ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN DUY HẢI NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ LOÀI KIM GIAO (NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN DUY HẢI NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ LOÀI KIM GIAO (NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM HẢI YẾN THÁI NGUYÊN - 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành đến với TS Phạm Hải Yến Cô giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Nghiên cứu cấu trúc – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ trang thiết bị cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Hóa Phân tích nói riêng khoa Hóa học nói chung dạy dỗ, bảo động viên thời gian học tập trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại Học Thái Nguyên Qua đây, xin cảm ơn gia đình, bạn học viên sinh viên Bộ môn Hóa phân tích động viên, tận tình giúp đỡ thời gian học tập thực luận văn Thái Nguyên, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Học viên Nguyễn Duy Hải MỤC LỤC Mở đầu Nội dung nghiên cứu 1.1 Tổng quan Kim Giao 1.1.1 Vài nét thực vật 1.1.2 Phân bố sinh thái 1.1.3 Ứng dụng 1.1.4 Các nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học 2.1 Mẫu thực vật 11 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 11 2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 11 2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 11 2.2.3 Sắc ký cột (CC) 11 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất hữu 11 2.3.1 Phổ hồng ngoại (Infraed Spectroscopy-IR) 12 2.3.2 Phổ khối lượng (Mass spectroscopy - MS) 12 2.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 13 2.4 Phương pháp định lượng đánh giá chất LC/MS 15 2.5 Thực nghiệm 17 2.5.1 Phân lập hợp chất 17 2.5.2 Hằ ng số vâ ̣t lý kiện phổ của các hơ ̣p chấ t đã phân lâ ̣p 18 2.5.3 Định lượng hợp chất 19 3.1 Xác định cấu trúc hoá học hợp chất phân lập 21 3.1.1 Hợp chất D1: 21 3.1.2 Hợp chất D2: 25 3.1.3 Hợp chất D3: 29 3.1.4 Hợp chất D4: 32 3.1.5 Hợp chất D5: 36 3.2 Xác định hàm lượng hợp chất phân lập phương pháp LC/MS 40 3.2.1 Xác định hàm lượng chất D1 (kí hiệu PE1) 40 3.2.2 Xác định hàm lượng chất D2 (kí hiệu PE2): 42 KẾT LUẬN: 45 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CC Column Chromatography Sắc ký cột TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng MeOH Methanol EtOAc Ethyl acetate H-NMR 13 C-NMR DEPT HMBC HSQC NOESY Proton Magnenic Rosonance Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Carbon-13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết Heteronuclear Single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua Quantum Connectiv ity liên kết Nuclear Overhauser Effect Phổ học hạt nhân Overhauser Spectroscopy có hiệu lực DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chiết phân đoạn từ kim giao 17 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cặn diclometan kim giao 18 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây kim giao - Nageia fleuryi Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất D1 21 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR D1 22 Hình 3.3 Phổ 13C-NMR D1 22 Hình 3.4 Phổ HSQC D1 24 Hình 3.5 Phổ HMBC D1 24 Hình 3.6 Phổ NOESY D1 25 Hình 3.7 Cấu trúc D2 25 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR D2 26 Hình 3.9 Phổ 13C-NMR D2 26 Hình 3.10 Phổ HSQC D2 28 Hình 3.11 Phổ HMBC D2 28 Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất D3 29 Hình 3.13 Phổ 1H-NMR D3 29 Hình 3.14 Phổ 13C-NMR D3 30 Hình 3.15 Phổ HSQC D3 31 Hình 3.16 Phổ HMBC D3 32 Hình 3.17 Cấu trúc hợp chất D4 32 Hình 3.18 Phổ 1H-NMR D4 33 Hình 3.19 Phổ 13C-NMR D4 33 Hình 3.20 Phổ HSQC D4 35 Hình 3.21 Phổ HMBC D4 35 Hình 3.22 Phổ NOESY D4 36 Hình 3.23 Cấu trúc hợp chất D5 36 Hình 3.24 Phổ 1H-NMR D5 37 Hình 3.25 Phổ 13C-NMR D5 37 Hình 3.26 Phổ HSQC D5 39 Hình 3.27 Phổ HMBC D5 40 Hình 3.28 Diện tích pic chất D1 (PE1) mẫu tổng 42 Hình 3.29 Diện tích pic chất D2 (PE2) mẫu tổng 44 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1.1 Số liệu phổ hợp chất D1 chất tham khảo 23 Bảng 3.1.2 Số liệu phổ hợp chất D2 chất tham khảo 27 Bảng 3.1.3 Số liệu phổ hợp chất D3 chất tham khảo 30 Bảng 3.1.4 Số liệu phổ hợp chất D4 chất tham khảo 34 Bảng 3.1.5 Số liệu phổ hợp chất D5 chất tham khảo 38 Bảng 3.2.1 Kết đo phổ LC/MS mẫu PE1 40 Bảng 3.2.2: Kết phân tích phương sai 41 Bảng 3.2.3 Kết định lượng mẫu 42 Bảng 3.2.4 Kết đo phổ LCMS mẫu PE2 42 Bảng 3.2.5 Kết phân tích phương sai 43 Bảng 3.2.6 Kết định lượng mẫu D2 44 DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR D1 - PL Phụ lục Phổ 13C-NMR D1 - PL Phụ lục Phổ HSQC D1 - PL Phụ lục Phổ HMBC D1 - PL Phụ lục Phổ NOESY D1 - PL Phụ lục Phổ 1H-NMR D2 - PL Phụ lục Phổ 13C-NMR D2 - PL Phụ lục Phổ HSQC D2 - PL Phụ lục Phổ HMBC D2 - PL Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR D3 - PL Phụ lục 11 Phổ 13C-NMR D3 - PL Phụ lục 12 Phổ HSQC D3 - PL Phụ lục 13 Phổ HMBC D3 - PL Phụ lục 14 Phổ 1H-NMR D4 - PL Phụ lục 15 Phổ 13C-NMR D4 - PL Phụ lục 16 Phổ HSQC D4 - PL Phụ lục 17 Phổ HMBC D4 - PL Phụ lục 18 Phổ NOESY D4 - PL Phụ lục 19 Phổ 1H-NMR D5 10 - PL Phụ lục 20 Phổ 13C-NMR D5 10 - PL Phụ lục 21 Phổ HSQC D5 11 - PL Phụ lục 22 Phổ HMBC D5 11 - PL Mở đầu Hiện nay, loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày ưa chuộng đặc tính bật chúng như: độc, gây phản ứng phụ, dễ hấp thu Từ ngàn xưa ông cha ta sử dụng nhiều phương thuốc dân gian từ cỏ để chữa bệnh, bồi bổ thể, hay tạo mùi thơm Do ngày hợp chất có hoạt tính sinh học thực vật động vật nhận quan tâm lớn từ giới khoa học Trong tương lai, hợp chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò quan trọng, yếu tố khởi đầu cho việc tổng hợp nên loại dược phẩm có tác dụng tốt Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới, có khí hậu nóng, độ ẩm cao, lượng mưa lớn, điều kiện thích hợp cho sinh trưởng phát triển loài thực vật Với hệ thực vật phong phú đa dạng khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, có tới 4.000 loài nhân dân ta dùng làm thảo dược, điều tiền đề lớn cho phát triển ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nước ta Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hoá học tác dụng dược lý loài thuốc có giá trị cao Việt Nam nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng cách hợp lí có hiệu có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Kim giao hay gọi Kim giao núi đá (danh pháp khoa học Nageia fleuryi hay Podocarpus fleuryi) loài thực vật họ Podocarpaceae Lá loài dân gian dùng sắc uống chữa ho máu, sưng cuống phổi dùng làm thuốc giải độc… Ở Việt Nam, chưa thấy có công bố thành phần hóa học loài Trên giới, năm 1990 1991 nhóm tác giả Xu Ya-ming cộng công bố cấu trúc 16 hợp chất phân lập từ loài Podocarpus fleuryi Năm 2013, LanChun Zhang cộng phân lập hợp chất diterpenoid Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào năm dòng tế bào ung thư HL-60, SMMC-772, A-549, MCF-7 SW480 cho thấy hợp chất fleuryinol B 19-hydroxyferruginol có hoạt tính mức độ trung bình với giá trị IC50 nằm khoảng 14-38 µM Luận văn tập trung nghiên cứu phân tích cấu trúc xác định hàm lượng số hợp chất diterpenoid phân lập từ Kim giao (Nageia fleuryi), có ý HV: Nguyễn Duy Hải KẾT LUẬN: Từ phân đoạn diclometan kim giao phân lập hợp chất, cấu trúc chúng xác định phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều Đây hợp chất lần phâp lập từ kim giao  12(R),13-dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic acid (D1)  12-oxo-15-hydroxylabda-8(17),13(E)-dien-19-oic acid (D2)  14,15-dihydroxylabda-8(17),12(E)-dien-19-oic acid (D3)  16-methyl-12,15-epoxy-8(17),13-labdadien-19-oic acid (D4)  Nagilactone C (D5) Bằng phương pháp LC/MS/MS xác định hàm lượng chất 12(R),13dihydroxylabda-8(17),14-dien-19-oic acid (D1) 12-oxo-15-hydroxylabda8(17),13(E)-dien-19-oic acid (D2) cao chiết tổng metanol 0,0175% 0,00245% ; mẫu khô 1,05.10-3 % 0,15.10-3 % HV: Nguyễn Duy Hải 45 Tài liệu tham khảo: Phan Kế Lộc, Lê Thị Thu, Trần Anh Vũ, Nguyễn Hoàng Quân, Nguyễn Tân Chiến, Góp phần phân loại mẫu thực vật thu thập thuộc chi Kim giao Việt Nam, Hội nghị Khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr 214-220 Võ Văn Chi, Từ điển thuốc Việt Nam, Tập 1, tr 1242-1243, Nhà Xuất Y học, 2012 Yuji Hayashi, Shigenobu Takahashi, Hisao Ona and Takeo Sakan, Structurec of nagilactone A, B,C and D, novel nor- and bisnorditerpenoids, Tetrahedron Letters (1968), (17), 2071-2076 Yuji Hayashi, Yo-ichi Yuki, Takeshi Matsumoto, Takeo Sakan, New congeners of cytotoxic nor-diterpenoid dilactone in Podocarpus nagi: three highly polar components with α-pyrone ring, Tetrahedron Letters (1977), (18), 2953-2956 Yuji Hayashi, Yo-ichi Yuki, Takeshi Matsumoto, Takeo Sakan, New congeners of cytotoxic nor-diterpenoid dilactones in Podocarpus nagi: Two C19 lactones from the seed extract, Tetrahedron Letters (1977), (41), 3637-3640 Yuji Hayashi, Takeshi Matsumoto, Yo-ichi Yuki, Takeo Sakan, New congeners of cytotoxic nor-diterpenoid dilactones in Podocarpus nagi: Three new components of 7,8-epoxy-enolide type, Tetrahedron Letters (1977), (48), 42154218 Bai-Ping Ying, Isao Kubo, Chairul, Takeshi Matsumoto and Yuji Hayashi, Congeners of norditerpene dilactones from Podocarpus nagi, Phytochemistry (1990), (29), 3953-3955 Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding and He Qi-min, The chemical constituents from Podocarpus fleuryi Hickle, Acta Botanica Sinica, 1990, 32(4), 302-306 Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding, The structure of a new biflavone from Podocarpus fleuryi, Acta Botanica Sinica, 1991, 33(2), 162-163 10 Isao Kubo, Masaki Himejiwa and Bai-Ping Ying, An antifungal norditerpene dilactones from Podocarpus nagi, Phytochemistry (1991), (30), 1467-1469 11 Isao Kubo and Bai-Ping Ying, Two nor-diterpene dilactones from Podocarpus nagi, Phytochemistry (1991), (30), 1967-1969 12 Isao Kubo and Bai-Ping Ying, A bisnorditerpene dilactone from Podocarpus nagi, Phytochemistry (1991), (30), 3476-3477 13 Isao Kubo, Hisae Murol, and Masaki Himejima, Antibacterial activity of totarol and its potentiation, Journal of Natural Products (1992), (55), 14361440 14 Isao Kubo, Hisae Murol, and Masaki Himejima, Combination effects of Antifungal nagilactones against Candida albicans and two other fungi with phenylpropanoids, Journal of Natural Products (1993), (56), 220-226 15 Li-Jang Xuan, Ya-Ming Xu and Sheng-Ding Fang, Three diterpene dilactone glycosides from Podocarpus nagi, Phytochemistry (1995), (39), 11431145 16 Ya-Ming Xu and Li-Jang Xuan, Two new diterpene dilactone glycosides with a trisaccharide moiety from Podocarpus nagi, Studies in Plant Science (1999), (Advances in Plant Glycosides, Chemistry and Biology), 399-402 17 Zhang Yi, Tang Chunping, Sob Sylvain Valère Tanemossu, Ke Changqiang, Ye Yang, Two New Cyclopeptides from Podocarpus nagi, Chin J Chem (2012), (30), 1361-1364 18 Szu-Jung Chen, Wen-Cheng Huang, Tzu-Ting Yang, Jui-Hua Lu, Lu-Te Chuang, Incorporation of sciadonic acid into cellular phospholipids reduces proinflammatory mediators in murine macrophages through NF-B and MAPK signaling pathways, Food and Chemical Toxicology, (2012), (50), 3687-3695 19 Lan-Chun Zhang, Xing-De Wua, Juan He, Yan Li, Rong-Ping Zhang, Qin- Shi Zhao, Three new abietane diterpenoids from Podocarpus fleuryi, Phytochemistry Letters, (2013), (60), 364–367 20 Jiazhu Yang, Chao-Zhong Peng, Jinghe Jiang, Guoli Huang, Ying Liu, and Ye-Gao Chen, Chemical constituents of Podocarpus wallichiana, Chemistry of Natural Compounds, (2016), (52), 142-143 21 Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding and He Qi-min, The chemical constituents from Podocarpus fleuryi Hickle, Acta Botanica Sinica, 1990, 32(4), 302-306 22 Xu Ya-ming, Fang Sheng-ding, The structure of a new biflavone from Podocarpus fleuryi, Acta Botanica Sinica, 1991, 33(2), 162-163 23 Jim-Min Fang, Yi-Chien Sou, Yu-Hung Chiu and Yu-Shia Cheng, Diterpenes from the bank of Juniperus chinensis, Phytochemistry, Vol 34, No 6, pp 1581-1584, 1993 24 Chuang-Jun Li, Dong-Ming Zhang, Yong-Ming Luo, Shi-Shan Yu, Yan Li, Yang Lu, Bis-sesquiterpenes and diterpenes from Chloranthus henryi, Phytochemistry 69 (2008) 2867–2874 25 X.-Y Ren and Y Ye , Labdane diterpenes from the seeds of Platycladus orientali, Journal of Asian Natural Products Research, Vol 8, No 8, December 2006, 677–682 26 Inoue, M., Hasegawa, S and Hirose, Y (1985), Terpenoids from the seed of platycladus orientalis, Phytochemistry 24, 1602-1604 27 De Pascual Teresa, J., San Feliciano, A and Egido, T (1976) An Quim 72, 865 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H-NMR D1 Phụ lục Phổ 13C-NMR D1 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục Phổ HSQC D1++ Phụ lục Phổ HMBC D1 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục Phổ NOESY D1 Phụ lục Phổ 1H-NMR D2 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục Phổ 13C-NMR D2 Phụ lục Phổ HSQC D2 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục Phổ HMBC D2 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR D3 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục 11 Phổ 13C-NMR D3 Phụ lục 12 Phổ HSQC D3 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục 13 Phổ HMBC D3 Phụ lục 14 Phổ 1H-NMR D4 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục 15 Phổ 13C-NMR D4 Phụ lục 16 Phổ HSQC D4 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục 17 Phổ HMBC D4 Phụ lục 18 Phổ NOESY D4 HV: Nguyễn Duy Hải  - PL  Phụ lục 19 Phổ 1H-NMR D5 Phụ lục 20 Phổ 13C-NMR D5 HV: Nguyễn Duy Hải  10 - PL  Phụ lục 21 Phổ HSQC D5 Phụ lục 22 Phổ HMBC D5 HV: Nguyễn Duy Hải  11 - PL  ... HỌC NGUYỄN DUY HẢI NGHIÊN CỨU TÁCH, CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT DITERPENOID TỪ LOÀI KIM GIAO (NAGEIA FLEURYI (HICK.) DE LAUBENF) Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 01 18 LUẬN... nghiên cứu 1, Nghiên cứu phân lập số hợp chất diterpenoid từ loài Kim giao 2, Phân tích cấu trúc xác định hàm lượng hợp chất diterpenoid phân lập HV: Nguyễn Duy Hải Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Kim. .. Kim giao (Nageia) Ở Việt Nam, chi Kim giao ghi nhận có loài là: Kim giao đế mọng (Nageia wallichiana hay Podocarpus wallichiana), Kim giao hạt to (Nageia fleuryi hay Podocarpus fleuryi) Kim giao