BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KHÚC HOÀNG PHƯƠNG Mã sinh viên: 1201460 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CLEISTANTOXIN PHÂN LẬP TỪ QUẢ CỦA CÂY CHÀ CHÔI (CLEISTANTHUS TONKINENSIS) LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN KHĨA LUẬN TƠT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Lâm Hồng HVCH Đào Tú Anh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Nguyễn Lâm Hồng Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất HVCH Đào Tú Anh, người trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện mặt cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Bộ mơn Hóa phân tích - Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm, giúp đỡ thời gian vừa qua Xin cảm ơn Ban lãnh đạo, anh chị Phòng Tổng hợp Hữu cơ, Viện Hóa sinh biển, đặc biệt TS Đồn Thị Mai Hương ThS Lê Cơng Vinh tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi thời gian tơi thực khóa luận phịng Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo cán nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, người dạy bảo giúp đỡ suốt năm năm học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, người bên động viên, cổ vũ giúp đỡ để tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Khúc Hoàng Phương MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thực vật Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Phyllanthaceae) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Họ Diệp hạ châu (Phyllanthaceae) 1.1.3 Chi Cleistanthus 1.1.4 Loài Cleistanthus tonkinensis 1.1.4.1 Đặc điểm thực vật 1.1.4.2 Thành phần hóa học 1.1.4.3 Hoạt tính sinh học 1.2 Hợp chất cleistantoxin 1.2.1 Sơ lược hợp chất cleistantoxin 1.2.2 Các nghiên cứu trước hợp chất cleistantoxin 1.3 Chất chuẩn quy trình thiết lập chất chuẩn 1.3.1 Khái quát chất chuẩn 1.3.2 Quy trình thiết lập chất chuẩn 1.4 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.4.1 Khái niệm 1.4.2 Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao 10 1.4.3 Một số thơng số đặc trưng cho q trình sắc ký 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Nguyên liệu 15 2.1.2 Hóa chất, dung mơi, chất chuẩn 15 2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Phân lập tinh chế cleistantoxin từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Phyllanthaceae) 17 2.2.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất tinh chế 17 2.2.3 Xác định tạp chất liên quan cleistantoxin tinh chế HPLC/DAD 17 2.2.4 Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế HPLC/DAD 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phân lập tinh chế cleistantoxin từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Phyllanthaceae) 18 2.3.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất tinh chế 18 2.3.3 Xác định tạp chất liên quan cleistantoxin tinh chế 18 2.3.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 18 2.3.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18 2.3.4 Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế 20 2.3.4.1 Xây dựng phương pháp 20 2.3.4.2 Thẩm định phương pháp 21 2.4 Xử lý kết 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Phân lập tinh chế cleistantoxin từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Phyllanthaceae) 24 3.2 Xây dựng liệu nhận dạng chất tinh chế 28 3.2.1 Phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-VIS) 28 3.2.2 Phổ hồng ngoại (IR) 28 3.2.3 Phổ khối lượng (MS) 29 3.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 30 3.3 Xác định tạp chất liên quan cleistantoxin tinh chế HPLC/DAD 32 3.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 32 3.3.1.1 Khảo sát lựa chọn pha động 32 3.3.1.2 Chọn bước sóng phát 34 3.3.2 Xây dựng phương pháp 34 3.3.3 Thẩm định phương pháp 35 3.3.4 Kết xác định tạp chất liên quan cleistantoxin tinh chế 37 3.3.5 Khảo sát độ ổn định dung dịch thử 1500 ppm 38 3.4 Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế HPLC/DAD 40 3.4.1 Xây dựng phương pháp 40 3.4.2 Thẩm định phương pháp 41 3.4.3 Kết xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril APG Angiosperm Phylogeny Group ARS ASEAN Reference Standards ASEAN Association of Southeast Asian Nations CTF Phân đoạn d Độ chia nhỏ DAD Diode Array Detector EPCRS European Pharmacopeia Reference Substances FID Flame Ionization Detector HL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography ICH International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals of Human Use ICP Inductively Coupled Plasma ICRS International Chemical Reference Substances IR Infrared Radiation IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantitation m Khối lượng MeOH Methanol MS Mass Spectroscopy N Số đĩa lý thuyết NIST National Institute of Standards and Technology NMR Nuclear Magnetic Resonance N/A Not Available RS Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation δ Độ chuyển dịch hóa học S Diện tích SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng S/N Signal/Noise TCCS Tiêu chuẩn sở TLC Thin Layer Chromatography USPRS United States Pharmacopeia Reference Substances UV-VIS Ultraviolet - Visible Spectroscopy WHO World Health Organization DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Nội dung Dữ liệu NMR chất tinh chế (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, CDCl3) Trang 31 3.2 Kết xác định giới hạn tạp chất liên quan 38 3.3 Kết khảo sát độ ổn định dung dịch thử 1500 ppm 39 3.4 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống 44 3.5 Cách pha dung dịch thẩm định khoảng tuyến tính 45 3.6 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 45 3.7 Cách pha dung dịch thẩm định độ 47 3.8 Kết khảo sát độ 49 3.9 Kết khảo sát độ lặp lại 50 3.10 Kết khảo sát độ ổn định dung dịch thử 100 ppm 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Nội dung Hình Trang 1.1 Tiêu Cleistanthus tonkinensis 1.2 Quả Cleistanthus tonkinensis 1.3 Công thức cấu tạo cleistantoxin 1.4 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao 10 2.1 Kết giám định định danh loài Cleistanthus tonkinensis 15 2.2 Cách xác định tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) 20 3.1 Quy trình phân lập tinh chế cleistantoxin 27 3.2 Phổ hấp thụ UV-VIS dung dịch 7B (CHCl3) 28 3.3 Phổ IR (KBr) chất tinh chế 29 3.4 Phổ khối lượng (ESI-MS) chất tinh chế 29 3.5 Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) chất tinh chế 30 3.6 Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) chất tinh chế 30 3.7 Công thức cấu tạo cleistantoxin 32 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động (hỗn hợp nước acetonitril tỷ lệ 45:55) Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động (hỗn hợp đệm phosphat pH = 2,5 nước tỷ lệ 45:55) Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 1500 ppm với pha động (hỗn hợp đệm phosphat pH = 6,8 nước tỷ lệ 45:55) Phổ hấp thụ UV-VIS cleistantoxin Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp xác định tạp chất liên quan Sắc ký đồ dung dịch cleistantoxin 0,5 μg/ml 33 33 33 34 36 37 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế Kết xác định độ tinh khiết pic cleistantoxin dung dịch thử Phổ 3D dung dịch thử Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ Sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử định lượng cleistantoxin 42 42 43 46 52 Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng Hình 3.14: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế Hình 3.15: Kết xác định độ tinh khiết pic cleistantoxin dung dịch thử 42 Hình 3.16: Phổ 3D dung dịch thử * Nhận xét: Kết SKĐ dung dịch cho thấy, dung môi pha động tạp chất không ảnh hưởng đến pic cleistantoxin Các pic chất phân tích tinh khiết tách rời khỏi tạp chất Phương pháp đạt yêu cầu độ đặc hiệu  Độ phù hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch sau theo quy trình phân tích: - Dung dịch chuẩn: Cân 10,30 mg cleistantoxin chuẩn gốc vào bình định mức 20 ml, siêu âm 15 phút định mức vừa đủ thể tích pha động Hút xác 2,000 ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa đủ thể tích để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm - Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại lần, ghi lại SKĐ, xác định thông số thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyêt, hệ số đối xứng pic chính, tính RSD thông số Yêu cầu: - Trên SKĐ thu từ dung dịch chuẩn: Số đĩa lý thuyết (N) không nhỏ 2000 hệ số đối xứng (T) pic phải khoảng 0,8 - 1,5 Giá trị RSD thời gian lưu (tR) pic phải ≤ 1,0% RSD diện tích pic phải ≤ 2,0% 43 Kết quả: trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4: Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết (đĩa) 8,621 921,08 0,99 5344 8,626 922,56 0,99 5387 8,651 922,64 0,99 5229 8,624 924,83 0,99 5183 8,600 934,94 0,99 5247 8,586 927,53 0,99 5235 Trung bình 8,618 925,60 0,99 5271 RSD (%) 0,3 0,6 Yêu cầu RSD ≤ 1,0% RSD ≤ 2,0% 0,8 ≤ T ≤ 1,5 N ≥ 2000 Đạt yêu cầu Kết luận * Nhận xét: Kết cho thấy hệ thống HPLC sử dụng cho sắc ký đồ có pic chất phân tích cân đối, thời gian lưu diện tích pic có độ lặp lại cao (RSD < 1,0%) Như vậy, hệ thống sắc ký phù hợp để tiến hành phân tích định lượng  Khoảng tuyến tính: Tiến hành thực nghiệm sau: - Chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ 50 μg/ml, 75 μg/ml, 100 μg/ml, 125 μg/ml 150 μg/ml tương ứng với khoảng 50%, 75%, 100%, 125% 150% nồng độ định lượng - Pha dung dịch chuẩn gốc: Cân 9,83 mg cleistantoxin chuẩn gốc vào bình định mức 20 ml Siêu âm 15 phút định mức vừa đủ thể tích pha động Lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm 44 - Hút lượng thích hợp dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức, pha lỗng vừa đủ thể tích theo bảng 3.5 Bảng 3.5: Cách pha dung dịch thẩm định khoảng tuyến tính Dung dịch 50% 75% 100% 125% 150% Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml) 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 Dung mơi pha lỗng Pha động Thể tích bình định mức (ml) 10,00 - Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn, ghi lại SKĐ, xây dựng phương trình hồi quy, xác định hệ số tương quan tuyến tính nồng độ cleistantoxin diện tích pic thu SKĐ Yêu cầu: - Hệ số tương quan tuyến tính (R) phải ≥ 0,995 - % Hệ số chắn (%Y) nồng độ 100% phải ≤ 2,0% %Y = ệ ố ệ í ắ ẩ x 100% Kết quả: trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch 50% 75% 100% 125% 150% Nồng độ (μg/ml) 49,15 73,73 98,30 122,88 147,45 Diện tích (mAU.s) 448,33 652,80 878,70 1093,94 1310,21 45 Phương trình hồi quy: y = 8,8094x + 10,834 Hệ số tương quan: R = 0,9999 % Hệ số chắn: %Y = 1,2% Khoảng tuyến tính Diện tích (mAU.s) 1500.00000 1200.00000 900.00000 y = 8.8094x + 10.834 R² = 0.9998 600.00000 300.00000 0.00000 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 Nồng độ (μg/ml) Hình 3.17: Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ * Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ diện tích pic với hệ số tương quan (R) 0,9999 % hệ số chắn 1,2% Nồng độ định lượng nằm khoảng tuyến tính khảo sát  Độ đúng: Tiến hành thực nghiệm sau: - Xác định độ phương pháp cách thêm lượng cleistantoxin chuẩn thích hợp vào mẫu thử (tương ứng với khoảng 50% nồng độ định lượng) để dung dịch cleistantoxin có nồng độ 90 μg/ml, 100 μg/ml 110 μg/ml tương ứng với khoảng 90%, 100% 110% nồng độ định lượng - Pha dung dịch chuẩn gốc: Cân 9,83 mg cleistantoxin chuẩn gốc vào bình định mức 20 ml Siêu âm 15 phút định mức vừa đủ thể tích pha động 46 để dung dịch có nồng độ khoảng 500 μg/ml Lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm - Pha dung dịch thử gốc: Cân khoảng 10,00 mg nguyên liệu cleistantoxin vào bình định mức 20 ml Siêu âm 15 phút định mức vừa đủ thể tích pha động để dung dịch có nồng độ khoảng 500 μg/ml Lọc qua màng lọc PTFE 0,2 μm - Pha dung dịch chuẩn đối chiếu: Tiến hành tương tự pha dung dịch chuẩn mục 3.4.1 Khối lượng chuẩn gốc cleistantoxin cân 9,83 mg - Chuẩn bị mẫu khoảng nồng độ theo bảng 3.7 Bảng 3.7: Cách pha dung dịch thẩm định độ Dung dịch 50% 90% Thể tích dung dịch thử gốc (ml) 110% 1000 1200 1,0 Thể tích dung dịch chuẩn gốc (μl) - 100% 800 Dung môi pha lỗng Pha động Thể tích bình định mức (ml) 10,00 Tiến hành sắc ký dung dịch theo quy trình định lượng, riêng dung dịch chuẩn đối chiếu tiêm lặp lại lần Xác định lượng chuẩn cleistantoxin thu hồi theo công thức sau: mR = 47 ̅̅̅ x mS Trong đó: mR (μg) lượng cleistantoxin thu hồi mS (μg) lượng cleistantoxin dung dịch chuẩn đối chiếu ̅ (mAU.s) diện tích trung bình pic cleistantoxin ứng với dung dịch chuẩn đối chiếu St (mAU.s) diện tích pic cleistantoxin ứng với mẫu thử 50% Sa (mAU.s) diện tích pic cleistantoxin ứng với mẫu thêm chuẩn vào mẫu thử - Xác định độ phương pháp theo công thức: Độ (tỷ lệ thu hồi) (%) = ượ ượ ẩ ẩ ê x 100% Yêu cầu: - Tỷ lệ thu hồi phải đạt từ 98,0% đến 102,0% mức nồng độ - RSD tỷ lệ thu hồi phải ≤ 2,0% mức nồng độ Kết quả: - Diện tích trung bình pic cleistantoxin ứng với dung dịch chuẩn đối chiếu 877,88 (mAU.s) - Diện tích pic cleistantoxin SKĐ mẫu thử 50% ứng với khối lượng cân thử là:  mthử = 9,91 mg: Spic cleistantoxin = 450,69 mAU.s  mthử = 9,82 mg: Spic cleistantoxin = 443,90 mAU.s  mthử = 9,86 mg: Spic cleistantoxin = 437,75 mAU.s - Kết sắc ký dung dịch thẩm định độ trình bày bảng 3.8 48 Bảng 3.8: Kết khảo sát độ Dung dịch 90% Lượng cân thử (mg) Lượng chuẩn thêm vào (μg) 9,91 Diện tích (mAU.s) Lượng chuẩn tìm thấy (μg) Tỷ lệ thu hồi (%) 393,2 802,77 394,2 100,3 9,82 393,2 794,40 392,5 99,8 9,86 393,2 787,34 391,5 99,6 Trung bình: 99,9% RSD = 0,4% 100% 9,91 491,5 889,09 490,9 99,9 9,82 491,5 882,05 490,6 99,8 9,86 491,5 881,02 496,4 101,0 Trung bình: 100,2% RSD = 0,7% 110% 9,91 589,8 978,32410 590,8 100,2 9,82 589,8 969,97266 589,1 99,9 9,86 589,8 966,30927 591,9 100,3 Trung bình:100,1% RSD = 0,2% * Nhận xét: Tỷ lệ thu hồi nằm khoảng 98,0 - 102,0% đồng thời RSD < 2,0% chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu độ  Độ lặp lại: - Tiến hành định lượng 06 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích - Độ lặp lại phương pháp xác định giá trị RSD (%) hàm lượng cleistantoxin có mẫu thử: Ht(%) = ̅̅̅ x HS x 100% 49 Trong đó: Ht (%) hàm lượng cleistantoxin tinh chế HS (%) hàm lượng cleistantoxin chất chuẩn gốc St (mAU.s) diện tích pic cleistantoxin ứng với dung dịch thử ̅ (mAU.s) trung bình diện tích pic cleistantoxin ứng với dung dịch chuẩn mt (mg) khối lượng cân cleistantoxin tinh chế mS (mg) khối lượng cân cleistantoxin chuẩn gốc Yêu cầu: - Giá trị RSD hàm lượng chất phân tích có mẫu thử phải ≤ 2,0% Kết quả: trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9: Kết khảo sát độ lặp lại Dung dịch Khối lượng (mg) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng (%) Chuẩn 9,83 877,88 99,03 Thử 9,91 880,27 98,50 Thử 10,43 948,70 100,86 Thử 10,22 895,57 97,17 Thử 9,82 868,07 98,02 Thử 9,86 896,72 100,85 Thử 10,63 947,79 98,87 Trung bình 99,05% (RSD = 1,4%) * Nhận xét: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối giá trị hàm lượng cleistantoxin tinh chế 1,4% (< 2,0%), chứng tỏ phương pháp đạt yêu cầu độ lặp lại 50  Độ ổn định dung dịch thử 100 ppm: - Chuẩn bị dung dịch thử phần 3.4.1, bảo quản nhiệt độ phịng thí nghiệm Tiến hành sắc ký theo quy trình phân tích sau khoảng thời gian định - Ghi nhận SKĐ, tính giá trị RSD diện tích pic sau lần tiêm lặp lại - Dung dịch thử coi ổn định giá trị RSD ≤ 2,0% Kết quả: thể trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10: Kết khảo sát độ ổn định dung dịch thử 100 ppm STT Thời gian (giờ) Diện tích pic (mAU.s) 869,47 870,48 3 872,38 872,11 12 872,24 24 874,23 Trung bình 871,82 RSD (%) 0,2 * Nhận xét: Diện tích pic cleistantoxin SKĐ dung dịch thử ổn định với RSD < 2,0% Vậy dung dịch thử ổn định thời gian khảo sát (24 giờ) 3.4.3 Kết xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế - Tiến hành định lượng 06 mẫu thử độc lập theo quy trình phân tích xây dựng phần 3.4.1 Tính kết trung bình giá trị RSD (%) hàm lượng đo 51 - Hàm lượng cleistantoxin định lượng chất tinh chế 99,05% (RSD% = 1,4%) - SKĐ dung dịch chuẩn dung dịch thử thể hình 3.18 Dung dịch chuẩn Dung dịch thử Hình 3.18: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn dung dịch thử định lượng cleistantoxin  Nhận xét: Hàm lượng nguyên trạng cleistantoxin tinh chế 99,05%, đạt yêu cầu cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thực nghiệm đạt mục tiêu đề tài đề ra, kết cụ thể sau:  Tiến hành phân lập tinh chế 5,4547 g chất 7B tinh khiết từ 168 g cao cồn khô chiết xuất từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl Phyllanthaceae) Sản phẩm tinh chế nhận dạng liệu phổ UV-VIS, IR, MS, NMR khẳng định hợp chất cleistantoxin  Xây dựng quy trình sắc ký nhằm xác định tạp chất liên quan cleistantoxin đồng thời xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế với điều kiện sau: - Pha tĩnh: Cột Inertsil® ODS-3 C18 (250 mm x 4,6 mm; μm) - Pha động: Hỗn hợp nước acetonitril (tỷ lệ 45:55) - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl - Detector DAD: bước sóng 286 nm Phương pháp thẩm định đạt tất tiêu chí theo hướng dẫn thẩm định ICH  Xác định tổng tạp chất liên quan cleistantoxin tinh chế nằm giới hạn cho phép (≤ 1,0%) Chất tinh chế đạt yêu cầu giới hạn tạp chất liên quan cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu  Xác định hàm lượng nguyên trạng cleistantoxin tinh chế 99,05% Chất tinh chế đạt yêu cầu hàm lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu 53 II KIẾN NGHỊ  Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu cleistantoxin để thiết lập chất chuẩn làm việc  Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn làm việc cleistantoxin nguyên trạng pha dung môi pha mẫu khác 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa phân tích - Tập 2, tr.123-200, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, PL119-129, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam - Quyển II, tr.231-234, NXB Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh Trịnh Thị Thanh Vân (2012), Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thuộc họ Thầu dầu Việt Nam, tr 5-148, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội Tiếng Anh The Angiosperm Phylogeny Group (2009), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group Classification for the orders and families of flowering plants: APG III", Botanical Journal of the Linnean Society, 161(2), pp 105121 David C Browne (2009), “Reference-Standard Material Qualification”, Pharmaceutical Technology, 33(4), pp 66-73 Committee on ASEAN Reference Substances (2005), Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Asean reference substances ICH (2005), Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology ICH (2006), Impurities in New Drug Substances 10 H Kathriarachchi, P Hoffmann, R Samuel, K J Wurdack, and M W Chase (2005), “Molecular phylogenetics of Phyllanthaceae inferred from five genes (plastid atpB, matK, 3′ndhF, rbcL, and nuclear PHYC)”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 36(1), pp 112–134 11 H Kathriarachchi et al (2006), “Phylogenetics of tribe Phyllantheae (Phyllanthaceae; Euphorbiaceae sensu lato) based on nrITS and plastid matK DNA sequence data", American Journal of Botany, 93(4), pp 637-655 12 R Samuel et al (2005), “Molecular phylogenetics of phyllanthaceae: Evidence from plastid matK and nuclear PHYC sequences", American Journal of Botany, 92(1), pp 132-141 13 V Trinh Thi Thanh et al (2012), “Cytotoxic Lignans from Fruits of Cleistanthus indochinensis: Synthesis of Cleistantoxin Derivatives”, Journal of Natural Products, 80(8-9), pp 695-702 14 WHO (2006), “General guidelines for the establishmen, maintenance and distribution of chemical reference substances”, WHO Technical Report Series, 943, pp 59-82 15 WHO (2017), World Health Statistics 2017: Monitoring health for the SDGs ... lập từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis) làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn" với mục tiêu: - Phân lập, tinh chế nhận dạng cleistantoxin từ Chà chôi (Cleistanthus tonkinensis Jabl.) - Xác định. .. liệu ung thư này, chất chuẩn cần thiết lập để tiến hành định tính định lượng chất phân lập Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: "Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng cleistantoxin phân lập. .. cleistantoxin 3.4 Xác định hàm lượng cleistantoxin tinh chế HPLC/DAD 3.4.1 Xây dựng phương pháp Dựa phương pháp xây dựng để xác định tạp chất liên quan, chúng tơi đưa quy trình xác định hàm lượng cleistantoxin