Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến sự tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don.) (LV thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2017 ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn bảo suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực thí nghiệm nghiên cứu đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn; cảm ơn đóng góp ý kiến quý báu buổi seminar khoa học báo cáo đề cương luận văn Trong trình nghiên cứu, nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phòng Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn môn Sinh học đại GD sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để thực trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống, thầy cô cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iv MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố dừa cạn 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn 1.1.3 Tác dụng dừa cạn 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 1.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 10 1.4 Enzyme peroxidase (Prx) gen mã hóa Prx 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx 12 1.4.2 Gen mã hóa peroxidase (Prx) 13 1.5 Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 14 1.6 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 16 1.6.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 16 1.6.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 17 1.7 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu thực vật 20 v 2.1.2 Vật liệu di truyền 20 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 20 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.3.2 Phương pháp chuyển gen vào dừa cạn 22 2.3.3 Phân tích chuyển gen 26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 30 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens 30 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vi MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ung thư sức khỏe cộng đồng vấn đề ngày quan tâm hầu hết quốc gia giới Theo ước tính thống kê Tổ chức y tế giới (WHO) hàng năm toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mắc bệnh ung thư nửa số chết bệnh Vì vậy, nhiều nhà khoa học quan tâm tìm loại thuốc có tác dụng chống ung thư cao Ung thư có đặc điểm tăng trưởng không giới hạn di căn, khối u lành tính thường tự giới hạn, không xâm lấn di Hiện có ba phương pháp điều trị ung thư chủ yếu phẫu thuật, hóa trị, xạ trị Ngoài ra, có số phương pháp điều trị bắt đầu ứng dụng vào điều trị cho bệnh nhân ung thư sinh hóa, nội tiết, liệu pháp gen… Các liệu pháp điều trị ung thư sử dụng riêng rẽ kết hợp với nhau, loại điều trị phụ thuộc vào vị trí ung thư, mức độ lan, tuổi tình trạng sức khỏe bệnh nhân, chọn lựa điều trị sẵn có mục tiêu cho việc điều trị Các phương pháp gây tác dụng không mong muốn làm suy giảm sức đề kháng, mệt mỏi, rụng tóc, đau nhức Trong bối cảnh với phát triển Công nghệ Sinh học, nhà khoa học không ngừng quan tâm nghiên cứu để tìm hợp chất thứ cấp có giá trị đóng vai trò quan trọng ngành công nghệ dược phẩm việc sản xuất loại thuốc mới, có giá trị, số quan trọng nhóm dược phẩm điều trị ung thư Một số hợp chất thuộc nhóm alkaloid, terpenoid, phenolic, saponin chiết xuất từ số thực vật tiêu biểu thông đỏ, dừa cạn, trinh nữ hoàng cung, nấm linh chi, giảo cổ lam biết đến hợp chất có khả trị bệnh ung thư Dừa cạn có khả sản xuất indol alkaloid có dược tính quan trọng chế tạo loại thuốc chống ung thư, đặc biệt loại ung thư máu Trong indol alkaloid có mặt dừa cạn, hai loại alkaloid vinblastine vincristine sử dụng nhiều Nhưng chất lại có hàm lượng nhỏ dừa cạn, khoảng nửa khô chiết xuất 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm, chất tổng hợp đường hóa học có cấu trúc phức tạp Trong dừa cạn, vinblastine vincristine tạo từ kết hợp catharanthine vindoline Gen mã hóa enzyme peroxidase có chức xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho tổng hợp vinblastine vincristine Các nghiên cứu cho thấy giống dừa cạn có giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần chất vinblastine vincristine đạt cao Nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư cần thiết Vì lý trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don.)” Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme peroxidase Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase dừa cạn Phân tích biểu gen chuyển crPrx dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố dừa cạn Cây dừa cạn hay hải đằng, dương giác, dừa, trường xuân hoa, thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus Có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L) G.Don [24] Dừa cạn thuộc họ trúc đào Apocynaceae gồm có loài, loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, tất loài lại có nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất loài Catharanthus 2n=16 [7], [19] Tám loài thuộc giống là: Catharanthus coriaceus Markgr Madagascar; Catharanthus lanceus (Bojer ex A.D.C.) Pichon Madagascar; Catharanthus longifolius (Pichon) Phichon Madagascar; Catharanthus ovalis Markgr Madagasca; Catharanthus pusillus (Murray) G.Don India subcontinent; Catharanthus roseus (L) G Don Madagascar; Catharanthus scintulus (Pichon) Pichon Madagascar; Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon Madagascar [7], [19] Cây dừa cạn nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole phân lập từ giống khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng Trong đó, hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristien vinblastine cao [24] A B C Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don [24] A: Catharanthus roseus var roseus B: Catharanthus roseus var ocellatus C: Catharanthus roseus var albus Cây dừa cạn có nguồn gốc Madagasca (Châu Phi), mọc hoang trồng nhiều nước nhiệt đới ôn đới Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia… Cây dừa cạn người Pháp dưa vào trồng Việt Nam để làm cảnh Cây dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, chịu hạn tốt, không kén đất phải chăm sóc, cách chăm sóc không đặc biệt nên lâu sau lan nhiều địa phương, tỉnh đồng ven biển nước ta [7] Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng biển, tương đối tập trung tỉnh miền Trung Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định, Phú Yên Ở vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có mọc gần loại bãi cát rừng phi lao, trảng cỏ, bụi thấp, có khả chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn vùng cát ven biển Cây dừa cạn trồng khắp nơi nước để làm cảnh làm thuốc [7] 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn Cây dừa cạn thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành, có rễ phát triển, thân gỗ phía gốc, mềm phần Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng, mọc đối, thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước thường biến động tùy vùng phân bố dài 3cm – 6cm, rộng 2cm – cm Mỗi cành thường có – 15 cặp lá, có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt nhẵn, mặt có nhiều lông, mùa hoa vào tháng – tháng – 10 hàng năm [7] Hoa trắng hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ kẽ phía Quả gồm hai đại dài 2cm – 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng ngả hai bên, vỏ có vạch dọc, đầu tù, chứa 12 – 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, mặt hạt có hột thành đường chạy dọc [7] Rễ thường có rễ chùm rễ phụ, rễ đâm thẳng xuống đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [7] 1.1.3 Tác dụng dừa cạn Theo từ điển Cây thuốc Việt Nam, dừa cạn có vị đắng, tính mát, có độc, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng Dừa cạn nghiên cứu làm thuốc kìm hãm phát triển tế bào định điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính, số ung thư Ở Trung Quốc, dừa cạn dùng trị cao huyết áp, bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính ung thư, mụn nhọt độc Còn Nouvelle-Calédonie (châu Đại Dương), dừa cạn vị thuốc chống ung thư Ở Australia, nước hãm rễ dừa cạn loại thuốc dân gian chống tiểu đường [24] Trong tất phận dừa cạn chứa alkaloid Người ta chiết, phân lập 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu vinblastine, vincritine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, ajmalicin… Trong đó, ajmalicin có hiệu tốt điều trị rối loạn thần kinh tim Còn vinblastine vincristine có tác dụng làm ngừng phân chia tế bào pha Vì thế, chúng sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [7] Hoạt chất dừa cạn phụ thuộc vào nơi trồng thu hái Giống trồng Việt Nam đánh giá thảo dược tốt tương đương dừa cạn Madagascar, chứa khoảng 0,1 – 0,2% alkaloid toàn phần Tỉ lệ alkaloid rễ (0,7 – 2,4%) cao thân (0,46%) (0,37 – 1,15%) Các nước Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc… sức bào chế thuốc từ loại [19] Hiện nay, y khoa chưa tìm phương pháp điều trị bệnh bạch cầu tốt nên chiết xuất dừa cạn trở nên quý với bệnh nhân ung thư máu Tuy nhiên, cần dùng dừa cạn sắc lấy thuốc uống khỏi bệnh Vì để chữa bệnh ung thư cần liều vincristine, vinblastine có hàm lượng cao Nhưng dùng thành phần dễ bị ngộ độc nên cần có hướng dẫn bác sỹ điều trị Một số thuốc dân gian chữa bệnh ung thư dừa cạn: Chữa ung thư máu, viêm đại tràng: lấy từ 15 – 20 g thân dừa cạn khô vàng, sắc, chia từ – lần uống ngày Chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) cách sắc uống thân dừa cạn (khoảng 15g thân khô/ ngày) Điều trị u xơ tuyến tiền liệt: dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g; sắc uống ngày chia lần 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.1.1 Đặc điểm chung alkaloid Alkaloid chất hữu có chứa dị vòng nitơ có tính base, thường gặp nhiều loại thực vật tìm thấy vài loài động vật Bảng 2.1 Một số loại môi trường tái sinh Dừa cạn Loại môi Kí hiệu trường Nảy mầm hạt Thành phần MS + sucrose 30 g/ l + agar g/ l, pH = 5,8 (Germination GM medium) Đồng nuôi cấy MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES (Co-cultivation CCM 0,39g/ l + muối B5 0,3g/ l + AS 100 µM medium) Cảm ứng tạo đa chồi (Shoot MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES SIM induction 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l medium) Kéo dài chồi MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES (Shoot SEM elongation 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l medium) MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + Ra rễ (Rooting RM IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l medium) Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn Môi trường LB lỏng Thành phần Bacto pepton 10 g/ l + NaCl 10 g/ l + Yeast Extract g/ l, pH = LB đặc LB lỏng + agar 16 g/ l 24 2.3.1.1 Nguyên liệu biến nạp Khử trùng hạt cồn 70% lắc phút Sau ngâm hạt dung dịch nước tẩy (Javel 60%) lắc 15 phút Loại bỏ dung dịch nước tẩy rửa hạt nước cất khử trùng Hạt dừa cạn sau khử trùng cho nảy mầm môi trường MS Sau 10 – 14 ngày phát triển, tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen nuôi cấy in vitro 2.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm Cấy trải A tumefaciens cất giữ glycerol lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/ l rifamicin 50 mg/ l, nuôi 28oC 48 - 96 Sau đó, lấy khuẩn lạc vi khuẩn nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/ phút 28oC 16 – 18 Lấy 1ml dịch vi khuẩn nuôi hoạt hóa 10ml LB lỏng tốc độ 220 vòng/ phút 28oC – Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, 4oC 10 phút Loại bỏ dịch hoà tan cặn với môi trường 1/ MS pha loãng mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm = 0,8 2.3.1.3 Lây nhiễm đồng nuôi cấy Các mảnh mầm dừa cạn gây tổn thương mũi dao nhọn từ – lần vào phần nách mầm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100µM, 30 phút sau thấm khô Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh Quá trình đồng nuôi cấy diễn tối, 25 oC thời gian ngày 2.3.1.4 Cảm ứng tạo chồi môi trường SIM Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp rửa môi trường 1/ MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/ l với thời gian 10 phút, 25 sau thấm khô giấy thấm khử trùng Đặt mẫu lên môi trường tạo cảm ứng đa chồi (SIM) có bổ sung kanamycin 50 mg/ l 2.3.1.5 Kéo dài chồi Sau tuần, cụm chồi sống sót môi trường chọn lọc loại bỏ mầm chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) 2.3.1.6 Tạo rễ Khi chồi phát triển đạt kích thước từ – 3cm chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) để tạo hoàn chỉnh 2.3.1.7 Cây môi trường tự nhiên Cây có chiều cao – 10 cm rễ đạt từ – cm đưa giá thể, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp Sau tuần tưới dung dịch MS với tỷ lệ 1/ 10, ngày lần Sau đến tuần sống rễ mới, đưa môi trường 2.3.2 Phân tích chuyển gen 2.3.2.1 Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR Tách chiết DNA tổng số từ dừa cạn chuyển gen thực phản ứng PCR với cặp mồi 35S để xác định có mặt gen crPrx với thành phần bảng 2.5 theo chu trình nhiệt bước bảng 2.6 Kiểm tra kết điện di gel agarose 0,8% 26 Trình tự mồi 35S: F: 5’ – CAA CGT CTT CAA AGC AAG TGG – 3’ R: 5’ – TTC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C – 3’ Phương pháp tách chiết DNA tổng số - Cân 200 mg mẫu nghiền cẩn thận nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển vào ống E ppendorf ml - Bổ sung ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống Eppendorf ml, voltex tạo thành dịch đồng Ly tâm 12000 vòng/ phút (v/ p) phút ở 4oC - Loa ̣i dich ̣ và lă ̣p la ̣i bước – từ đế n lần - Bổ sung 0,8 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), lắ c đề u và giữ ở 65oC thời gian 30 phút đế n tiế ng - Giữ mẫu nhiệt đô ̣ phòng thời gian 10 phút - Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo thời gian 10 phút Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 phút 4oC - Hút dịch cho vào ống Eppendorf 1,5 ml - Bổ sung mô ̣t thể tích tương đương isopropanol (la ̣nh), đảo nhẹ, để đá 30 phút Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 phút 4oC - Loại bỏ dịch thu tủa, bổ sung 0,5 ml cồn 80% Ly tâm 12000 vòng/ phút phút 4oC (bước này thực hiêṇ lầ n), sau nhẹ nhàng loa ̣i bỏ ethanol - Làm khô DNA bằ ng quạt gió, máy hút chân không - Hòa tan DNA 100 µl nước khử ion Bổ sung µl RNase (10 mg/ ml) ủ 37oC - Bảo quản DNA tổng số -20oC 27 Bảng 2.3 : Hóa chấ t pha đê ̣m rửa Nồ ng đô ̣ Hóa chất STT Nồ ng đô ̣ sử du ̣ng Thể tích stock Tris- HCl pH 1M 100 mM ml EDTA pH 0,5 M mM 0,5 ml Sorbitol Bô ̣t 0,35 M 3,1885 g NaH2PO4 Bô ̣t 0,4% 0,5 g Thêm nước đế n thể tích cuố i cùng là 50 ml 50 ml Bảng 2.4: Hóa chấ t pha đê ̣m chiế t Nồ ng đô ̣ Hóa chất STT Nồ ng đô ̣ sử stock du ̣ng Thể tích CTAB Bô ̣t 2% 0,5 g NaCl 5M 1,4 M ml EDTA pH 0,5 M 20 mM ml Tris- HCl pH 1M 100 mM 2,5 ml β -MercaptoEthanol 0,1% 25 µl Thêm nước đế n thể tích cuố i cùng 25 ml 25 ml Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S Thành phần phản ứng STT Nồng độ Thể tích (µl) - 10 2X 12,5 H2O Master mix Mồi xuôi 10 pmol/ µl Mồi ngược 10 pmol/ µl AND/ cDNA 100 ng/ µl 0,5 Tổng 25 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây Gắn mồi 56 30 giây Kéo dài chuỗi 72 30 giây Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút Kết thúc phản ứng 15 ∞ Chu kỳ 30 Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR - Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45 – 50oC đổ vào khuôn gel chuẩn bị sẵn Sau 30 phút gel nguội đông cứng chuyển khay chứa gel vào máy điện di cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di cho đệm ngập gel khoảng 0,5 – cm - Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào giếng gel - Chạy điện di: Sau tra mẫu điện di xong, máy điện di kết nối với nguồn Đặt 120V, 90mA, 30 phút - Nhuộm gel dung dịch ethibium 15 phút - Quan sát: gel soi đèn tử ngoại, ADN phát sáng nhờ liên kết với EtBr - Chụp ảnh gel 2.3.2.3 Các phương pháp phân tích xử lý số liệu Hiệu suất chuyển gen xác định công thức: Số mang gen chuyển Hiê ̣u suấ t chuyể n gen (%) = x 100 (%) Tổ ng số mẫu biế n na ̣p 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens Hạt dừa cạn khử trùng cồn 70% lắc phút javen 60% lắc 15 phút, sau cho nảy mầm môi trường MS đến phát triển (hình 3.1 A-B), mầm tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu nhận gen B A C Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro A: Gieo hạt dừa cạn môi trường MS; B: Hạt phát triển thành con; C: Hai mảnh mầm 30 Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút (hình 3.2) Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn Sau thấm khô, cấy môi trường môi trường CCM Nuôi tối ngày (hình 3.3) Hình 3.3 Mảnh mầm môi trường đồng nuôi cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khô đặt lên môi trường SIM Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi môi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM Các chồi nhỏ sống sót kéo dài môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin chuyển sang môi trường rễ RM sau đem trồng lên giá thể (hình 3.7), tái sinh đưa môi trường tự nhiên Hình 3.7 Cây giá thể 33 Chúng tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A tumefaciens qua nách mầm hạt chín dừa cạn, giai đoạn nuôi cấy chọn lọc, kết sau: Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút Sau đồng nuôi cấy ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Các mẫu tạo chồi đưa sang môi trường chọn lọc để tránh mẫu chết sản sinh chất làm ức chế tái sinh mẫu tạo chồi Chồi đạt chiều cao – cm chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Cây có chiều cao – 10 cm rễ đạt từ – cm đưa giá thể Kết thu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn Lô thí Số mẫu thí nghiệm nghiệm Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi rễ Số sống giá thể Lần 300 100 32 18 Lần 366 97 33 22 ĐC 0* 50 0 0 ĐC*1 50 18 13 10 Ghi chú: * ĐC0 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh *ĐC1 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh mầm (Bảng 3.1) thu 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 40 chồi rễ khỏe mạnh thu 15 T0 phát triển giá thể 34 Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx, có bố trí hai lô đối chứng ĐC0 ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu) Kết lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), mầm bị đào thải kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng Các dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm trồng, chăm sóc môi trường tự nhiên khoảng tuần tiến hành thu mẫu để kiểm tra có mặt hoạt động gen chuyển crPrx 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn Trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật, nói, thành công sớm có giá trị lĩnh vực biểu protein thực vật việc sử dụng promoter định có nguồn gốc từ virus vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu gen ngoại lai hiệu trồng biến đổi gen Rất nhiều promoter sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật tiếp tục promoter chọn lựa nghiên cứu biểu nhanh, đơn giản với rủi ro thấp Một promoter sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu gen ngoại lai trồng biến đổi gen 35S Promoter 35S promoter dạng định có khả điểu khiển biểu gen mức độ cao, khả hoạt động mạnh nhiều loại mô nhiều loài cây, hoạt động mạnh hệ thống biểu tạm thời tế bào chuyển gen thực vật ổn định [5] Để kiểm tra có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S để khuếch đại gen cần xác định Tiến hành tách chiết, tinh DNA tổng số từ 15 dừa 35 cạn chuyển gen thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 0,8% thể hình 3.8 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1-15: sản phẩm PCR chuyển gen; (+): sản phẩm PCR 35S promoter; (-) sản phẩm PCR dừa cạn không chuyển gen Trên gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen crPrx (Hình 3.8), chạy điện di số 1-2-4-8-9-10-13 xuất băng DNA với kích thước khoảng 0,3 kb tương ứng kích thước ước tính cho 35S promoter xuất ngang với vị trí băng DNA điện di đối chứng dương (sản phẩm PCR 35S promoter) điều rằng, hệ gen dừa cạn chuyển gen số 1-2-4-8-9-10-13 (ký hiệu DT01- DT02- DT04- DT08- DT09DT010- DT013) có mặt gen crPrx Hiệu suất chuyển gen giai đoạn đánh giá đạt 7/ 666 = 1,05% Các dừa cạn chuyển gen dương tính với phản ứng PCR kết ban đầu đưa đến thành công quy trình chuyển gen crPrx vào dừa cạn Các dương tính với phản ứng PCR chăm sóc ưu tiên phát triển nhằm có phân tích khả hoạt động biểu gen chuyển crPrx 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Chuyển thành công gen crPrx vào dừa cạn nhờ Agrobacterium tumefaciens tạo 15 dừa cạn chuyển gen T0 trồng bầu đất môi trường tự nhiên 1.2 Gen chuyển crPrx xác định tồn hệ gen dừa cạn hệ T0 hiệu suất chuyển gen đạt 1,05 % Đề nghị Tiếp tục phân tích dòng dừa cạn chuyển gen qua hệ T1, T2, T3… nhằm chọn tạo dòng ổn định có khả tổng hợp vinblastine vincristine cao 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Hà, Lương Thanh Huyền, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2014), "Tách dòng phân tử gen mã hóa peroxidase từ hai giống dừa cạn Catharanthus roseus", Tạp chí khoa học công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 119(15) Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)", Tạp chí Khoa học, 4, pp 56 - 62 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), "Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus.", Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ - ĐHQG TPHCM, 9(6), pp 59 - 66 Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), "Nghiên cứu chiết tách alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định", Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 43, pp 85 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), "Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1), pp - 18 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), "Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp", NXB Nông nghiệp, Hà Nội Viện dược liệu (2001), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam", Nxb Khoa học Kỹ thuật, 1, pp 57 - 89 Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R (1992), "Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua", J Chem Ecol, 18(11), pp 1955–1964 Bùi Thị Hà, Chu Hoàng Mậu, Nguyên Thị Tâm, Đỗ Huy Hoàng (2016), "Nghiên cứu quy trình chuyển gen gus dừa cạn", Tạp chí Khoa học Công nghệ Thái Nguyên, 157, pp 71-75 10 Costa M.M., Hilliou F., Duarte P., Pereira L.G., Almeida I., Leech M., et al (2008), "Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant Physiol, 146(2), pp 403 - 417 11 Fattorusso E., Taglialatela O (2008), "Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology", Wiley-VCH, Weinheim, Germany 12 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A., et al (2011), "Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair", J Exp Bot, 62(8), pp 2841-2854 38 ... tài Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Mục tiêu nghiên cứu Tạo dòng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme. .. mã hóa enzyme peroxidase Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase dừa cạn Phân tích biểu gen chuyển crPrx dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU... 1.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 10 1.4 Enzyme peroxidase (Prx) gen mã hóa Prx 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx 12 1.4.2 Gen mã hóa peroxidase (Prx)