đo bước sóng 340 nm Đề tài triển khai phương pháp thử hoạt tính enzym với nồng độ enzym khác 0,006 mg/ml, 0,009 mg/ml, 0,012 mg/ml 0,015 mg/ml nhằm lựa chọn nồng độ enzym thích hợp cho khảo sát Trong hoạt độ thử, nồng độ 0,006 mg/ml thể khả xúc tác tốt nhất, tốc độ tiêu thụ NADPH theo thời gian tuyến tính theo thời gian, đặc biệt 10 phút Chúng lựa chọn nồng độ enzym 0,006 mg/ml sử dụng cho nghiên cứu - Lựa chọn thời gian theo dõi phản ứng enzym thích hợp Tại nồng độ enzym 0,006 mg/ml, thời gian từ 2-10 phút, độ giảm mật độ quang tuyến tính với thời gian (R2 = 0,999) Do vậy, lựa chọn thời điểm dừng theo dõi phản ứng enzym 10 phút Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu tiến hành trước đó [70], [83] - Lựa chọn nồng độ chất HMG-CoA thích hợp cho phản ứng Cơ chất HMG-CoA sử dụng với nồng độ khác số nghiên cứu, 200 µM [80], 400 µM [20], [37], 1,2 mM [33] Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát nồng độ chất HMG-CoA nồng độ 100 µM, 200 µM, 400 µM, 800 µM Kết cho thấy nồng độ HMG-CoA 400 µM tốc độ phản ứng enzym cao nồng độ HMG-CoA 200 µM, 100 µM, gần tốc độ phản ứng enzym nồng độ HMG-CoA 800 µM Ở nồng độ 400 µM, chất bão hòa enzym, tốc độ phản ứng tiến tới tốc độ giới hạn (Vmax) Do vậy, khảo sát nồng độ chất HMG-CoA 400 µM lựa chọn Cơ chất HMG-CoA NADPH 39 bảo quản nhiệt độ - 20oC pha chế trước tiến hành phản ứng Bảo quản tồn q trình thí nghiệm cách ngâm ống đựng dung dịch chất nước đá - Lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzym Các nghiên cứu hoạt tính enzyme HMG-CoA reductase công bố hầu hết thực 37oC enzym hoạt động tốt nhiệt độ [37], [70], [83] Chúng tiến hành khảo sát nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzym thực ba nhiệt độ 25oC, 30oC 37oC Kết cho thấy 25oC, enzym hoạt động yếu nhất, tốc độ phản ứng chậm Nhiệt độ 30oC tốc độ phản ứng nhanh 250C 370C enzym hoạt động tốt Kết nghiên cứu hồn tồn phù hợp với cơng bố trước đó nhiệt độ thích hợp cho phản ứng enzym HMG-CoA reductase [67] Tuy nhiên, đảm bảo nhiệt độ 37oC điều kiện phịng thí nghiệm q trình đo với máy ELISA vơ khó khăn Đĩa 96 giếng nằm đầu đọc khay vi thể, khơng trì nhiệt độ tối ưu bắt đầu trình đo Bên cạnh đó, việc thực phản ứng enzym nhiệt độ 37oC, thiết bị sử dụng máy sinh hóa với thể tích lần đo 400 µL, gấp đơi thể tích lần đo đĩa Costar UV 3635 Quy trình tiến hành phức tạp, tốn nhiều thời gian công sức đo máy ELISA với đầu đọc khay vi tinh thể Để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm đơn giản hóa quy trình tiến hành, đồng thời hạn chế tối đa sai số ảnh hưởng nhiệt độ hoạt động enzym HMG-CoA reductase, lựa chọn nhiệt độ 30oC cho nghiên cứu - Kết thẩm định phương pháp với chất ức chế atorvastatin Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động enzym HMG-CoA reductase in vitro đĩa UV 96 giếng Costar 3635 thẩm định qua đánh giá tác dụng atorvastatin Atorvastatin thuốc có tác dụng hạ cholesterol máu dùng điều trị rối loạn lipid máu sử dụng phổ biến lâm sàng Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase, pravastatin, atorvastatin , fluvastatin, rosuvastatin, lovastatin thường sử dụng chứng 40 dương nghiên cứu [25], [54], [66] Khi triển khai phương pháp với chất chứng dương atorvastatin thu IC50 = 13,81 nM Kết gần với giá trị IC50 atorvastatin báo cáo nghiên cứu trước (IC50 = 8,2 nM) [59] Thậm chí số nghiên cứu cơng bố IC50 atorvastatin nằm khoảng 40-100 nM [25] Như phương pháp triển khai cho kết phù hợp với atorvastatin sử dụng atorvastatin làm chứng dương cho nghiên cứu Nhiệt độ cho phản ứng enzym chưa tối ưu so với điều kiện phản ứng nghiên cứu giới dẫn đến IC50 atorvastatin thí nghiệm chúng tơi cao kết công bố - Một số vấn đề cần lưu ý q trình bảo quản tiến hành thí nghiệm Enzym HMG-CoA reductase yêu cầu bảo quản nhiệt độ - 20oC để đảm bảo hoạt tính Tuy nhiên q trình pha chế tiến hành thí nghiệm, enzym bị hoạt hóa giảm hoạt động Vì cần giữ nhiệt độ thấp cho dung dịch enzym trình bảo quản (tủ lạnh – 20oC) q trình thí nghiệm cách ngâm ống đựng dung dịch đựng enzym nước đá Enzym chất pha chế trước thực phản ứng Dược liệu sử dụng thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase thường chiết với dung môi n-hexan, dichloromethan (DCM), ethyl axetat (EtOAc), methanol (MeOH), nước hòa tan DMSO làm dung dịch thử [33], [37], [68] Các mẫu thuốc nghiên cứu chiết methanol, pha thành mẫu thử DMSO phù hợp với nghiên cứu trước đó NADPH phát bước sóng 340 nm, đó cần sử dụng loại đĩa không hấp thụ quang bước sóng Do nghiên cứu, lựa chọn đĩa Costar UV 96 giếng 3635 – loại đĩa phù hợp để đo bước sóng ngắn Phương pháp nghiên cứu dù chưa nghiên cứu đầy đủ nhiều hạn chế, có ưu điểm nhanh, độ lặp lại ổn định, sử dụng nhiều mẫu 41 lúc, thích hợp cho nghiên cứu sàng lọc, phát nhanh dược liệu tiềm 3.2.2 Về sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro đĩa Costar 96 giếng số dược liệu • Về sở lựa chọn dược liệu Vai trò cholesterol trình hình thành mảng xơ vữa động mạch nhiều nghiên cứu chứng minh [87] Do tác dụng phụ khác thuốc làm giảm cholesterol mà nghiên cứu dược liệu ngày quan tâm để tìm chất an tồn Trên giới có nhiều nghiên cứu tìm kiếm dược liệu tiềm điều trị bệnh lý liên quan đến rối loạn lipid máu thông qua ức chế enzym HMG-CoA reductase [33], [37], [80] Ở Việt Nam, có số nghiên cứu vai trò thuốc việc giảm cholesterol toàn phần, LDL-C tăng HDL-C Các nghiên cứu đối tượng thuốc cụ thể (Linh chi Việt Nam, Nghệ vàng) thuốc dân gian (Bán hạ bạch truật thiên ma thang, Nhị trần thang) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sàng lọc thuốc có tác dụng hạ cholesterol máu công bố chưa có quy trình tiến hành có nhiều khó khăn Để phát nhanh dược liệu có tiềm hạ cholesterol máu sử dụng điều trị rối loạn lipid, phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase sau xây dựng thẩm định với chứng atorvastatin, tiến hành với 10 mẫu dược liệu: cốt khí củ, me rừng, phèn đen, dứa dại, đan sâm, bạch truật, ý dĩ, trạch tả, địa liền, sói rừng Đây thuốc nhà nghiên cứu giới phát khả làm hạ cholesterol, điều chỉnh rối loạn lipid máu, dự phòng xơ vữa động mạch Một số thuốc sử dụng thuốc dân gian điều trị rối loạn lipid máu bạch truật, trạch tả (Sâm linh bạch truật tán gia giảm, Bán hạ bạch truật thiên ma thang), cốt khí củ (Nhân trần hao thang gia giảm), ý dĩ (Tiêu giao tán gia vị), … • Về kết sàng lọc tác dụng ức chế HMG-CoA reductase dược liệu Một số nghiên cứu giới tiến hành đánh giá tác dụng ức chế HMGCoA reductase nồng độ dược liệu khác Nghiên cứu Gholamhoseinian 42 A, Shahouzehi B, cộng cho thấy Quercus infectoria , Rosa damascena Myrtus communis nồng độ 150 µg/ml ức chế 60 % hoạt động enzym [33] Một nghiên cứu khác Iqbal D cộng khảo sát dịch chiết FPBA FPLM dược liệu Ficus palmata nồng độ 2-80 µg/ml [37] Vì vậy, đề tài này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase dược liệu nồng độ 100 µg/ml Nồng độ 100 µg/ml giới hạn nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn nghiên cứu khả ức chế enzym in vitro Các dược liệu có IC50 100 µg/ml xem dược liệu có tiềm Kết cho thấy nồng độ 100 µg/ml, số dịch chiết dược liệu thể khả ức chế enzym HMG-CoA reductase mạnh với 50% hoạt tính enzym Đảng sâm (% ức chế 64,8%), cốt khí củ (% ức chế 63,2%), trạch tả (% ức chế 53,2%), sói rừng (% ức chế 66,3%), me rừng (% ức chế 74,0%), phèn đen (% ức chế 72,2%) Me rừng phèn đen thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), chi Phlyllanthus hai dược liệu thể khả ức chế mạnh hoạt tính HMGCoA reductase số dược liệu đưa sàng lọc Điều gợi ý cho nghiên cứu mở rộng nghiên cứu sàng lọc với dược liệu thuộc chi Phlyllanthus, họ Euphorbiaceae Do chưa có điều kiện để tiến hành nghiên cứu sâu hơn, đánh giá khả ức chế tác dụng HMG-CoA reductase dược liệu tiềm nồng độ thấp hơn, vậy, kết đánh giá tác dụng ức chế HMG-CoA reductase dược liệu nồng độ 100 µg/ml sở để thực nghiên cứu tiếp theo, với nồng độ khảo sát thấp (50 µg/ml, 30 µg/ml, 20 µg/ml, 10 µg/ml …) dược liệu để xác định IC50, nghiên cứu sơ chế ức chế hoạt tính enzym hướng tới phát triển thuốc sử dụng điều trị rối loạn lipid máu 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian triển khai thực khóa luận thu số kết sau: Đã triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính enzym HMG-CoA reductase in vitro đĩa 96 giếng Costar UV 3635 với nồng độ enzym tối ưu 0,006 mg/ml, nồng độ chất HMG-CoA tối ưu 400 µM Thời gian theo dõi phản ứng từ đến 10 phút Nhiệt độ tối ưu phản ứng enzym 37oC nhiên nhiệt độ 30oC sử dụng để tiến hành khảo sát hoạt động enzym cho kết phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Bằng phương pháp triển khai, xác đinh IC50 atorvastatin 13,81 nM (8,39-22,75 nM) Trong 10 thuốc đem xác định khả ức chế enzym HMG-CoA reductase có thuốc thể khả ức chế mạnh với tỷ lệ % ức chế 50% nồng độ khảo sát 100 µg/ml Đảng sâm (ức chế 64,8%), cốt khí củ (ức chế 63,2%), trạch tả (ức chế 53,2%), sói rừng (ức chế 66,3%), me rừng (ức chế 74,0%), phèn đen (ức chế 72,2%) ĐỀ XUẤT Từ kết thu được, đề tài xin đề xuất: Tiếp tục triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro, xác định hệ số Km, xây dựng đồ thị Lineweaver - Burk Tiếp tục đánh giá khả ức chế HMG-CoA reductase dược liệu đảng sâm, cốt khí củ, trạch tả, sói rừng, phèn đen, me rừng nồng độ thấp 50 µg/ml, 10 µg/ml Xác định IC50 sơ chế ức chế HMG-CoA reductase dược liệu tiềm năng, hướng tới sử dụng điều trị rối loạn lipid máu 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan (2005), "Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm Linh chi Việt Nam qua số số lipid máu chuột cống", Tạp chí Nghiên cứu y học, Tập 38(Số 5), tr 42- 45 Bộ Y Tế (2005), Hướng dẫn chuẩn đốn điều trị bệnh nội tiết chuyển hóa, Nhà xuất Y học Hà Nội Bộ Y tế (2010), Hội thảo dự án bảo tồn thuốc cổ truyền, tổng kết 12 năm (1997-2009), Viện Dược liệu Bộ Y tế (2005), Hóa sinh học (Sách dùng đào tạo dược sĩ đại học), Nhà xuất Y học, Hà Nội Trần Thị Thu Hiền (1996), Nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu thuốc Nhị trần thang, Luận văn Thạc sỹ Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Văn Đình Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh (2007), Sinh lý bệnh miễn dịch (phần sinh lý bệnh học-sách đào tạo bác sỹ đa khoa), Nhà xuất Y học, tr 65-74 Trần Văn Kỳ (2004), "Chứng mỡ máu cao", Đông y điều trị bệnh rối loạn chuyển hóa nội tiết, Nhà xuất Mũi Cà Mau, tr 60-78 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Nguyễn Văn Mùi (2012), Enzym học, NXB Giáo dục Việt Nam, Hà Nội 10 Điền Phong Ô, Trương Thanh Vận (2010), Những thuốc thần dược Trung Quốc, Nhà xuất văn hóa thông tin, Hà Nội 11 Hoàng Trọng Quang (2008), Y học cổ truyền, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 442-467 12 Đỗ Trung Quân (2011), Bệnh nội tiết chuyển hóa (dùng cho bác sỹ học viên sau đại học), Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr 324-338 13 Hoàng Kháng Toàn, Chu Quốc Trường (1999), "Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh hội chứng rối loạn lipid máu thể phong đàm Bán hạ bạch truật thiên ma thang", Tạp chí YHCT, số 300, tr 9-1239 14 Nguyễn Lân Việt (2003), Thực hành bệnh tim mạch, Nhà xuất Y học, tr 85-95 TIẾNG ANH 15 Achuthan C., Padikkala J (1997), "Hypolipidemic effect of Alpinia galanga (Rasna) and Kaempferia galanga (Kachoori)", Indian journal of clinical biochemistry, 12(1), pp 55-58 16 Alberts A W (1988), "Discovery, biochemistry and biology of lovastatin", The American journal of cardiology, 62(15), pp J10-J15 17 Avcı G., Kupeli E., et al (2006), "Antihypercholesterolaemic and antioxidant activity assessment of some plants used as remedy in Turkish folk medicine", Journal of ethnopharmacology, 107(3), pp 418-423 18 Ballantyne C M., Andrews T C., et al (2001), "Correlation of non-highdensity lipoprotein cholesterol with apolipoprotein B: effect of hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on non-high-density lipoprotein cholesterol levels", The American journal of cardiology, 88(3), pp 265-269 19 Ballantyne C M., Herd J A., et al (1997), "Effects of lipid lowering therapy on progression of coronary and carotid artery disease", Current opinion in Lipidology, 8(6), pp 354-361 20 Baskaran G., Salvamani S., et al (2015), "HMG-CoA reductase inhibitory activity and phytocomponent investigation of Basella alba leaf extract as a treatment for hypercholesterolemia", Drug design, development and therapy, 9, pp 509 21 Björnsson E S (2016), "Hepatotoxicity of statins and other lipid-lowering agents", Liver International 22 Brouwers M C., Van Greevenbroek M M., et al (2012), "The genetics of familial combined hyperlipidaemia", Nature Reviews Endocrinology, 8(6), pp 352-362 23 Chetty K N., Calahan L., et al (2003), "Garlic attenuates hypercholesterolemic risk factors in olive oil fed rats and high cholesterol fed rats", Pathophysiology, 9(3), pp 127-132 24 Congkun X., Rui W., et al (2009), "Study on effect of Polygonum mutiflorum extract on lipid metabolism and its anti-oxidation in SD rats with hyperlipemia", China Pharmaceuticals, 18(24), pp 19-20 25 Dansette P., Jaoen M., et al (2000), "HMG-CoA reductase activity in human liver microsomes: comparative inhibition by statins", Experimental and Toxicologic Pathology, 52(2), pp 145-148 26 De Groot L., Chrousos G., et al (2000), "Cholesterol lowering drugs-Endotext" 27 Dou X.-b., Wo X.-d., et al (2008), "Progress of research in treatment of hyperlipidemia by monomer or compound recipe of Chinese herbal medicine", Chinese Journal of Integrative Medicine, 14(1), pp 71-75 28 Edwards P., Lemongello D., et al (1979), "Improved methods for the solubilization and assay of hepatic 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase", Journal of lipid research, 20(1), pp 40-46 29 Endo A (2004), "The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors", Atherosclerosis supplements, 5(3), pp 67-80 30 Endo A., Kuroda M., et al (1976), "Competitive inhibition of 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase by ML-236A and ML-236B fungal metabolites, having hypocholesterolemic activity", FEBS letters, 72(2), pp 323-326 31 Eriksson M., Angelin B., et al (2005), "Risk for fatal statin-induced rhabdomyolysis as a consequence of misinterpretation of'evidence-based medicine'", Journal of internal medicine, 257(3), pp 313 32 Friesen J A., Rodwell V W (2004), "The 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A (HMG-CoA) reductases", Genome biology, 5(11), pp 248 33 Gholamhoseinian A., Shahouzehi B., et al (2010), "Inhibitory activity of some plant methanol extracts on 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase", IJP-International Journal of Pharmacology, 6(5), pp 705-711 34 Ginghina C., Bejan I., et al (2011), "Modern risk stratification in coronary heart disease", Journal of medicine and life, 4(4), pp 377 35 Golomb B A., Evans M A (2008), "Statin adverse effects", American Journal of Cardiovascular Drugs, 8(6), pp 373-418 36 Honda A., Mizokami Y., et al (2007), "Highly sensitive assay of HMG-CoA reductase activity by LC-ESI-MS/MS", Journal of lipid research, 48(5), pp 1212-1220 37 Iqbal D., Khan M S., et al (2014), "In vitro screening for β-hydroxy-βmethylglutaryl-coa reductase inhibitory and antioxidant activity of sequentially extracted fractions of Ficus palmata Forsk", BioMed research international 38 Istvan E (2003), "Statin inhibition of HMG-CoA reductase: a 3-dimensional view", Atherosclerosis Supplements, 4(1), pp 3-8 39 Istvan E S., Deisenhofer J (2000), "The structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)Molecular and Cell Biology of Lipids, 1529(1), pp 9-18 40 Istvan E S., Palnitkar M., et al (2000), "Crystal structure of the catalytic portion of human HMG-CoA reductase: insights into regulation of activity and catalysis", The EMBO journal, 19(5), pp 819-830 41 Jamil S., Iqbal P (2004), "Rhabdomyolysis induced by a single dose of a statin", Heart, 90(1), pp e3-e3 42 Jeevangi S., Manjunath S., et al (2013), "A study of anti-hyperlipidemia, hypolipedimic and anti-atherogenic activity of fruit of Emblica officinalis (amla) in high fat fed albino rats", International Journal of Medical Research & Health Sciences, 1(2), pp 70-77 43 Jeong J.-S., Kwon H.-S (2017), "Prevalence and clinical characteristics of dyslipidemia in Koreans", Endocrinology and Metabolism, 32(1), pp 30-35 44 Ji W., Gong B (2008), "Hypolipidemic activity and mechanism of purified herbal extract of Salvia miltiorrhiza in hyperlipidemic rats", Journal of ethnopharmacology, 119(2), pp 291-298 45 Jones P H., Hunninghake D B., et al (2004), "Effects of rosuvastatin versus atorvastatin, simvastatin, and pravastatin on non-high-density lipoprotein cholesterol, apolipoproteins, and lipid ratios in patients with hypercholesterolemia: additional results from the STELLAR trial", Clinical therapeutics, 26(9), pp 1388-1399 46 Jørgensen T., Capewell S., et al (2013), "Population-level changes to promote cardiovascular health", European journal of preventive cardiology, 20(3), pp 409-421 47 Joseph D (2008), Pharmacotherapy: A pathophysiologic approach, McGrawHill Medical 48 Jung K.-A., Song T.-C., et al (2005), "Cardiovascular protective properties of kiwifruit extracts in vitro", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28(9), pp 1782-1785 49 Kahri J., Valkonen M., et al (2005), "Rhabdomyolysis in a patient receiving atorvastatin and fluconazole", European journal of clinical pharmacology, 60(12), pp 905-907 50 Kim H.-G., Yoo S.-R., et al (2011), "Antioxidant effects of Panax ginseng CA Meyer in healthy subjects: a randomized, placebo-controlled clinical trial", Food and Chemical Toxicology, 49(9), pp 2229-2235 51 Koo M., Kim S., et al (2008), "3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMGCoA) reductase inhibitory effect of Vitis vinifera", Fitoterapia, 79(3), pp 204206 52 Langdon R B., Counsell R E (1976), "Determination of the michaelismenten constant for beta-hydroxy-beta-methylglutaryl coenzyme A reductase Demonstration of a substrate affinity 10-fold greater than previously reported", Journal of Biological Chemistry, 251(18), pp 5820-5823 53 Lee J., Chae K., et al (2008), "Regulation of obesity and lipid disorders by herbal extracts from Morus alba, Melissa officinalis, and Artemisia capillaris in high-fat diet-induced obese mice", Journal of ethnopharmacology, 115(2), pp 263-270 54 Liang G., Kao H., et al (2015), "Optimization, validation and application of spectrophotometric assay for 3-Hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase activity", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 14(4), pp 671-677 55 Linjie J (2011), "The preventive effects of Atractylodes Macrocephala Koidz on the regulation of serum lipid levels and protection of liver in rat [J]", Journal of Mathematical Medicine, 4, pp 008 56 Liu W., Zheng Y., et al (2014), "Hypoglycemic, hypolipidemic and antioxidant effects of Sarcandra glabra polysaccharide in type diabetic mice", Food & function, 5(11), pp 2850-2860 57 Maruthappan V., Shree K S (2010), "Effects of Phyllanthus reticulatus on lipid profile and oxidative stress in hypercholesterolemic albino rats", Indian journal of pharmacology, 42(6), pp 388 58 McClure D L., Valuck R J., et al (2007), "Systematic review and metaanalysis of clinically relevant adverse events from HMG CoA reductase inhibitor trials worldwide from 1982 to present", Pharmacoepidemiology and drug safety, 16(2), pp 132-143 59 McKenney J M (2003), "Pharmacologic characteristics of statins", Clinical cardiology, 26(S3), pp 32-38 60 Megalli S., Aktan F., et al (2005), "Phytopreventative anti-hyperlipidemic effects of Gynostemma pentaphyllum in rats", J Pharm Pharm Sci, 8(3), pp 507-515 61 Mozzicafreddo M., Cuccioloni M., et al (2010), "Rapid reverse phase-HPLC assay of HMG-CoA reductase activity", Journal of lipid research, 51(8), pp 2460-2463 62 Natali F., Siculella L., et al (2007), "Oleic acid is a potent inhibitor of fatty acid and cholesterol synthesis in C6 glioma cells", Journal of lipid research, 48(9), pp 1966-1975 63 Nicolau G., Shefer S., et al (1974), "Determination of hepatic 3-hydroxy-3methylglutaryl CoA reductase activity in man", Journal of lipid research, 15(1), pp 94-98 64 Pallottini V., Guantario B., et al (2008), "Regulation of HMG-CoA reductase expression by hypoxia", Journal of cellular biochemistry, 104(3), pp 701-709 65 Peng W., Qin R., et al (2013), "Botany, phytochemistry, pharmacology, and potential application of Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.: a review", Journal of ethnopharmacology, 148(3), pp 729-745 66 Perchellet J.-P H., Perchellet E M., et al (2009), "Novel synthetic inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase activity that inhibit tumor cell proliferation and are structurally unrelated to existing statins", International journal of molecular medicine, 24(5), pp 633 67 Preiss B (2012), Regulation of HMG-CoA reductase, Elsevier, pp 68 Reddy Palvai V., Urooj A (2014), "Inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (ex vivo) by Morus indica (Mulberry)", Chinese Journal of Biology 69 Roitelman J., Bar-Nun S., et al (1991), "Involvement of calcium in the mevalonate-accelerated degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase", Journal of Biological Chemistry, 266(24), pp 16085-16091 70 Salvamani S., Gunasekaran B., et al (2016), "Anti-HMG-CoA Reductase, Antioxidant, and Anti-Inflammatory Activities of Amaranthus viridis leaf extract as a potential treatment for hypercholesterolemia", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 71 Schachter M (2005), "Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins: an update", Fundamental & clinical pharmacology, 19(1), pp 117-125 72 Schonewille M., de Boer J F., et al (2016), "Statins increase hepatic cholesterol synthesis and stimulate fecal cholesterol elimination in mice", Journal of Lipid Research, 57(8), pp 1455-1464 73 Sehayek E., Butbul E., et al (1994), "Enhanced cellular metabolism of very low density lipoprotein by simvastatin A novel mechanism of action of HMGCoA reductase inhibitors", European journal of clinical investigation, 24(3), pp 173-178 74 Sham T T., Chan C O., et al (2014), "A review on the traditional Chinese medicinal herbs and formulae with hypolipidemic effect", BioMed research international 75 Sharpe L J., Brown A J (2013), "Controlling cholesterol synthesis beyond 3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR)", Journal of Biological Chemistry, 288(26), pp 18707-18715 76 Soejarto D D., Gyllenhaal C., et al (1999), "Studies on biodiversity of Vietnam and Laos: the UIC-based ICBG program", Pharmaceutical Biology, 37(1), pp 100-113 77 Stancu C., Sima A (2001), "Statins: mechanism of action and effects", Journal of cellular and molecular medicine, 5(4), pp 378-387 78 Stein E A., Lane M., et al (1998), "Comparison of statins in hypertriglyceridemia", The American journal of cardiology, 81(4), pp 66B69B 79 Steinberg D (2002), "Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime", Nature medicine, 8(11), pp 1211-1217 80 Sung J H., Sung-Joon L., et al (2004), "Isoflavones inhibit 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase in vitro", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 68(2), pp 428-432 81 Wang J., Sun J.-Y., et al (2015), "Optimization, validation and application of an assay for the activity of HMG-CoA reductase in vitro by LC–MS/MS", Journal of Pharmaceutical Analysis, 5(6), pp 383-388 82 Wang L., Sun J., et al (2012), "Protective effect of polyphenols extract of adlay (Coix lachryma-jobi L var ma-yuen Stapf) on hypercholesterolemiainduced oxidative stress in rats", Molecules, 17(8), pp 8886-8897 83 Wong J P.-C., Wijaya S., et al (2014), "Crude ethanol extract of Pithecellobium ellipticum as a potential lipid-lowering treatment for Hypercholesterolaemia", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 84 Wu C., Zhang X., et al (2014), "The caffeoylquinic acid-rich Pandanus tectorius fruit extract increases insulin sensitivity and regulates hepatic glucose and lipid metabolism in diabetic db/db mice", The Journal of nutritional biochemistry, 25(4), pp 412-419 85 Xie W., Wang W., et al (2007), "Hypolipidemic mechanisms of Ananas comosus L leaves in mice: different from fibrates but similar to statins", Journal of pharmacological sciences, 103(3), pp 267-274 86 Xiong-Wei H (2009), "The clinical control study on the effect of Rhizoma Alismatis on blood fat in health volunteers", Journal of Chongqing Medical University, 34(3), pp 376-378 87 Yoshie F., Iizuka A., et al (2004), "Effects of Dai-saiko-to (Da-Chai-HuTang) on plasma lipids and atherosclerotic lesions in female heterozygous heritable Kurosawa and Kusanagi-hypercholesterolemic (KHC) rabbits", Pharmacological research, 50(3), pp 223-230 88 Zahra B S., Ashrafi M., et al (2016), "Mevalonate Pathway and Human Cancers", Current molecular pharmacology ... qua ức chế enzym HMG- CoA reductase, thực đề tài ? ?Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế HMG- CoA reductase in vitro áp dụng sàng lọc số dược liệu? ?? với hai mục tiêu: Triển khai phương pháp. .. chất HMG- CoA thích hợp cho khảo sát - Thẩm định phương pháp triển khai thông qua đánh giá tác dụng ức chế HMG- CoA reductase in vitro atorvastatin • Áp dụng phương pháp để đánh giá tác dụng ức chế. .. khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym HMG- CoA reductase in vitro đĩa 96 giếng Áp dụng phương pháp triển khai để sàng lọc tác dụng ức chế HMG- CoA reductase số dược liệu có tiềm điều