BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida) Giảng viên hướng dẫn : TS Phạm Thị Minh Thu Sinh viên thực : Mai Thị Thảo Mã số sinh viên : 55131688 Khánh Hòa: 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (Petunia hybrida) GVHD : TS Phạm Thị Minh Thu SVTH : Mai Thị Thảo MSSV : 55131688 Khánh Hòa, tháng 6/2017 i LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida)” cột mốc quan trọng năm tháng sinh viên em Để bắt đầu thực hoàn thành đồ án em nhận nhiều giúp đỡ Lời cho em gửi lời cảm ơn chân thành đến người giúp đỡ em hoàn thành đồ án này: Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban lãnh đạo với quý thầy cô Viện Công nghệ Sinh Học Môi Trường tạo điều kiện nhiệt tình dẫn em suốt thời gian em học tập trường em làm đồ án Em xin bày tỏ lòng biết ơn TS Phạm Thị Minh Thu định hướng ý tưởng, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa luận văn động viên suốt trình học tập hoàn thành đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè giúp đỡ chỗ dựa tinh thần suốt trình học tập trình thực đề tài Nha Trang, tháng 06 năm 2017 Sinh viên Mai Thị Thảo ii TÓM TẮT Nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích nhân nhanh số lượng cây, tạo giống khỏe, bệnh, chất lượng giống đồng sau nuôi cấy Bước đầu thí nghiệm tạo vật liệu in vitro từ mẫu tự nhiên Đối với mẫu khác thời gian nồng độ chất khử trùng khác Thời gian dài ngắn, nồng độ chất khử trùng cao thấp ảnh hưởng trực tiếp đến kết trình khử trùng Mẫu sau xử lý sơ ethanol 70%, khử trùng NaOCl 1% vòng 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao 60% Mẫu chồi sau xử lý sơ ethanol 70%, khử trùng NaOCl 1% vòng 15 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao 80% Để tăng nhanh hệ số nhân chồi ta tiến hành tạo cụm chồi môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Để chồi tách chiều cao chồi đủ lớn ta tiến hành kéo dài chồi môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Môi trường MS môi trường giàu dinh dưỡng môi trường thích hợp cho rễ Dã yên thảo, môi trường sau ba tuần nuôi cấy đủ điều kiện để đưa vườn ươm Cuối cùng, Dã yên thảo nuôi cấy in vitro đưa tự nhiên có tỷ lệ sống cao (50%) môi trường gồm đất thịt + sơ dừa + trấu hun.Từ mẫu in vitro ban đầu, sau năm tuần nuôi cấy môi trường tạo cụm chồi (MS + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA) ta thu 90 mẫu chồi in vitro Mẫu chồi in vitro tiếp tục chuyển qua môi trường MS để tạo rễ Khi tạo thành hoàn chỉnh ta tiến hành chuyển chúng môi trường tự nhiên, 50% số có sức sống ổn định môi trường bao gồm đất thịt có bổ sung thêm sơ dừa trấu hun iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hoa Dã Yên Thảo 1.1.1 Hệ thống phân loại 1.1.2 Nguồn gốc mô tả 1.1.2.1 Nguồn gốc 1.1.2.2 Mô tả 1.1.3 Một số loại hoa Dã yên thảo 1.1.4 Nhân giống kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo 1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo 1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo 1.1.5 Nhược điểm hoa Dã yên thảo 1.2 Sơ lược nhân giống in vitro 1.2.1 Lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật 1.2.2 Ý nghĩa việc NCMTBTV 1.2.3 Hiện trạng NCMTBTV Việt Nam 11 1.2.4 Một số thành tựu NCMTBTV Việt Nam 11 1.2.5 Thuận lợi khó khăn NCMTBTV Việt Nam 12 1.2.6 Thành phần dinh dưỡng NCMTBTV 12 1.2.6.1 Nguồn Cacbon 13 1.2.6.2 Các loại muối khoáng 13 1.2.6.3 Vitamin 15 1.2.6.4 Các chất điều hòa sinh trưởng 15 1.2.6.5 Chất độn – thạch (agar) 19 1.2.6.6 Các chất bổ sung (than hoạt tính) 19 iv 1.2.6.7 pH 20 1.3 Các nghiên cứu in vitro hoa Dã yên thảo 21 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 23 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 23 2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 23 2.3.2 Nội dung thí nghiệm 24 2.3.2.1 Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu in vitro từ chồi 24 2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Nhân nhanh hoa Dã yên thảo phương pháp tạo cụm chồi in vitro 26 2.3.2.3 Thí nghiệm 3: Tạo rễ in vitro Dã yên thảo 27 2.3.2.4 Thí nghiệm 4: Rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên 27 2.4 Phương pháp phân tích số liệu 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tạo vật liệu in vitro từ phận khác Dã yên thảo (lá, chồi) 29 3.3 Ảnh hưởng CĐHTTTV đến giai đoạn nhân chồi 36 3.4 Tạo rễ in vitro Dã yên thảo 41 3.5 Rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 4.1 Kết luận 53 4.2 Kiến Nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 56 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cây Dã yên thảo tự nhiên Hình 1.2: Công thức hóa học số auxin 16 Hình 2.1: Sơ đồ quy trình khử trùng đơn giản tạo vật liệu in vitro từ mẫu 25 Hình 3.1: Mẫu khử trùng NaOCl 1% sau ngày nuôi cấy 31 Hình 3.2: Mẫu chồi khử trùng NaOCl 1% sau ngày nuôi cấy 33 Hình 3.3: Chồi ngủ Dã yên thảo môi trường MS 35 Hình 3.4: Chồi Dã yên thảo sau tuần nuôi cấy tối 36 Hình 3.5: Quá trình nhân nhanh cách tạo cụm chồi Dã yên thảo 38 Hình 3.6: Mẫu môi trường tạo cụm chồi sau bốn tuần nuôi cấy 39 Hình 3.7: Cụm chồi Dã yên thảo môi trường kéo dài chồi sau hai tuần nuôi cấy 40 Hình 3.8: Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS sau bốn tuần nuôi cấy 42 Hình 3.9: Sự tạo rễ in vitro Dã yên thảo sau bốn tuần nuôi cấy 43 Hình 3.10: Sự rễ in vitro môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 45 Hình 3.11: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 45 Hình 3.12: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm 0,5mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 46 Hình 3.13: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 46 Hình 3.14: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy 47 Hình 3.15: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm % AC 47 Hình 3.16: Cây Dã yên thảo sau tháng rèn luyện tự nhiên 50 Hình 3.17: Cây Dã yên thảo hoa tự nhiên 50 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Ảnh hưởng CĐHSTTV đến khả tạo cụm chồi 26 Bảng 2.2: Ảnh hưởng nồng độ NAA, IAA AC đến tạo rễ in vitro 27 Bảng 2.3: Ảnh hưởng giá thể đến sức sống hoa Dã yên thảo 28 Bảng 3.1: Hiệu khử trùng mấu Dã yên thảo 29 Bảng 3.2: Hiệu khử trùng mẫu chồi Dã yên thảo 29 Bảng 3.3: Ảnh hưởng BAP + NAA đến khả tạo cụm chồi 37 Bảng 3.4: Sự rễ Dã yên thảo nồng độ NAA khác 41 Bảng 3.5: Sự ảnh hưởng IAA AC đến rễ Dã yên thảo 44 Bảng 3.6: Ảnh hưởng giá thể tới rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên 49 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Cs: Cộng Nxb: Nhà xuất ĐC: Đối chứng CT: Công thức TB: Trung bình MS: Murashige and Skoog IAA:  - Indo accetic acid NAA: Naphthylacetic acid BAP: benzyl amino purin AC: Than hoạt tính Tp HCM: Thành phố Hồ Chí Minh NCMTBTV: Nuôi cấy mô tế bào thực vật CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cùng với phát triển đời sống vật chất, đời sống tinh thần nhu cầu thưởng thức đẹp người không ngừng tăng lên Trong hoa thứ vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà người dễ dàng thưởng thức nhất, tâm điểm ý, vào dịp lễ, tết, hoạt động văn hóa Hoa lựa chọn cho ngày lễ ngày tết, hoa lựa chọn tốt cho việc giải tỏa tâm trạng Cuộc sống xã hội phát triển lo toan, suy nghĩ hàng ngày nhiều khiến cho người ta cảm thấy mệt mỏi, áp lực Nếu giải tỏa thứ kịp thời gây nên trầm cảm nặng Con người ta thả hồn vào thiên nhiên, tự nhiên cảm thấy thư giãn đem lại cảm giác thoải mái, lấy lại cân sau làm việc căng thẳng Việc ngắm nhìn hoa ban công ý tưởng không tồi thành phố Có nhiều loại hoa sử dụng để trồng ban công hoa Lan, hoa Đồng Tiền,….trong số có hoa Dã yên thảo – nữ hoàng hoa ban công Hoa Dã yên thảo người ta lựa chọn trồng ngày nhiều chúng dễ trồng, hoa chúng đẹp Ban đầu hoa Dã yên thảo nhân lên dùng hạt giâm cành Nhưng giá thành cao, số lượng giống không đủ để đáp ứng nhu cầu thị trường nên việc trồng hoa ban công việc làm xa sỉ nhiều người Bằng tiến khoa học kỹ thuật nói chung, phát triển ngành nuôi cấy mô tế bào thực vật nói riêng giải nhược điểm việc nhân nhanh hoa Dã yên thảo phương pháp truyền thống Để chủ động số lượng giống việc nhân nhanh hoa Dã yên thảo phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật cần thiết để đáp ứng nhu cầu người yêu hoa phần giảm giá thành hoa để đưa hoa đến với tất người Xuất phát từ sở chọn thực nghiên cứu đề tài : “Hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida)” 43 - Mẫu CT5 (1,5 mg/l NAA): Sau hai tuần nuôi cấy chưa thấy xuất rễ, thân có màu vàng Sang tuần thứ ba thấy xuất rễ bất định số Đến hết tuần thứ tư chuyển sang màu vàng hoàn toàn, có tượng rụng số cây, tất phát sinh rễ bất định Chiều cao không thay đổi nhiều so với lúc ban đầu a b d e c Hình 3.9: Sự tạo rễ in vitro Dã yên thảo sau bốn tuần nuôi cấy a Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS + 0,1 mg/l NAA b Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS + 0,3 mg/l NAA c Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS + 0,5 mg/l NAA d Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS + 1,0 mg/l NAA e Sự tạo rễ Dã yên thảo môi trường MS + 1,5 mg/l NAA 44 Bảng 3.5 Sự ảnh hưởng IAA AC đến rễ Dã yên thảo IAA Sự Số lượng Chiều dài Chiều cao Số lượng Khối lượng (mg/l) tạo rễ TB rễ (cm) TB (cm) TB TB TB (g) 10ab 5,67b 1,76 6,33ab 0,76 11,33a 0,58 0,65ab 0,134 3,5ab 0,5 6,5ab 0,5 rễ + 0,1 + 13,67b 1,52 0,3 + 19,67b 1,53 2,67ab 0,76 0,5 + 8,33ab 1,53 1,0 + 1,5 2% 2,65 0,67ab 0,12 6,1ab 0,173 17,3abc 2,5 0,65ab 0,02 2,17a 0,76 7,3b 0,29 19,67bc 2,5 0,79b 0,06 8,67ab 3,1 1,4a 0,36 7,3b 0,25 15,3abc 2,52 0,67ab 0,03 + 8,33ab 1,53 0,67a 0,29 4a 0,5 16,67abc 4.04 0,47a 0,05 + 1,33a 1,15 2a 1,73 4,73ab 0,87 23c 15ab 0,44a 0,05 AC Giá trị = Giá trị TB + SE (sai số chuẩn) Các chữ a, b, c khác cột thể sai khác có ý nghĩa thống kê p = 0,05 phép thử Ducan, xếp theo thứ tự tăng dần từ a đến b Từ kết ta rút số nhận xét sau rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm IAA: - Mẫu CT1 (0,1 mg/l IAA): Sau hai tuần nuôi cấy chưa thấy xuất rễ, thân có màu xanh nhạt Sau ba tuần nuôi cấy xuất rễ số cây, chiều cao trung bình 4,5 cm Cuối tuần thứ tư, tất xuất rễ, nhỏ, số lượng chồi nhiều 45 a b Hình 3.10: Sự rễ in vitro môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy a Cây Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA b Rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung 0,1 mg/l IAA - Mẫu CT2 (0,3 mg/l IAA): Sau hai tuần nuôi cấy xuất rễ số chồi Sau ba tuần nuôi cấy xuất rễ tất cây, không xuất rễ bất định, có chiều cao trung bình 5,5 cm Sau bốn tuần khỏe, to, có màu xanh đậm, đủ điều kiện để đưa môi trường a b Hình 3.1: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy a Cây Dã yên thảo môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA b Rễ Dã yên thảo môi trường MS bổ sung thêm 0,3 mg/l IAA 46 - CT3 (0,5 mg/l IAA): Sau hai tuần nuôi cấy xuất rễ số cây, sau tuần thứ ba xuất rễ tất cây, có màu xanh nhạt, chiều cao trung bình 5,8 cm Sau tuần thứ tư khỏe, to, phát sinh rễ bất định, có màu xanh nhạt a b Hình 3.12: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm 0,5 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy a Cây Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 0,5 mg/l IAA b Rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 0,5 mg/l IAA - Mẫu CT4 (1,0 mg/l IAA): Sau hai tuần nuôi cấy chưa thấy xuất rễ, sau ba tuần nuôi cấy rễ xuất tất cây, rễ bất định số cây, có màu xanh nhạt, chiều cao trung bình 5,5 cm Sau bốn tuần khỏe, to, rễ ngắn, có màu xanh nhạt Cây đủ đáp ứng đủ điều kiện để đưa môi trường a b Hình 3.13: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy a Cây Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 1,0 mg/l IAA b Rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 1,0 mg/l IAA 47 - Mẫu CT5 (1,5 mg/l IAA): Sau hai tuần nuôi cấy toàn xuất rễ, có hình thành mô sẹo Tuần thứ tư nhận thấy nhỏ, yếu, nhiều nhỏ Cây không đủ điều kiện để đưa môi trường a b Hình 3.14: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA sau bốn tuần nuôi cấy a Cây Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA b Rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 1,5 mg/l IAA - CT6 (2% AC): Sau ba tuần nuôi cấy xuất rễ số Sau bốn tuần nuôi cấy xuất rễ toàn rễ số lượng rễ có ít, có màu xanh đậm, khỏe, mập, to a b Hình 3.15: Sự tạo rễ in vitro môi trường MS có bổ sung thêm % AC a Cây Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 2% AC b Rễ Dã yên thảo môi trường MS có bổ sung thêm 2% AC 48 Tóm lại, qua thí nghiệm rút số kết luận sau: - Môi trường MS môi trường giàu dinh dưỡng phù hợp cho sinh trưởng phát triển Dã yên thảo Bên cạnh đó, môi trường MS rễ tốt, tạo có đủ điều kiện để đưa môi trường - Nồng độ NAA không kích thích Dã yên thảo rễ, ngược lại có tác động xấu đến phát triển Cây sống môi trường có nồng độ chất này, không đủ điều kiện đưa môi trường tự nhiên, cụ thể sau: + 0,1 mg/l NAA: Cây yếu, nhỏ, nhỏ, hình thành rễ bất định + 0,3 mg/l NAA: Hình thành mô sẹo, tạo rễ bất định + 0,5 mg/l NAA: Cây yếu, vàng, hình thành rễ bất định + 1,0 mg/l NAA 1,5 mg/l NAA: Cây yếu, xuất rễ bất định, bị vàng, có tượng rụng - Nồng độ IAA ảnh hưởng tốt đến rễ Dã yên thảo, cụ thể sau: + 0,1; 0,3; 0,5; 1,0 mg/l IAA cho khỏe, to, số lượng rễ thích hợp, đủ điều kiện để đưa môi trường + 1,5 mg/l IAA yếu hơn, có hình thành mô sẹo, không đủ điều kiện để đưa môi trường - Than hoạt tính 2%: Cây khỏe, số lượng rễ không đủ điều kiện để đưa môi trường Mặc dù, CĐHTTTV IAA có kích thích hình thành rễ Dã yên thảo mẫu ĐC Dã yên thảo rễ bình thường, tạo đáp ứng đủ điều kiện để đưa môi trường Nên chọn môi trường MS làm môi trường tạo rễ cho Dã yên thảo nhằm mục đích tiết kiệm chi phí, giảm giá thành cho người tiêu dùng 3.5 Rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên Mục đích thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật hệ số nhân giống nhanh, kỹ thuật nuôi cấy mô cung cấp giống khỏe mạnh, giá thành thấp Nhưng điều kiện nuôi cấy bên phòng thí nghiệm có khác biệt so với môi trường bên Chính vậy, việc cho nuôi cấy in vitro môi trường tự nhiên thành công thí nghiệm thành công Môi trường nuôi cấy in vitro cung cấp đủ chất dinh dưỡng, nước muối khoáng đủ cho phát triển Bên cạnh đó, điều kiện ánh sáng, 49 độ ẩm, nhiệt độ điều điều chỉnh để dễ dàng thích nghi Chính lý đó, nên việc rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên khó khăn Trước đưa tự nhiên, cần cho tập làm quen với điều kiện tự nhiên trước cách: Cho bình nuôi cấy bên môi trường vòng tuần, thay toàn túi bao quanh miệng bình giấy mỏng để – ngày trước trồng Tưới nước thường xuyên ngày lần để tránh bị nước Chú ý: Không tưới trực tiếp vào rễ tránh làm rễ bị thối Tỷ lệ sống Dã yên thảo giá thể khác trình rèn luyện tự nhiên, thể Bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hưởng giá thể tới rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên Giá thể Số sống Số chết Tỷ lệ sống (%) Cát ẩm 18 10 Đất thịt + cát +sơ dừa 15 25 Đất thịt + sơ dừa + trấu hun 10 10 50 Từ kết Bảng 3.6 thí nghiệm ta rút vài kết luận: - Giá thể cát ẩm không thích hợp cho phát triển Dã yên thảo Tỷ lệ sống giá thể thấp rễ Dã yên thảo yếu trồng cát ẩm trình trồng làm tổn thương tới rễ Bên cạnh đó, tưới nước lên bề mặt cát làm cho cát nén chặt xuống làm cho độ thông thoáng làm bị chết Những Dã yên thảo sống yếu, có màu vàng, nhỏ - Giá thể đất thịt + cát + sơ dừa giá thể đất thịt + sơ dừa + trấu hun: Tỷ lệ sống tăng lên, nguyên nhân có diện sơ dừa trấu hun giúp cho môi trường đất trở nên thoáng khí hơn, dễ dàng cho việc hô hấp phát triển rễ Bên cạnh đó, tưới nước không bị tích tụ nước, đất không bị nén chặt nên sinh trưởng phát triển Cây Dã yên thảo môi trường đất thịt + cát + sơ dừa nhỏ, nhỏ ít, có màu xanh nhạt Còn môi trường đất thịt + sơ dừa + trấu hun lớn, số lượng nhiều lớn hơn, có màu xanh đậm Môi trường gồm đất thịt + trấu hun + sơ dừa môi trường thích hợp chuyển Dã yên thảo từ nuôi cấy in vitro môi trường tự nhiên 50 a b c Hình 3.16: Cây Dã yên thảo sau tháng rèn luyện tự nhiên a Cây Dã yên thảo môi trường cát ẩm b Cây Dã yên thảo môi trường có bổ sung thêm cát ẩm sơ dừa c Cây Dã yên thảo môi trường có bổ sung thêm sơ dừa trấu hun Hình 3.17: Cây Dã yên thảo hoa tự nhiên 51 Từ thí nghiệm trên, ta rút sơ đồ nhân nhanh Dã yên thảo in vitro Chồi Dã yên thảo Tạo vật liệu khởi đầu in vitro Tạo cụm chồi in vitro Kéo dài chồi Tạo rễ Rèn luyện tự nhiên NaOCl 1% / 15 phút MS + 1,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA sau tuần MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA MS Đất thịt + Sơ dừa + Trấu hun Tóm lại, từ mẫu ban đầu sau năm tuần nuôi cấy môi trường MS bổ sung thêm 1,5 mg/l BAP 0,1 mg/l NAA ta thu 90 mẫu chồi in vitro Mẫu chồi in vitro tiếp tục chuyển qua môi trường MS để tạo rễ Khi tạo thành hoàn chỉnh ta tiến hành chuyển chúng môi trường tự nhiên 50% số có sức sống ổn định môi trường bao gồm đất thịt có bổ sung thêm sơ dừa trấu hun Giải thích ngắn quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo: Chồi Dã yên thảo màu hồng thu tự nhiên, tách riêng thành hai phần: chồi, sau mẫu rửa vòi nước máy Xử lý sơ ethanol 70%, khử trùng chất khử trùng NaOCl 1% (mẫu thời gian 12 phút, mẫu chồi thời gian 15 phút) Sau thu vật liệu in vitro ban đầu, ta tiến hành tạo cụm chồi môi trường MS + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA để tăng nhanh số lượng chồi nhằm sử dụng cho thí nghiệm Sau thời gian nuôi cấy môi trường tạo cụm chồi gần hết chất dinh dưỡng, chồi tương đối nhỏ sử dụng cho thí nghiệm tạo 52 rễ thao tác thí nghiệm khó Do đó, ta chuyển cụm chồi sang môi trường kéo dài chồi MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA nhằm tách chồi với tăng chiều cao chồi Khi chồi đạt chiều cao từ – cm tiến hành chuyển chồi qua môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ sủ dụng môi trường MS, vừa tiết kiệm chi phí mà sau trình tạo rễ đủ điều kiện để đưa vườn ươm Các in vitro có khả sống cao đưa vườn ươm giá thể bao gồm đất thịt + sơ dừa + trấu hun với tỷ lệ 1: 1:1 Một số lưu ý toàn quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida) sau: - Mẫu chồi thu tự nhiên cần chọn chồi khỏe, không sâu bệnh, thối thân - Sử dụng thêm Tween 80 vào trình khử trùng có tác dụng giảm sức căng bề mặt tăng khả tiếp xúc bề mặt mẫu chất khử trùng, tăng hiệu trình khử trùng - Mẫu dùng để tạo cụm chồi sau có vật liệu in vitro ban đầu Do đó, dùng tạo cụm chồi cần lấy thứ thứ tính từ xuống - Chúng ta nên đưa môi trường – ngày trước đưa vườn ươm Để chúng quen dần với điều kiện bên ngoài, tăng số lượng sống 53 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua thí nghiệm xin rút số kết luận sau việc nhân nhanh Dã yên thảo nuôi cấy mô tế bào thực vật: - Đưa quy trình đơn giản để tạo vật liệu khởi đầu in vitro từ chồi Dã yên thảo cách: + Đối với mẫu lá: Thời gian khử trùng tốt 12 phút, cho hiệu khử trùng 60% chất khử trùng NaOCl 1% + Đối với mẫu chồi: Thời gian khử trùng tốt 12 phút, cho hiệu khử trùng 80% chất khử trùng NaOCl 1% - Môi trường thích hợp cho tạo cụm chồi Dã yên thảo môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA Cho hệ số nhân chồi >45 - Môi trường kéo dài chồi môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA - Môi trường để Dã yên thảo hoàn chỉnh (môi trường rễ) môi trường MS + 30 g/l đường sacharose + g/l agar cho sinh trưởng phát triển tốt - Môi trường thích hợp để rèn luyện Dã yên thảo tự nhiên môi trường bao gồm hỗn hợp đất thịt + sơ dừa +trấu hun 4.2 Kiến Nghị Để hoàn thiện đề tài, xin kiến nghị số hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu rễ Dã yên thảo kết hợp chất ĐHSTTV với nhau: IAA + NAA - Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển Dã yên thảo - Nghiên cứu môi trường thích hợp để tạo cụm chồi từ cuống lóng thân 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1993) Công nghệ Sinh học thực vật cải tiến trồng Nhà xuất Nông nghiệp, tr 68-73 Bùi Bá Bổng (2001) Nhân giống trồng nuôi cấy mô Sở Khoa học Công nghệ môi trường An Giang Trần Quốc Cường (2011) Hiệu BA, NAA TDZ lên tái sinh chồi Dã yên thảo in vitro Đồ án tốt nghiệp Đại học Cần Thơ Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam, Quyển II (in lần 2) Nhà xuất trẻ Trần Hợp (2000) Cây cảnh hoa Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, trang 279 – 280 Lê Văn Hoàng (2012) Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhà xuất KHKT Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011) Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nhà xuất Nông nghiệp – Hà Nội Trần Đức Lượng (chủ biên), Lê Thị Thủy Tiên (2006) Công nghệ tế bào Nxb Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013) Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 111 -114 Dương Tấn Nhựt (2007) Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Nhà xuất Nông nghiệp – Tp Hồ Chí Minh, tr 87 -93 Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp – Hà Nội Nguyễn Quang Thạch, Đinh Trường Sơn (2004), Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp 2(3): 183 -190 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1993) Chất điều hòa sinh trưởng trồng Nhà xuất Nông nghiệp – Hà Nội Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lý thực vật ứng dụng Nhà xuất giáo dục Hà Nội: 148 55 Tài liệu tiếng Anh Auer CA, Laloue M, Cohen JD, Cooke T (1992a) Uptake and metabolism of benzyladenine during shoot organogenesis in Petunia leaf explants Plant Growth Regulation, 11: 105-114 Bhojwani SS, Rajdan MK (1983) Plant tissue culture: Theory and practice Elsevier science publisher, Amsterdom, Oxford, New York Tokyo Cheng S, Fu X, Mei X, Zhou Y, Du B, Watanabe N, Yang Z (2016) Regulation of biosynthesis and emission of volatile phenylpropanoids/benzenoids in petunia× hybrida flowers by multi-factors of circadian clock, light, and temperature Plant Physiol Biochem, 107: 1-8 Galson AW, Davis PJ, Statter RL (1985) The life of green plant New York Haberlandt G (1902) Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen Sitz-Ber Mat Nat Kl Kais Akad Wiss Wien, 111: 69–92 Hassan Abu – Qaound, Anas Abu – Rayya an, Sami Yaish (2010) In vitro regeneration and somaclonal variation of Petunia hybrida, 18: 71 – 81 Kortessa Dimasi-TheriouAthanasios S, EconomouEvangelos M, Sfakiotakis (1992) Promotion of petunia (Petunia hybrida L.) regeneration in vitro by ethylene Plant cell tissue and organ culture, 32: 219–225 Murashige T, Skoog F (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Plant Physiol 15: 473 - 479 Reuveni M, Evenor D (2007) On the effect of light on shoot regeneration in petunia Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 89: 49-54 Shah RR, Dalal KC (1980) In vitro multiplication of Glycyrrhiza glabra Curro Sci, 49 : 69 White PR (1931) The history and present status of the problem Plant tissue cultures Arch Exp Zellforsch 10: 501–518 56 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1:Cách pha môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) từ dung dịch mẹ stook Stock Thành phần Nồng độ Nồng độ Dung (mg/l) stock (g/200ml) MS1 (50X) dùng cho 1L môi trường KNO3 1,900 19 KH2PO4 170 1,7 NH4NO3 1,650 16,5 MgSO4.7H2O 370 3,7 MS2 (100X) CaCL2.2H2O 440 8,8 10 ml MS3 (100X) H3BO3 6,2 0,124 10 ml MnSO4.4H2O 22,3 0,446 CoCL2.6H2O 0,025 0,5 mg CuSO4.5H2O 0,025 0,5 mg ZnSO4.4H2O 8,6 0,172 MS4 (100X) MS5 (100X) Na2MnO4.2H2O 0,25 5,0mg KI 0,83 16,6 mg FeSO4.7H2O 27,8 0,556 Na2 - EDTA 37,3 0,746 Myo – inositol 100 2,0 Thiamin HCL 0,1 2,0 mg Pyridixine.HCL 0,5 10 mg Nicotinic acid 0,5 10 mg Glycine 2,0 40 mg dịch 20 ml 10 ml 10 ml 57 PHỤ LỤC 2: Một số thông số chất điều hòa tăng trưởng thực vật CĐHTTTV Mw Dung môi hòa tan Bảo quản BAP 225,26 NaOH 1N – 80C IAA 175,19 NaOH 1N 00C IBA 203,24 NaOH 1N 00C Kinetin 215,22 NaOH 1N 00C NAA 186,21 NaOH 1N – 80C 2,4 – D 221,04 EtOH 50% – 80C ... 1.1: Cây Dã yên thảo tự nhiên a Cây Dã yên thảo đơn b Cây Dã yên thảo kép c Cây Dã yên thảo lượn sóng Chú ý: Đối với hoa Dã yên thảo kép thường bền hoa hoa Dã yên thảo đơn 6 1.1.4 Nhân giống. .. đề tài : Hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo (Petunia hybrida) 2 Mục đích Tìm công thức tốt nhất, để hoàn thiện quy trình vi nhân giống hoa Dã yên thảo, để tạo nên hoa thời gian... loại hoa Dã yên thảo 1.1.4 Nhân giống kỹ thuật chăm sóc Dã yên thảo 1.1.4.1 Nhân giống Dã yên thảo 1.1.4.2 Kỹ thuật chăm sóc hoa Dã yên thảo 1.1.5 Nhược điểm hoa Dã