BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU LIÊN MÃ SINH VIÊN: 1201313 XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM T-2 VÀ HT-2 TRONG NGŨ CỐC VÀ SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU LIÊN MÃ SINH VIÊN: 1201313 XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC TỐ VI NẤM T-2 VÀ HT-2 TRONG NGŨ CỐC VÀ SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Nguyên Hà Th.S Nguyễn Thị Hà Bình Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy cô giáo TS Trần Nguyên Hà, TS Trần Cao Sơn Th.S Nguyễn Thị Hà Bình ln ln tận tâm hướng dẫn, động viên giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể anh chị công tác Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia hết lịng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đặc biệt thầy giáo mơn Hóa phân tích – độc chất với tri thức tâm huyết, truyền đạt cho em kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn người bạn, người anh, chị, em – người bên, quan tâm, giúp đỡ động viên em vượt qua khó khăn sống học tập, động lực để em học tập, rèn luyện nghiên cứu Trường Đại học Dược Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Đào Thu Liên i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan T-2, HT-2 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Cấu trúc, tính chất hóa lý, độ ổn định 1.1.3 Độc tính 1.1.4 Các quy định hàm lượng T-2, HT-2 1.2 Tổng quan phương pháp xác định T-2, HT-2 1.2.1 Phương pháp chiết – làm T-2 HT-2 1.2.1.1 Phương pháp chiết T-2 HT-2 1.2.1.2 Phương pháp làm T-2 HT-2 10 1.2.2 Phương pháp phân tích T-2 HT-2 12 1.2.2.1 Các phương pháp phổ biến để xác định T-2 HT-2 12 1.2.2.2 Tổng quan tóm lược sắc ký lỏng khối phổ 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 18 ii 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.1.1 Chất chuẩn 18 2.2.1.2 Hóa chất dung môi 18 2.2.2 Trang thiết bị 19 2.2.2.1 Thiết bị 19 2.2.2.2 Dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.3.1 Khảo sát điều kiện xác định độc tố T-2, HT-2 LC-MS/MS 19 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20 2.3.3 Thẩm định phương pháp 20 2.3.4 Đánh giá hàm lượng độc tố T-2 HT-2 số đối tượng ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 20 2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu 21 2.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 21 2.4.4 Phương pháp thẩm định 22 2.4.4.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 22 2.4.4.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 22 2.4.4.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 23 2.4.4.4 Độ lặp lại độ thu hồi 23 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 iii Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách xác định độc tố T-2 HT-2 LCMS/MS 25 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ 25 3.1.1.1 Lựa chọn ion mẹ ion 25 3.1.1.2 Tối ưu hóa điều kiện MS 27 3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký lỏng 28 3.1.2.1 Chọn pha tĩnh 28 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 29 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 31 3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu 31 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 32 3.2.3 Khảo sát dung môi chiết qua bước làm 34 3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng 36 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 38 3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 38 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 40 3.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 42 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 43 3.4 Kết xác định độc tố T-2 HT-2 ngũ cốc sản phẩm từ ngũ cốc 45 3.5 Bàn luận 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 iv Kết luận 47 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu AOAC APCI COMTAM Panel EFSA ESI FAO GC HPLC JECFA LC LOAEL LOD LOQ MS NOAEL R(%) RSD(%) SCF SD SPE WHO Tiếng anh Tiếng việt Association of Official Analytical Communities Atmospheric pressure chemical ionization The panel on contaminants in the food chain European food safety authority Electronspray ionization Food and agriculture organization of the united nation Gas chromatography High performance liquid chromatography Joint Expert committee of food additives Liquid chromatography Lowest observed adverse affect level Limit of detection Limit of quantification Mass spectrometry No observed adverse affect level Recovery Relative standard deviaton Scientific committee for food Standard Deviation Solid Phase Extraction World health organization Hiệp hội nhà hóa phân tích thức Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí Hội đồng chất nhiễm chuỗi thực phẩm Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu Ion hóa phun điện tử Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên hiệp quốc vi Sắc ký khí Sắc ký lỏng hiệu cao Ủy ban chuyên gia Quốc tế phụ gia thực phẩm Sắc ký lỏng Mức tác hại thấp quan sát Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối phổ Mức tác hại không quan sát Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn tương đối Ủy ban khoa học thực phẩm Độ lệch chuẩn Chiết pha rắn Tổ chức y tế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất hóa lý T-2, HT-2 Bảng 1.2 Giới hạn tối đa cho phép Châu Âu độc tố T-2 HT-2 thực phẩm Bảng 1.3 EFSA thống kê giá trị NOAELs LOAELs tổng hàm lượng T2 HT-2 với số ước tính LB (giới hạn dưới), UB (giới hạn trên) loài động vật khác Bảng 1.4 Một số phương pháp chiết, làm phân tích T-2, HT-2 mẫu khác 13 Bảng 1.5 Một số ưu nhược điểm phương pháp xác định T-2, HT-2 14 Bảng 1.6 Một số phương pháp xác định T-2, HT-2 thực phẩm LCMS/MS 15 Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích 22 Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích độc tố T-2 HT-2 ESI/MS/MS 25 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS để phân tích độc tố T-2 HT-2 28 Bảng 3.3 Khảo sát hệ dung môi pha động 29 Bảng 3.4 Chương trình gradient phân tích T-2, HT-2 31 Bảng 3.5 Tỷ lệ ion độc tố T-2 HT-2 40 Bảng 3.6 LOD LOQ độc tố T-2 HT-2 41 Bảng 3.7 Đường chuẩn hệ số tương quan tuyến tính độc tố T-2 HT-2 mẫu ngô 42 Bảng 3.8 Độ lặp lại thu hồi độc tố T-2 HT-2 nồng độ 50 µg/kg, 100 µg/kg, 200 µg/kg 43 Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội 45 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo T-2 (R1=OAc) HT-2 (R1=OH) Hình 1.2 Mơ hình hệ thống LC-MS/MS 16 Hình 1.3 Bộ phân tích khối ba tứ cực 17 Hình 3.1 Phổ khối MS T-2 HT-2 sau bắn phá ion 26 Hình 3.2 Sắc ký đồ độc tố T-2 HT-2 nồng độ chuẩn 100 ng/ml 30 Hình 3.3 Khảo sát ban đầu kỹ thuật chiết làm 32 Hình 3.4 Sắc ký đồ độc tố T-2 HT-2 với dung mơi chiết DM1 33 Hình 3.5 So sánh tỷ lệ dung môi chiết 34 Hình 3.6 So sánh tỷ lệ dung môi chiết qua bước làm 35 Hình 3.7 Sắc ký đồ T-2 HT-2 chiết qua DM2 cho qua cột MycoSep 227 35 Hình 3.8 Khảo sát ảnh hưởng mẫu ngơ đến tín hiệu T-2, HT-2 36 Hình 3.9 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 37 Hình 3.10 Sắc ký đồ độc tố T-2 mẫu trắng (đỗ), mẫu chuẩn dung môi 50 ng/mL mẫu trắng (đỗ) thêm chuẩn 50 ng/mL dịch cuối 38 Hình 3.11 Sắc ký đồ độc tố HT-2 mẫu trắng (đỗ), mẫu chuẩn dung môi 50 ng/mL mẫu trắng (đỗ) thêm chuẩn 50 ng/mL dịch cuối 39 Hình 3.12 Sắc đồ độc tố T-2 HT-2 LOD (3 µg/kg) 41 Hình 3.13 Đường chuẩn T-2, HT-2 mẫu 42 Hình 3.14 Sắc ký đồ độc tố T-2 mẫu ngơ đỗ thêm chuẩn 50 µg/kg (n=6) 44 viii 23 Lattanzio VM, Solfrizzo M and Visconti A (2009), “Enzymatic hydrolysis of T-2 toxin for the quantitative determination of total T-2 and HT-2 toxins in cereals”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 395, 1325-1334 24 Majerus P, Hain J and Scheer M (2008), “T-2 and HT-2 toxin analysis in cereals and cereal products following IAC cleanup and determination via GC-ECD after derivatization”, Mycotoxin Research, 24, 24-30 25 Mark Busman, Stephen M Poling, and Chris M Maragos (2011), “Observation of T-2 Toxin and HT-2 Toxin Glucosides from Fusarium sporotrichioides by Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)”, National Center for Biotechnology Information, 3(12), 1554-1568 26 Marvin C Mcmaster (2005), LC/MS a Practical user’s guide, John Wiley & Sons 27 Matsumoto H, Ito T and Ueno Y (1978), “Toxicological approaches to the metabolites of Fusaria 12 Fate and distribution of T-2 toxin in mice”, Japanese Journal of Experimental Medicine, 48, 393- 399 28 Meneely JP, Ricci F, van Egmond HP and Elliott CT (2011b), “Current methods of analysis for the determination of trichothecene mycotoxins in food”, Trends in Analytical Chemistry, 30, 192-203 29 Meneely JP, Ricci F, Vesco S, Abouzied M, Sulyok, Krska R and Elliott CT (2011a), “A comparative study of qualitative immunochemical screening assays for the combined measurement of T-2/HT-2 in cereals and cereal-based products”, World Mycotoxin Journal, 4, 385-394 30 Meneely JP, Sulyok M, Baumgartner S, Krska R and Elliott CT (2010), “A rapid optical immunoassay for the screening of T-2 and HT-2 toxin in cereals and maize-based baby food”, Talanta, 81, 630- 636 31 Monbaliu S, Van Poucke C, Detavernier C, Dumoulin F, Van De Velde M, Schoeters E, Van Dyck S, Averkieva O, Van Peteghem C and De Saeger S (2010), “Occurrence of mycotoxins in feed as analyzed by a multi-mycotoxin LC-MS/MS method”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 66-71 32 Romero-Gonzalez R, Frenich AG, Vidal JL and Aguilera-Luiz MM (2010), “Determination of ochratoxin A and T-2 toxin in alcoholic beverages by hollow fiber liquid phase microextraction and ultra highpressure liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry”, Talanta, 82, 171-176 33 Rukmini C, Prasad JS and Rao K (1980), “Effects of feeding T-2 toxin to rats and monkeys”, Food and Cosmetics Toxicology, 18, 267 -269 34 SCF (Scientific Committee for Food) (2001), “Opinion of the Scientific Committee for Food on Fusarium toxins Part 5: T-2 toxin and HT-2 toxin” 35 Suproniene S, Justesen AF, Nicolaisen M, Mankeviciene A, Dabkevicius Z, Semaskiene R and Leistrumaite A (2010), “Distribution of trichothecene and zearalenone producing Fusarium species in grain of different cereal species and cultivars grown under organic farming conditions in Lithuania”, Annals of Agricultual and Environment Medicine, 17, 79-86 36 Trebstein A, Seefelder W, Lauber U and Humpf HU (2008) “Determination of T-2 and HT-2 toxins in cereals including oats after immunoaffinity cleanup by liquid chromatography and fluorescence detection”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 4968-4975 37 V M T Lattanzio, M Solfrizzo & A Visconti (2014), “Determination of trichothecenes in cereals and cerealbased products by liquid chromatography–tandem mass spectrometry”, Taylor & Francis, 25(3), 320-330 38 Veronica M T Lattanzio, Biancamaria Ciasca, Miriam Haidukowski, Alessandro Infantino, Angelo Viscontia and Michelangelo Pascalea (2013), “Mycotoxin profile of Fusarium langsethiae isolated from wheat in Italy: production of type-A trichothecenes and relevant glucosyl derivatives”, Journal of Mass Spectrometry, 48, 1291-1298 39 Veronica M T Lattanzio, Stefania Della Gatta , Michele Suman and Angelo Visconti (2011),” Development and in‐house validation of a robust and sensitive solid‐phase extraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the quantitative determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2, ochratoxin A, deoxynivalenol, zearalenone, T‐2 and HT‐ toxins in cereal‐based foods”, Rapid Communication in Mass Spectrometry, 25, 1869-1880 40 Veronica M.T Lanttanzio, Michelangelo Pascale, Angelo Visconti (2009), “Current analytical methods for trichothecene mycotoxins in cereals”, Trends in Analytical Chemistry, 28, 758-767 41 Visconti A, Lattanzio VMT, Pascale M and Haidukowski M (2005), “Analysis of T-2 and HT-2 toxins in cereal grains by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography with fluorescence detection”, Journal of Chromatography A, 1075, 151-158 42 Wu Q, Dohnal V, Huang L, Kuca K and Yuan Z (2010), “Metabolic pathways of trichothecenes”, Drug Metabolism Reviews, 42, 250-267 43 Yoshizawa T, Sakamoto T and Kuwamura K (1985), “Structures of the deepoxytrichothecene metabolites from 3‟-hydroxy HT-2 toxin and T-2 tetraol in rats”, Applied and Environmental Microbiology, 50, 676-679 PHỤ LỤC Sắc ký đồ chọn quy trình xử lý mẫu (sắc ký đồ độc tố T-2 HT-2 có nồng độ lý thuyết 100 ng/mL quy trình xử lý mẫu khác nhau) T-2 HT-2 MycoSep 227 T-2 HT-2 QuEChERS T-2 HT-2 SPE HLB Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril (100) T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (84:16) T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (70:30) T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (50:50) Một số sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết qua bước làm T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (95:5) T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (84:16) T-2 HT-2 Hỗn hợp dung môi chiết acetonitril : nước (90:10) Một số sắc ký đồ khảo sát nồng độ chuẩn khác T-2 HT-2 T-2 10 ppb T-2 20 ppb T-2 50 ppb T-2 100 ppb T-2 200 ppb T-2 150 ppb T-2 300 ppb HT-2 50 ppb HT-2 100 ppb HT-2 150 ppb HT-2 300 ppb Một số sắc đồ thêm chuẩn T-2 nồng độ khác 50 ppb 100 ppb 200 ppb Mẫu thực tế N1 N2 N3 Đ1 Đ2 Đ3 B1 B2 B3 ...BỘ Y T? ?? TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THU LIÊN MÃ SINH VI? ?N: 120 1313 XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ĐỘC T? ?? VI NẤM T- 2 VÀ HT -2 TRONG NGŨ CỐC VÀ SẢN PHẨM NGŨ CỐC BẰNG SẮC KÍ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN T? ? ?T NGHIỆP... thực t? ?? đặc t? ?nh ưu vi? ? ?t kỹ thu? ?t LC-MS/MS phân t? ?ch, tiến hành đề t? ?i: ? ?Xác định đồng thời độc t? ?? vi nấm T- 2 HT -2 ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định. .. lượng T- 2, HT -2 1 .2 T? ??ng quan phương pháp xác định T- 2, HT -2 1 .2. 1 Phương pháp chi? ?t – làm T- 2 HT -2 1 .2. 1.1 Phương pháp chi? ?t T -2 HT -2 1 .2. 1 .2 Phương pháp làm T- 2 HT -2