Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae wine yeasts: effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains Abstract The contribution of yeast fermentation metabolites to the aromatic profile of wine is well documented; however, the biotechnological application of this knowledge, apart from strain selection, is still rather limited and often contradictory Understanding and modeling the relationship between nutrient availability and the production of desirable aroma compounds by different strains must be one of the main objectives in the selection of industrial yeasts for the beverage and food industry In order to overcome the variability in the composition of grape juices, we have used a chemically defined model medium for studying yeast physiological behavior and metabolite production in response to nitrogen upplementation so as to identify an appropriate yeast assimilable nitrogen level for strain differentiation At low initial nitrogen concentrations, strain KU1 produced higher quantities of esters and fatty acids whereas M522 producedhigher concentrations of isoacids,-butyrolactone, higher alcohols and 3-methylthio-1-propanol We propose that although strains KU1 and M522 have a similar nitrogen consumption profile, they represent useful models for the chemical characterization of wine strains in relation to wine quality Sự sản xuất hợp chất thơm trình lên men rượu vang Saccharomyces cerevisiae: ảnh hưởng nitơ đồng hóa nấm men lên hai chủng mô hình Tóm tắt Sự đóng góp chất chuyển hóa lên men nấm men đến hương thơm rượu vang dẫn chứng tốt; Tuy nhiên, việc áp dụng công nghệ sinh học vào vấn đề này, việc lựa chọn chủng vi khuẩn, nhiều mặt hạn chế mâu thuẫn Để hiểu mô hình hóa mối liên hệ lượng dinh dưỡng việc sản xuất hợp chất hương thơm mong muốn chủng khác mục tiêu để lựa chọn ngành công nghiệp nấm men phục vụ cho ngành công nghiệp nước giải khát thực phẩm Để khắc phục biến đổi thành phần loại nước ép nho, sử dụng chủng mô hình xác định mặt hóa học cho việc nghiên cứu hoạt động sinh lý nấm men sản xuất chất chuyển hóa, đáp ứng với bổ sung đạm để xác định mức men nitơ đồng hóa thích hợp cho chủng khác Ở nồng độ nitơ ban đầu thấp, chủng KU1 sản xuất với số lượng lớn este acid béo M522 sinh nhiều isoacids,-butyrolactone, rượu 3-methylthio-1-propanol Chúng đề xuất chủng KU1 M522 có lượng tiêu thụ nitơ nhau, chúng tiêu biểu cho mô hình hữu ích đặc tính hóa học chủng loại rượu liên quan đến chất lượng rượu The differential production of aroma compounds by the two strains is discussed in relation to their capacity for nitrogen usage and their impact on winemaking The results obtained here will help to develop targeted metabolic footprinting methods for the discrimination of industrial yeasts Introduction The role of yeasts in the fermentation of sugars into alcohol and carbon dioxide has been known for more than two centuries (Anderson, 1989) However, well over a half century elapsed before the role of yeast strain in the production of different wines was established by Pasteur in 1866 (Pasteur, 1866) While the principal yeast used in today’s food and alcoholic beverage industries for the production of bread, beer, spirits, cider and wine is classified as Saccharomyces cerevisiae, it is well recognized that not all S cerevisiae strains are suitable for the fermentation process and the ability to produce quality foods and beverages differs significantly among them Because classical, physiological and genetic methods are of limited use in the characterization of wine-making yeast strains, researchers in wine biotechnology have been searching for new methods to reveal the genetic adaptations of industrial yeast strains of the same species, i.e S cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005) On the other hand, it is well established that S cerevisiae produces different concentrations of aroma compounds as a function of fermentation conditions and must treatments, for example, temperature, grape variety, micronutrients, vitamins and nitrogen composition of the must Moreover, many commercial yeasts produce undesirable off-flavors, such as S, and a high concentration of higher alcohols, acetic acid and ethyl acetate, depending on the concentration of Việc sản xuất hợp chất hương thơm khác từ hai chủng thảo luận liên quan đến khả sử dụng nitơ tác động đến sản xuất rượu vang Các kết thu giúp phát triển phương pháp footprinting trao đổi chất mục tiêu để phân biệt nấm men công nghiệp Giới thiệu Vai trò nấm men trình lên men đường thành rượu biết đến từ hai kỷ (Anderson, 1989) Tuy nhiên, nửa kỷ trôi qua trước vai trò nấm men sản xuất loại rượu vang khác tìm Pasteur vào năm 1866 (Pasteur, 1866) Trong men sử dụng ngành công nghiệp thực phẩm đồ uống có cồn để sản xuất bánh mì, bia, rượu mạnh, rượu táo rượu vang phân loại Saccharomyces cerevisiae, công nhận tất chủng S cerevisiae thích hợp cho trình lên men khả sản xuất thực phẩm chất lượng đồ uống khác đáng kể số Bởi phương pháp cổ điển, sinh lý di truyền bị hạn chế sử dụng đặc tính chủng nấm men rượu vang, nhà nghiên cứu công nghệ sinh học rượu vang tìm kiếm phương pháp để thích nghi di truyền chủng nấm men công nghiệp loài, tức S cerevisiae (Pretorius & Hoj, 2005) Mặt khác, thiết lập tốt để S cerevisiae sản xuất nồng độ hợp chất thơm khác dựa điều kiện lên men nghiên cứu, ví dụ: nhiệt độ, giống nho, vi chất dinh dưỡng, vitamin thành phần nitơ cần thiết Hơn nữa, nhiều nấm men thương mại hương vị tạo sản phẩm không mong muốn, chẳng hạn S, alcohol bậc cao, acid acetic ethyl acetate, tùy thuộc vào assimilable nitrogen present in the grape must (Bell & Henschke, 2005) Additionally, slow, sluggish and stuck fermentations have often been related to nitrogen deficiency (Bisson, 1999) In the late 1970s, these fermentation problems were partially solved by the addition of ammoniumsalts to deficient musts, which not only increased fermentation rate but also the sensory desirability of the wines (Bell & Henschke, 2005) As a consequence, the routine addition of ammoniacal nitrogen to musts to correct nitrogen limitation is widely used by enologists in most wine regions of the world Although today some useful methods are accessible for measuring the yeast assimilable nitrogen (YAN) content of grape musts inwineries, they are not commonly used, and so the cause and effect relationship that results in wines with an undesirable flavor is not usually correlated Initial studies have attempted to relate the yeast nitrogen demand concept with the profile of aroma compounds in wines Paradoxically, the various studies reported to characterize the yeast aroma compounds of wines made with various wine yeasts have not considered the importance of nitrogen level of the grape must or the fermentation medium utilized (Rankine, 1967; Rankine & Pocock, 1969; Daudt & Ough, 1973; Di Stefano et al., 1981; Cabrera et al., 1988; Cavazza et al., 1989; Giudici et al., 1990; Herraiz et al., 1990; Mateo et al., 1991; Delteil & Jarry, 1992; Longo et al., 1992; Lurton et al., 1995; Lema et al., 1996; Zoecklein et al., 1997; Antonelli et al., 1999; Vila et al., 2000; Romano et al., 2003) Moreover, many studies were conducted under conditions of excess nitrogen, above 300 mgN/L (Houtman & Du Plessis, 1986; Carrau, 2003) This experimental approach has, however, not proved to be suitable because nồng độ nitơ đồng hóa nho (Bell & Henschke, 2005) Ngoài ra, trình lên men chậm khó khăn thường liên quan đến thiếu hụt nitơ (Bisson99) Vào cuối năm 1970, vấn đề lên men giải phần cách cho thêm muối amoni, điều không tăng tốc độ trình lên men mà tạo mùi vị mong muốn loại rượu vang (Bell & Henschke, 2005) Như hệ quả, việc bổ sung thường xuyên nitơ amoniac để cung cấp nitơ sử dụng rộng rãi nhà làm rượu hầu hết vùng sản xuất rượu vang giới Mặc dù ngày số phương pháp hữu ích sử dụng để đo hàm lượng nitơ đồng hóa nấm men (YAN) nho sản xuất, chúng không sử dụng phổ biến, nguyên nhân ảnh hưởng kết sản xuất rượu với hương vị không mong muốn Nghiên cứu ban đầu cố gắng liên hệ khái niệm nhu cầu men nitơ với hợp chất thơm rượu vang Nghịch lý thay, nhiều nghiên cứu báo cáo mô tả hợp chất thơm tạo từ nấm men loại rượu vang khác nhau, có hàm lượng nitơ nho môi trường lên men không xem xét (Rankine, 1967; Rankine & Pocock, 1969; Daudt & ough, 1973; Di Stefano et al., 1981; Cabrera et al., 1988; Cavazza et al., 1989; Giudici et al., 1990; Herraiz et al., 1990; Mateo et al., 1991; Delteil & Jarry, 1992; Longo et al., 1992; Lurton et al., 1995; Lema et al., 1996; Zoecklein et al., 1997; Antonelli et al., 1999; Vila et al., 2000; Romano et al., 2003 ) Hơn nữa, nhiều nghiên cứu tiến hành điều kiện nitơ dư thừa, 300 mgNL-1 (Houtman & Du Plessis, 1986; Carrau, 2003) Cách tiếp cận này, nhiên, không xem phù hợp S cerevisiae yeast strains that show similar profiles of assimilable nitrogen consumption can nevertheless produce very different profiles of fermentation rate and aromatic compounds under industrial conditions of lower initial nitrogen levels (Jiranek et al., 1991; Carrau, 2003; Taillandier et al., 2007) There are few reports of investigations into the sensory characteristics of wines made with different strains under low nitrogen fermentation conditions (Carrau et al., 1993; Medina et al., 1997; Carrau, 2003) Only recently, have the first chemometric studies provided data on the significance of yeast aroma compounds to perceived flavor in wine (Smyth et al., 2005) From the chemical point of view, only a few studies have investigated the yeast aroma compounds of wines prepared under defined conditions of YAN contents similar to winemaking conditions (Bosso, 1996; Guitart et al., 1999; Nicolini et al., 2000a, b; Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005; Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005; HernandezOrte et al., 2006; Vilanova et al., 2007) Nevertheless, it is difficult to draw any firm conclusions concerning the relationship between YAN and the different aroma compounds produced by the yeast strains studied due to the different experimental conditions used The aim of this study was to characterize S cerevisiae strains for the production of key yeast aroma compounds (esters, alcohols, acids and lactones) after fermentation of a chemically defined medium, which models the nutrient composition of grape must covering a wide range of initial nitrogen concentrations The model yeast strains used in this study were selected from a wide group of strains because both showed similar nitrogen consumption when tested under different nitrogen conditions, chủng nấm men S cerevisiae tiêu thụ nitơ đồng hóa tạo khác tỷ lệ lên men hợp chất thơm điều kiện công nghiệp lượng nitơ ban đầu thấp (Jiranek et al 1991; Carrau, 2003; Taillandier et al 2007) Có vài báo cáo đặc tính loại rượu vang thực với chủng khác điều kiện lên men nitơ thấp (Carrau et al 1993; Medina et al., 1997; Carrau, 2003) Chỉ gần đây, có nghiên cứu mặt hóa học cung cấp liệu đáng kể tầm quan trọng hợp chất thơm hương vị rượu (Smyth et al 2005) Từ quan điểm hóa học vấn đề, có vài nghiên cứu hợp chất thơm từ nấm men chuẩn bị điều kiện lượng YAN xác định tương tự điều kiện sản xuất rượu vang (Bosso, 1996; Guitart et al, 1999; Nicolini et al., 2000a, b; Carrau, 2003; Bell & Henschke, 2005; Beltran et al., 2005; Carrau et al., 2005; Hernandez-Orte et al., 2006; Vilanova et al., 2007) Tuy nhiên, khó để rút kết luận chắn mối quan hệ YAN hợp chất thơm khác sản xuất chủng nấm men sử dụng nghiên cứu điều kiện thí nghiệm khác Mục đích nghiên cứu để mô tả chủng S cerevisiae sản xuất hợp chất men hương thơm (este, rượu, axit lactones) sau lên men môi trường xác định mặt hóa học, thành phần dinh dưỡng nho phải bao gồm loạt nồng độ nitơ ban đầu Các chủng nấm men sử dụng nghiên cứu lựa chọn từ nhóm lớn chủng chúng cho thấy việc tiêu thụ nitơ tương tự thử nghiệm điều kiện nitơ khác nhau, but from a sensory and chemical point of view they produced different wines at a low nitrogen concentration (75 mgN/L) The differential behavior of yeast strains at different initial nitrogen concentrations was examined for a better understanding of this phenomenon in our model system Application of these results for future discrimination of industrial yeast strains in relation to the type of aroma compounds produced will allow the development of data models for metabolic footprinting methods (Kell et al., 2005; Carrau et al., 2008) Materials and methods Yeast strains Saccharomyces cerevisiae strains utilized were: Montrachet UCD 522 (University of California, Davis), referred to as M522 in this work, and KU1 [Uruguayan selected strain, (Carrau et al., 1993; Medina et al., 1997)] Both strains are used in the commercial production of wine Inocula were prepared in the same synthetic medium by incubation for 12h in a rotary shaker at 150r.p.m and 25 Inoculum size was 5.105 cells/mL of medium for both strains The widely studied wine yeast strains, S cerevisiae M522 and KU1, were characterized as strains having similar nitrogen demands (i.e consuming a similar amount of nitrogen under 50–400mgN/L of YAN) Fermentation conditions Chemically defined fermentation medium (nutrient components of grape juice) was prepared as described previously (Henschke & Jiranek, 1993), but modified as follows: the total nitrogen content was adjusted to a basic amount of 50mgN/L with each amino acid and ammonium component added in từ điểm cảm quan hóa học vấn đề, chúng sản xuất loại rượu vang khác nồng độ nitơ thấp (75 mgN/L) Các hoạt động khác biệt chủng nấm men nồng độ nitơ ban đầu khác kiểm tra cho thấy hiểu biết tốt tượng hệ thống mô hình Áp dụng kết phân tích tương lai chủng nấm men công nghiệp liên quan đến loại hợp chất thơm sản xuất cho phép phát triển mô hình liệu phương pháp footpriting trao đổi chất (Kell et al., 2005; Carrau et al., 2008) Vật liệu phương pháp Chủng nấm men Chủng Saccharomyces cerevisiae sử dụng là: Montrachet UCD 522 (Đại học California, Davis), gọi M522 nghiên cứu này, KU1 (Carrau et al, 1993; Medina et al., 1997) Cả hai chủng sử dụng sản xuất thương mại rượu vang Chủng chuẩn bị môi trường tổng hợp tương tự cách ủ máy lắc 12 150 r.p.m 25 Hàm lượng chung cho tất chủng 5.105 tế bào/mL Các chủng nấm men rượu vang nghiên cứu rộng rãi, S cerevisiae M522 KU1, mô tả chủng có nhu cầu nitơ tương tự (nghĩa tiêu thụ số lượng tương tự nitơ 50-400 mgN/L YAN) Điều kiện lên men Môi trường lên men xác định thành phần hóa học (thành phần dinh dưỡng nước ép nho) chuẩn bị mô tả trước (Henschke & Jiranek, 1993) biến đổi sau: tổng hàm lượng nitơ điều chỉnh lượng 50 mgN/L với amino acid amonium thành phần thêm vào với tỉ lệ the same proportions as indicated previously (Henschke & Jiranek, 1993) Media with YAN concentrations of 75, 125, 180, 250 and 400mgN/L were made by increasing the basic concentration by supplementation with diammonium phosphate (DAP) None of these YAN amounts was a limiting concentration for complete fermentation of sugars by the yeast strains used The final pH of each medium was adjusted to 3.5 with HCl Equimolar concentrations of glucose and fructose were added to reach 120g/L and the mixed vitamins and salts as described previously (Henschke & Jiranek, 1993) Tween 80 was excluded from the medium because it was not found to be necessary for complete fermentation and it had a negative impact on the sensory characteristics of the resultant wines Ergosterol was added as the only supplemented lipid at a final concentration of 10 mg/L Fermentations were carried out in 125 mL of medium contained in 250mL Erlenmeyer flasks, closed with Muller valves, filled with pure sulfuric acid YAN was chosen as the variable for this investigation because it was found previously that this factor significantly affected production of fermentation aroma compounds by these yeasts under similar experimental conditions (Carrau, 2003) Static batch fermentation conditions were conducted at 20 in triplicate, simulating winemaking conditions Fermentation activity was measured as C weight loss and expressed in grams per 100 mL, and total residual sugars were analyzed using the Fehling method (Zoecklein et al., 1995) Once a day, samples were taken to measure cell growth in an improved Neubauer chamber Samples for sensory and GC-MS analysis were taken days after the end of fermentation, filtered through 0.45- pore membranes and S was added as giống mô tả trước (Henschke & Jiranek, 1993) Môi trường với nồng độ YAN 75, 125, 180, 250 400 mg N/L làm tăng nồng độ cung cấp diamonium phosphate (DAP) Không có nồng độ YAN nồng độ nồng độ giới hạn trình lên men hoàn toàn đường chủng nấm men sử dụng PH cuối môi trường điều chỉnh 3.5 với HCl Nồng độ đẳng phân tử glucose fructose thêm vào để đạt 120g/L hỗn hợp vitamin muối mô tả trước (Henschke & Jiranek, 1993) Tween 80 loại trừ khỏi môi trường không cần thiết cho trình lên men hoàn toàn có tác động tiêu cực lên đặc tính cảm quan rượu thành phẩm Ergosterol thêm vào nguồn bổ sung lipid nồng độ cuối 10mg/L Sự lên men thực 125mL môi trường chứa bình Erlenmeyer 250 mL, đóng lại van Muller, đầy nguyên chất YAN chọn biến số cho nghiên cứu nhận thấy yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng hợp chất lên men thơm chủng nấm men điều kiện thí nghiệm tương tự (Carrau, 2003) Điều kiện lên men tĩnh tiến hành 20oC lần, kích thích điều kiện làm rượu Hoạt động lên men đo hàm lượng đi, tính g/100mL tổng lượng đường lại phân tích phương pháp Fehling (Zoecklein et al., 1995) Mỗi ngày, mẫu lấy đo tăng trưởng tế bào phòng Neubauer cải tiến Mẫu cho phân tích cảm quan phân tích GC-MS lấy sau kết thúc trình lên men ngày, lọc qua màng lọc lỗ 0,45 thêm vào 50mg/L of sodium metabisulfite 50mg/L sodium metabisulfite Sensory analysis Phân tích cảm quan Fermentation products were subjected to sensory analysis through a paired preference test Fermentations at 75 mgN/L were presented to a trained panel of 12–15 persons, in order to determine the significance of the sensory differences between the strains Samples fermented with both strains with or without addition of YAN in the chemically defined medium containing the basic concentration of nitrogen (75 mgN/L) were presented to a group of five winemakers so as to evaluate aroma defects and positive characteristics A free description of desirability and aroma characteristics was presented in the tasting sheet Sản phẩm lên men phân tích cảm quan thông qua kiểm tra kết hợp 75mgN/L trình bày nhóm 12-15 người, để xác định ý nghĩa cảm quan khác chủng Mẫu lên men với hai chủng có thêm YAN môi trường xác định thành phần hóa học chứa nồng độ nitơ (75 mgN/L) trình bày nhóm người làm rượu để đánh giá thiếu mùi thơm đặc tính tốt trình bày bảng thử GC and GC-MS analysis Higher alcohols Higher alcohol and ethyl acetate analysis was performed by distillation of 50 mL of sample and direct injection of 0.5 of sample of the distillate and analyzed using the GC-FID with a glass column (2m x mm; Carbopack C, 60–80 mesh, 0.2% CW 1500, Supelco) in a Shimatzu C-17, equipped with EZ-CHROM software The experimental conditions were as follows: program temperature 65 (5 min), 60–150 at 4/min; injector temperature 200; and detection temperature, 250 The carrier gas was nitrogen (20 mL/min) Phân tích GC GC-MS Acohol bậc cao Phân tích alcohol bậc cao ethyl acetate thực chưng cất 50ml mẫu phun trực tiếp 0,5mẫu sản phẩm chưng cất phân tích GC-FID với cột thủy tinh (2m x 2mm, Carbopack C, 60-80 mắt lưới 0.2% CW 1500, Supelco) Shimatzu C-17, trang bị phần mềm EZ-CHROM Điều kiện thí nghiệm sau: nhiệt độ trình 65oC ( phút), 60– 150 oC 4/phút; nhiệt độ phun 200 Và nhiệt độ phát 250oC Khí mang nitơ (20 mL/phút) Aroma volatile compounds Extraction of aroma compounds was performed using adsorption and separate elution from an Isolute (IST Ltd, Mid Glamorgan, UK) ENV1 cartridge packed with 1g of a highly cross-linked styrenedivinyl benzene (SDVB) polymer Treatment of samples and GC analysis were Hợp chất thơm dễ bay Tách chiết hợp chất thơm thực hấp phụ ly giải từ Isolute(IST Ltd, Mid Glamorgan, UK) ENV + hạt đóng gói với 1g SDVB ( nhiều liên kết chéo styrene-divinyl benzene polymer) Xử lí mẫu phân tích GC thực performed as described previously (Boido et al., 2003) KU1 and unpleasant (soapy and sweaty) for M522, confirming our previous work with mô tả trước đó(Boido et al., 2003) Identification and quantification Nhận biết định lượng The components of wine aromas were identified by comparison of their linear retention indices, with pure standards or data reported in the literature Comparison of mass spectral fragmentation patterns with those stored on databases was also performed GC-FID and GC-MS instrumental procedures using an internal standard (1-heptanol) were applied for quantitative purposes, as described previously (Boido et al., 2003) Thành phần hương liệu rượu nhận biết cách so sánh số trì tuyến tính với tiêu chuẩn liệu ghi lại So sánh mẫu phân mảnh quang phổ khối lượng với liệu lưu trữ sở liệu Phương pháp GC-FID GC-MS sử dụng tiêu chuẩn nội (1-heptanol) áp dụng cho mục đích định lượng mô tả trước (Boido et al., 2003) Statistical analysis A stepwise discriminant analysis was carried out with the aroma compounds analyzed of the 12 wines produced using both strains in triplicate in a basic fermentation medium containing a initial YAN of 75 mgN/L, with and without an extra YAN addition of 63 mgN/L as DAP ANOVA for initial YAN concentration, yeast strain and aroma compounds were determined with STATISTICA 5.1 Differences of free volatile compounds were evaluated; the mean rating and least significant differences for initial YAN concentrations for each strain were calculated from an ANOVA Phân tích thống kê Phương pháp phân tích bước thực với việc phân tích hợp chất thơm 12 loại rượu sản xuất sử dụng chủng lần môi trường lên men chứa nồng độ YAN ban đầu 75 mgN/L, có thêm vào 63 mgN/L DAP ANOVA (phân tích phương sai) cho nồng độ YAN ban đầu, chủng nấm men hợp chất thơm xác định với STATISTICA 5.1 (phép thống kê) khác hợp chất dễ bay đánh giá; đánh giá trung bình khác biệt đáng kể cho nồng dộ YAN ban đầu chủng tính toán từ ANOVA Results A preference sensory test was performed where significant differences were found between fermentations of KU1 and M522 (P < 0.01) at a low nitrogen concentration (75 mgN/L), while no significant differences were found between them at a higher nitrogen concentration (400 mgN/L) At a low nitrogen concentration, wines were described as fruity and pleasant for Các kết Một thử nghiệm cảm quan thực nhiều nơi tìm thấy khác biệt trình lên men KU1 M522 (P < 0.01) nồng độ nitơ thấp (75 mgN/L), khác biệt đáng kể tìm thấy chúng nồng độ nitơ cao (400 mgN/L) Ở nồng độ nitơ thấp, rượu vang mô tả trái dễ chịu cho KU1 không dễ chịu cho M522, xác nhận kết nghiên cứu trước strains have a very different behavior at this nitrogen concentration On the other hand, addition of YAN to the low nitrogen concentration (75 mgN/L) of 63 mgN/L as these two strains (Carrau, 2003) Table shows the odor active values (OAV) of the main aroma compounds analyzed for these two nitrogen concentrations hai chủng này(Carrau, 2003) Bảng cho thấy giá trị nồng độ mùi (OAV) hợp chất thơm phân tích hai nồng độ nitơ Table Average OAV for the studied fermentations with the model strains at two YAN levels (75 and 400 mgN/L) Bảng OAV trung bình nghiên cứu trình lên men với chủng mô hình hai nồng độ YAN (75 400 mgN/L) On the left side, it can be seen that from the compounds that resulted in higher OAVs for KU1 at a low YAN level, four were described as fruity (esters) and the others were mediumchain fatty acids, considered as precursors of fruity esters Conversely, seven compounds that resulted in lower OAVs for KU1 at this YAN level were the higher alcohols and isoacids, corresponding to unpleasant aroma descriptions At the higher nitrogen concentration, although wines could not be differentiated by the sensory analysis, M522 produced high concentrations (OAVs) of practically all the compounds, indicating that chemically, Ở bên trái, thấy từ hợp chất OAVs KU1 cao mức YAN thấp, bốn hợp chất cho mùi trái (este) loại khác chuỗi axit béo trung bình, coi tiền thân este có mùi trái Ngược lại, bảy hợp chất KU1 cho kết OAVs thấp mức YAN alcohol bậc cao isoacids, với mùi hương khó chịu Ở nồng độ nitơ cao hơn, loại rượu vang phân biệt phân tích cảm quan, nồng độ cao (OAVs) tất hợp chất sản xuất M522, mặt hóa học, chủng có biểu khác nồng độ Điều kiện phát triển trình lên men ảnh hưởng đến chất chuyển hóa men dễ bay tạo hương thơm rượu Sự tăng trưởng động học trình lên men kinetics of the two strains were first characterized over the wide range of nitrogen concentrations utilized in this study (50–400 mgN/L) No significant differences in cell growth were found between strains (Fig 2a), but a significantly smaller total population was found for both strains in fermentations at an initial YAN of 75 mgN/L Fig (a) Growth response to different nitrogen concentrations for M522 and KU1 strains Results are the average of duplicate fermentations (b) Fermentation rate curves, determined by culture weight loss due to CO2 evolution for M522 and KU1 at low YAN concentrations (50–125 mgN/L) Results are the average of duplicate fermentations and SEs of the mean < 5% hai chủng hình mẫu nghiên cứu phạm vi nồng độ nitơ rộng (50-400 mgN/L) Không có khác biệt đáng kể tăng trưởng tế bào tìm thấy chủng (Hình 2a)., tổng sinh khối nhỏ đáng kể nhận thấy hai chủng lên men với nồng độ YAN ban đầu 75 mgN/L Hình (a) Đáp ứng tăng trưởng với nồng độ nitơ khác chủng M522 KU1 Kết mức trung bình trình lên men trùng lặp (b) Đường cong tỷ lệ lên men, xác định lượng môi trường trình tạo CO2 M522 KU1 nồng độ YAN thấp Kết trung bình trình lên men trùng lặp SEs có nghĩa < 5% Fermentation activity (C evolution rate) of the two strains was found to depend on the initial YAN concentration up to 125 mgN/L, (Fig 2b) All fermentations were completed (final residual sugars below g/L) at low nitrogen concentrations and fermentation curves were not significantly different for strains at higher YAN concentrations (data not shown) Production of higher alcohols and isoacids in response to initial nitrogen concentration Fig Relationship between the accumulation of higher alcohols and isoacids in wines made with two Saccharomyces cerevisiae yeast strains in response to the initial nitrogen concentration (a) Sum of 2-methyl-1- propanol, 2-methyl-1butanol and b-phenylethyl alcohol (b) Sum of the isobutanoic and isovaleric acids Hoạt động lên men ( tăng) hai chủng phụ thuộc vào nồng độ YAN ban đầu lên đến 125 mgN/L, (Hình 2b.) Tất trình lên men hoàn thành (lượng đường dư g/L) nồng độ nitơ thấp đường cong lên men khác không đáng kể hai chủng nồng độ YAN cao (dữ liệu hiện) Sản xuất alcohol bậc cao isoacids tương ứng với nồng độ nitơ ban đầu Hình Mối quan hệ tích lũy alcohol bậc cao isoacid rượu hai chủng Saccharomyces cerevisiae tương ứng với nồng độ nitơ ban đầu (a) Tổng 2-methyl-1- propanol, 2-methyl- 1-butanol b-phenylethyl alcohol (b) Tổng isobutanoic isovaleric acids (c) the major alcohol 3-methyl-1- butanol These compounds were produced by yeast strains M522 () and KU1 () in an artificial grape must medium and measured using GC and GC-MS as described in Material and methods Letters at each point indicate the significant differences (P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA calculated for each strain Error bars indicate SD The sum of the higher alcohols, 2-methyl-1propanol, 2-methyl-1-butanol and -phenylethyl alcohol is depicted in Fig 3a Both strains produced a similar profile for higher alcohols in relation to initial nitrogen, except that at each nitrogen concentration, strain M522 produced significantly higher concentrations of these compounds At low initial nitrogen concentrations (50–75 mg/L), a direct relationship was observed whereas at higher initial nitrogen concentrations an inverse relationship existed Above c 250 mgN/L, the production of higher alcohols reached a plateau 3-Methyl-1-butanol, which was produced at a considerably higher concentration than the remaining alcohols, showed a slightly different production profile (Fig 3c) in that its concentration slightly changed up to 200 mgN/L and above this concentration an inverse relationship existed up to the highest nitrogen concentration tested (400 mg/L) The production of isoacids by the two yeast strains in response to initial nitrogen was also studied Figure 3b, which shows the sum of isobutanoic (isoC4) and isovaleric (isoC5) acids, indicates a behavior similar to higher alcohols for both strains Strain M522 produced significantly higher concentrations of these compounds than KU1 Interestingly, an inverse relationship (c) Alcohol quan trọng 3-methyl-1- butanol Những hợp chất tạo chủng M522 () KU1 () môi trường dịch lên men nho tổng hợp phân tích GC & GC-MS mô tả phần nguyên liệu phương pháp Mỗi điểm khác đáng kể (PL < 0.05) theo kiểm tra LSD phép tính ANOVA cho chủng Đường sai số hiển thị SD Tổng alcohol bậc cao, 2-methyl-1propanol, 2-methyl-1-butanol -phenylethyl alcohol mô tả hình 3a Cả hai dòng sản xuất lượng alcohol bậc cao tương tự tương ứng với lượng nitơ ban đầu, ngoại trừ nồng độ nitơ, chủng M522 sản xuất hợp chất với nồng độ cao đáng kể Tại nồng độ nitơ ban đầu thấp (50-75 mg/L), mối liên hệ trực tiếp quan sát nồng độ nitơ ban đầu cao trái ngược Hơn 250 mgN/L, việc sản xuất alcohol bậc cao không thay đổi 3-metyl-1-butanol, sản xuất nồng độ cao đáng kể so với rượu lại, cho thấy hàm lượng sản xuất khác (Hình 3c) nồng độ thay đổi tới 200 mgN/L nồng độ thay đổi nồng độ nitơ cao kiểm tra (400 mg/L) Việc sản xuất isoacids hai chủng nấm men đáp ứng với lượng nitơ ban đầu nghiên cứu Hình 3b, cho thấy tổng lượng isobutanoic (isoC4) isovaleric (isoC5) axit, biểu đáp ứng tương tự alcohol bậc cao hai chủng Chủng M522 sản xuất hợp chất nồng độ cao đáng kể so với KU1 Điều đáng quan tâm là, mối quan hệ trái ngược between growth (Fig 2a) and higher alcohols and isoacids profiles (Fig 3a and b) was shown Production of 1-propanol in response to different initial YAN concentrations Fig Relationship between 1-propanol production and initial YAN concentration for M522 () and KU1 (◊) yeast strains Letters at each data point indicate the level of significant difference (P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA calculated for each strain Error bars indicate SD of the mean value A clear exception among the higher alcohols is 1-propanol as shown in Fig In this case, a positive relationship between 1-propanol production and initial YAN was observed across the whole range of nitrogen concentrations studied In contrast to the trends shown by the other higher alcohols, the behavior of each strain is significantly different at moderate to high YAN concentrations exceeding c 150 mgN/L Strain KU1 produced higher concentrations of 1-propanol at moderate to higher concentrations of YAN tăng trưởng (Hình 2a) alcohol bậc cao (Hình 3a b) isoacids sinh Sự sản xuất 1-propanol tương ứng với nồng độ YAN ban đầu khác Hình Mối quan hệ sản xuất 1-propanol nồng độ YAN ban đầu hai chủng nấm men M522 () KU1 (◊) Mỗi điểm liệu mức độ khác (P < 0.05) theo thử nghiệm LSD phép tính ANOVA cho chủng Đường sai số cho thấy SD khoảng có nghĩa Một ngoại lệ rõ ràng alcohol bậc cao 1-propanol Hình Trong trường hợp này, mối quan hệ tích cực lượng 1-propanol sinh nồng độ YAN ban đầu quan sát thấy toàn phạm vi nồng độ nitơ nghiên cứu Ngược lại với xu hướng thể alcohol bậc cao khác, biểu dòng khác đáng kể với nồng độ YAN từ trung bình đến lớn c 150 mgN/L Chủng KU1 sản xuất nồng độ cao 1-propanol ứng với nồng độ từ trung bình đến cao YAN strains (a) Sum of esters (isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate and ethyl decanoate); (b) sum of fatty acids (C4, C6, C8 and C10); and (c) ethyl acetate Letters at each data point indicate the level of significant difference (P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA calculated for each strain Error bars indicate SD of the mean value The production of esters (sum of isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate and ethyl decanoate) and fatty acids (C4, C6, C8 and C10) by the two strains M522 and KU1 is shown in Fig These results indicate a similar behavior for the two groups of compounds; however, the two strains produced different patterns in relation to the initial YAN concentration KU1 produced a higher concentration of these compounds at lower YAN Production of esters and fatty acids in response to different initial YAN concentrations Sự sản xuất este acid béo tương ứng với nồng độ YAN ban đầu khác Fig Relationship between the production of esters and fatty acids and initial YAN concentration for M522 () and KU1 (◊) yeast Hình Mối quan hệ sản xuất este acid béo với nồng độ YAN ban đầu hai chủng nấm men M522 () KU1 (◊) (a) Tổng este (isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate and ethyl decanoate); (b) Tổng acid béo (C4, C6, C8 C10); (c) ethyl acetate Mỗi điểm liệu cho thấy mức độ khác đáng kể (P < 0.05) theo thử nghiệm LSD phép tính ANOVA cho chủng Đường sai số cho thấy SD khoảng có nghĩa Việc sản xuất este (tổng isoamyl acetate, ethyl hexanoate, ethyl octanoate ethyl decanoate) axit béo (C4, C6, C8 C10) hai chủng M522 KU1 trình bày hình.5 Những kết cho thấy biểu tương tự hai nhóm hợp chất; Tuy nhiên, hai chủng sản xuất lượng khác liên quan đến nồng độ YAN ban đầu nồng độ YAN thấp concentrations relative to M522 up to 125 mgN/L, beyond which signifi cantly lower concentrations of volatiles were produced by KU1 Although ethyl acetate showed a profile similar to those observed for the other esters studied, it was produced at a relatively higher concentration and so its response pattern is presented separately in Fig 5c Interestingly, as can be seen, the behavior of esters and fatty acids, mainly the ethyl acetate, is the reverse of that observed for 1-propanol for each strain (see Fig 4) KU1 showed a reverse behavior compared with M522 in these compounds Other esters and alcohols Fig Production of other volatile compounds that show variability in response to the initial YAN concentration by M522 () and KU1 (◊) yeast strains (a) -phenylethyl ester and (b) the 3-methylthio-1-propanol Letters at each data point indicate the level of significant difference (P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA calculated for each strain Error bars indicate SD of the mean value Phenylethyl acetate is presented separately because its formation pattern, in response to the initial nitrogen concentration in the medium, differed from that for the other esters, showing a more similar profile to those of the higher alcohols so với M522 KU1 sản xuất hợp chất với nồng độ cao lên đến 125 mgN/L, hàm lượng chất bay thấp đáng kể Mặc dù etyl acetate biểu tương tự este khác nghiên cứu, sản xuất nồng độ tương đối cao mô hình phản ứng trình bày riêng hình.5c Đáng quan tâm biểu este axit béo, chủ yếu ethyl acetate, trái ngược 1propanol quan sát dòng (xem Hình 4) Ở hợp chất KU1 cho thấy biểu trái ngược so với M522 Các este rượu khác Hình Sự sản xuất hợp chất dễ bay cho thấy khác tương ứng với nồng độ YAN ban đầu hai chủng M522 () KU1 (◊) (a) -phenylethyl ester; (b) 3methylthio-1-propanol Mỗi điểm liệu cho thấy mức độ khác đáng kể (P < 0.05) theo thử nghiệm LSD phép tính ANOVA cho chủng Đường sai số cho thấy SD khoảng có nghĩa Phenylethyl acetate trình bày riêng biệt mô hình biểu chúng với nồng độ nitơ ban đầu môi trường, khác với este khác, tương tự với alcohol bậc cao While 3-methylthio-1- propanol showed a response profile similar to the other higher alcohols, as shown in Fig 2a, the behavior of the two strains was significantly different for these compounds as, shown in Fig KU1 produced lower concentrations of these compounds at all initial YAN concentrations Production of γ-butyrolactone and ethyl-4- hydroxybutanoate in response to initial YAN concentrations Fig Production of γ-butyrolactone (a) and ethyl 4-hydroxybutanoate (b) in response to the initial YAN concentration by M522 () and KU1 (◊) yeast strains Letters at each data point indicate the level of significant difference (P < 0.05) according to an LSD test of ANOVA calculated for each strain Error bars indicate SD of the mean value Figure 7a shows g-butyrolactone production, one of the main lactones present in wines, which showed a behavior similar to the higher alcohols M522 produced higher concentrations of this lactone at all YAN concentrations, with a maximum of 125 mgN/L compared with 75 mgN/L for the higher alcohols Figure 7b shows the behavior of ethyl-4hydroxybutanoate, a compound that could be metabolically related to g-butyrolactone as discussed below The profile of lactone production by M522 was consistent with Trong 3-methylthio-1-propanol biểu tương tự alcohol bậc cao khác, thể Hình 2a, biểu hai chủng khác đáng kể với hợp chất thể Hình KU1 sản xuất hàm lượng thấp hợp chất với nồng độ YAN ban đầu Sự sản xuất γ-butyrolactone and ethyl - - hydroxybutanoate tương ứng với nồng độ YAN ban đầu khác Hình Sự sản xuất γ-butyrolactone (a) ethyl 4-hydroxybutanoate (b) tương ứng với nồng độ YAN ban đầu hai chủng nấm men M522 () KU1 (◊) Mỗi điểm liệu cho thấy mức độ khác đáng kể (P < 0.05) theo thử nghiệm LSD phép tính ANOVA cho chủng Đường sai số cho thấy SD khoảng có nghĩa Hình 7a cho thấy sản xuất γbutyrolactone, lactone loại rượu vang, tương tự alcohol bậc cao M522 sản xuất nồng độ cao lactone nồng độ YAN, tối đa 125 mgN/L so với 75 mgN/L alcohol bậc cao Hình 7b cho thấy biểu etyl-4-hydroxybutanoate, hợp chất trình trao đổi chất liên quan đến γ -butyrolactone thảo luận Sự sản xuất lactone M522 phù hợp với this similar metabolic relationship between the two compounds However, this is not the case for KU1, where a reverse behavior is observed at a YAN of 125 mgN/L Discussion Researches on the chemical identification of aroma compounds in wine derived from the metabolic activity of yeasts have been reported widely in the literature during the last decades (Houtman & Du Plessis, 1986; Rapp & Versini, 1996; Lambrechts & Pretorius, 2000; Swiegers et al., 2005) From these studies, it can be concluded that various fermentation products, including ethyl esters, acetates, higher alcohols, fatty acids and thiols, are especially important to the sensory perception of different wine types (Ferreira et al., 1996; Guth & Sies, 2002; Smyth et al., 2005; Cozzolino et al., 2006) While this research provides important information on the sensory significance of yeast volatile compounds, more focused research is required on the physiological regulation of these compounds for the benefit of the alcoholic beverage industries, such as wine and beer production A lack of recognition of the importance of defining the nitrogen content of media in relation to aroma compounds has produced considerable discrepancies and misunderstandings in the literature The results presented in this work will facilitate a better understanding of the importance of the appropriate YAN concentration for yeast characterization in relation to aroma compounds Table shows the OAV of the compounds that are shown in the different figures Although most of the compounds studied showed significant chemical and OAV differences between strains, mối quan hệ trao đổi chất tương tự hai hợp chất Tuy nhiên, điều không phù hợp cho KU1, có biểu trái ngược quan sát thấy nồng độ YAN 125 mgN/L Thảo luận Các nghiên cứu nhận biết hóa học hợp chất thơm rượu có nguồn gốc từ hoạt động trao đổi chất nấm men công khai rộng rãi tạp chí thập kỷ qua (Houtman & Du Plessis, 1986; Rapp & Versini, 1996; Lambrechts & Pretorius, 2000; Swiegers et al., 2005) Từ nghiên cứu này, kết luận sản phẩm lên men khác nhau, bao gồm ethyl esters, acetates, higher alcohols, axit béo thiol, đặc biệt quan trọng nhận thức cảm quan loại rượu khác (Ferreira et al, 1996; Guth & SIES, 2002; Smyth et al, 2005; Cozzolino et al, 2006…) Trong nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng cảm quan trọng yếu hợp chất dễ bay nấm men, nghiên cứu tập trung vào yêu cầu quy tắc sinh học hợp chất lợi ích ngành công nghiệp đồ uống có cồn, chẳng hạn sản xuất rượu bia Sự thiếu hiểu biết tầm quan trọng xác định hàm lượng nitơ môi trường có liên quan đến việc sản xuất hợp chất thơm làm khác biệt đáng kể gây hiểu lầm khoa học Các kết trình bày nghiên cứu tạo điều kiện cho hiểu biết tốt tầm quan trọng nồng độ YAN thích hợp cho đặc tính nấm men liên quan đến hợp chất thơm Bảng cho thấy OAV hợp chất thể liệu khác Mặc dù hầu hết nghiên cứu cho thấy hóa chất trọng yếu khác biệt OAV chủng, some of them may not contribute to the sensory characteristics of a wine at the studied concentrations This is the case for ethyl decanoate, 1-propanol and gbutyrolactone However, from the chemical point of view some interesting changes in the behavior of both strains for all the compounds studied may contribute to chemical yeast discrimination if an appropriate nitrogen concentration is used in a chemically defined medium In the case of higher alcohols’s production, except for 1-propanol, the response to the initial nitrogen concentration varies between reports, but, in general, is described by an inverse relationship However, a nitrogendependent biphasic response pattern of higher alcohol production involving a direct positive relationship at low initial nitrogen concentrations and an inverse relationship at higher initial concentrations was described for beer yeasts many years ago by Ayrapaa (1967, 1968, 1971) Interestingly, little attention has been directed toward this phenomenon since these studies were published In fact, most of the recent studies were performed using higher concentrations of nitrogen (exceeding 100 mgN/L), with which only an inverse response is usually observed Moreover, we believe that our report is the first to describe comprehensively the behavior of isoacid production in response to different initial nitrogen concentrations The nitrogen-dependent common trend for production of isoacids and higher alcohols suggests that their metabolism and production may be coordinated as reported previously (Nordstrom, 1964; Reazin et al., 1970) On the other hand, we suggest that the significantly higher production of higher alcohols and isoacids by M522 could reflect a less efficient usage of nitrogen, resulting in an increase of carbon flux related to branched-chain amino acid số chúng không góp phần vào đặc điểm cảm quan loại rượu nồng độ nghiên cứu Đây trường hợp ethyl decanoate, 1-propanol γ -butyrolactone Tuy nhiên, từ quan điểm hóa học, số thay đổi đáng quan tâm biểu hai chủng cho tất hợp chất nghiên cứu đóng góp cho phân biệt hóa học nấm nem nồng độ nitơ thích hợp sử dụng môi trường hóa học xác định Trong trường hợp sản xuất alcohol bậc cao, ngoại trừ 1propanol, phản ứng với nồng độ nitơ đầu có khác báo cáo, nhưng, nói chung, mô tả mối quan hệ nghịch đảo Tuy nhiên, mô hình phản ứng hai giai đoạn phụ thuộc vào nitơ sản xuất alcohol bậc cao bao gồm mối quan hệ tích cực trực tiếp nồng độ nitơ ban đầu thấp mối quan hệ nghịch đảo nồng độ ban đầu cao mô tả cho nấm men sản xuất bia nhiều năm trước Ayrapaa (1967, 1968, 1971) Điều đáng quan tâm ý hướng tượng nghiên cứu công bố Trong thực tế, hầu hết nghiên cứu gần thực với nồng độ nitơ cao (vượt 100 mgN/L), mà phản ứng nghịch quan sát thấy Hơn nữa, tin báo cáo báo cáo mô tả toàn diện biểu sản xuất isoacid để đáp ứng với nồng độ nitơ ban đầu khác Xu hướng chung sản xuất isoacids alcohol bậc cao phụ thuộc vào nitơ cho thấy trao đổi chất sản xuất chúng phối hợp báo cáo trước (Nordstrom, 1964; Reazin et al, 1970) Mặt khác, cho việc sản xuất cao đáng kể alcohol bậc cao isoacids M522 phản ánh việc việc sử dụng nitơ hiệu quả, dẫn đến gia tăng khí carbon liên quan đến chuyển hóa chuỗi nhánh amino acid metabolism by this strain These model strains would be useful for further studies for a better understanding of the different genetic (BAT and ARO genes) and/or physiological [NAD(P)H/NAD(P) balances] adaptations that could explain the differences found here Our results suggest that KU1, which produces less higher alcohols and isoacids at all the nitrogen concentrations tested, when compared with M522, might regulate more effectively the carbon flux at any given nitrogen availability–resulting in the excretion of less quantities of ‘carbon metabolic wastes’ (Ribereau-Gayon et al., 2000) from the cell at all initial nitrogen concentrations In addition, the direct positive relationship of these compounds at a low initial concentration could be explained by the very low yeast fermentation activity in this situation, as shown in Fig 2, which is induced by the low biosynthetic capacity of the cell These results are in agreement with the first gene expression analysis conducted in an industrial strain (Backhus et al., 2001), where, at a low nitrogen level (53 mgN/L) compared with a high nitrogen level (400 mgN/L), cultures display greater expression of genes involved in translation and in oxidative carbon metabolism, suggesting that respiration is more nitrogen conserving than fermentation (Backhus et al., 2001) In contrast to other higher alcohols, 1propanol is known to be formed by the condensation of pyruvic acid and acetyl CoA (Nykanen, 1986) Our results are in agreement with previous studies (Ayrapaa, 1968; Margheri et al., 1984); however, the formation of 1-propanol varied in relation to nitrogen level for the two strains (Fig 4) Strain M522 produced relatively higher concentrations of 1-propanol at lower nitrogen concentrations but relatively less at dòng Những chủng mô hình hữu ích cho nghiên cứu cung cấp hiểu biết tốt di truyền khác (gen BAT ARO) / đáp ứng sinh học [cân NAD(P)H / NAD(P)] giải thích khác biệt tìm thấy Kết cho thấy rằng, KU1 sản xuất alcohol bậc cao isoacids tất nồng độ nitơ thử nghiệm, so sánh với M522, điều chỉnh hiệu chuyển đổi cacbon nồng độ nitơ có sẵn-kết lượng “chất thải chuyển hóa carbon” (Ribereau-Gayon et al., 2000) tạo từ tế bào tất nồng độ nitơ ban đầu Ngoài ra, mối quan hệ tích cực trực tiếp hợp chất nồng độ ban đầu thấp giải thích hoạt động lên men nấm men thấp tình này, thể Hình 2, gây lực sinh tổng hợp thấp tế bào Các kết phù hợp với phân tích biểu gen tiến hành chủng công nghiệp (Backhus et al., 2001), mức nồng độ nitơ thấp (53 mgN/L) so với mức độ nitơ cao (400 mgN/L), dòng cho thấy biểu cao gen dịch mã trình chuyển hóa carbon oxy hóa, cho thấy hô hấp bảo tồn nitơ lên men (Backhus et al., 2001) Ngược lại với alcohol bậc cao khác, 1propanol hình thành ngưng tụ acid pyruvic acetyl CoA (Nykanen, 1986) Kết đồng thuận với nghiên cứu trước (Ayrapaa, 1968; Margheri et al., 1984); Tuy nhiên, hình thành 1-propanol hai chủng thay đổi liên quan đến lượng nitơ (Hình 4) Chủng M522 sản xuất lượng 1propanol tương đối cao nồng độ nitơ thấp sản xuất tương đối higher nitrogen levels This reversal in production in relation to nitrogen availability does not appear to have been reported before Moreover, fact that the relative concentration of 1-propanol produced in response to nitrogen is generally reversed for ethyl acetate with respect to each of the strains would be an interesting topic for further research In addition, our results indicated an indirect relationship between higher alcohol and isoacid production and growth (see Figs 2a and 3a) The effect of some aromatic alcohols, such as tryptophol, isoamyl alcohol and b-phenylethyl alcohol, acting as auto-signaling molecules capable of stimulating morphogenesis in S cerevisiae (Hazelwood et al., 2008), may explain this behavior Furthermore, a quorumsignaling pathway linking environmental sensing and entry into the stationary phase in S cerevisiae has been described recently (Chen & Fink, 2006) As can be seen in our data, these results might help to explore the occurrence of other putative quorumsensing molecules in S cerevisiae Production of esters and fatty acids Yeasts synthesize fatty acids by the hydrolysis of the acylCoA derivatives and esters by esterification of activated fatty acids and alcohols The results obtained here showed a clear metabolic correlation between these compounds (Fig 5) Acetate esters are described as having fruity aromas and are considered as pleasant flavors from a sensory point of view (Smyth et al., 2005) The results obtained in the present work may provide an explanation for the more pleasant sensory character of the wines obtained with KU1 at a low nitrogen concentration compared with M522, which are also in agreement with the OAVs shown in Table mức độ nitơ cao Sự đảo ngược sản xuất liên quan đến khí nitơ sẵn có không xuất báo cáo trước Hơn nữa, thực tế nồng độ tương đối 1-propanol sản xuất để đáp ứng với nồng độ nitơ thường ngược với ethyl acetate chủng chủ đề thú vị để nghiên cứu thêm Ngoài ra, kết cho thấy mối quan hệ gián tiếp sản xuất alcohol bậc cao isoacid với tăng trưởng (xem Hình 2a 3a) Tác dụng số loại rượu thơm, tryptophol, isoamyl alcohol b-phenylethyl, hoạt động phân tử tự động phát tín hiệu có khả kích thích hình thái S cerevisiae (Hazelwood et al., 2008), giải thích tượng Hơn nữa, đường phân tử tín hiệu kết nối cảm biến môi trường vào pha tĩnh S cerevisiae mô tả gần (Chen & Fink, 2006) Như thấy liệu chúng tôi, kết giúp khám phá xuất phân tử tín hiệu cảm ứng giả định khác S cerevisiae Sự sản xuất este acid béo Nấm men tổng hợp acid béo thủy phân dẫn xuất acyl-CoA, tổng hợp este este hóa acid béo alcohol hoạt hóa Các kết cho thấy cách rõ ràng chuyển hóa tương quan hợp chất (hình 5) Este acetate có mùi hương trái xem mùi hương dễ chịu theo cảm quan (Smyth et al., 2005) Những kết thu nghiên cứu đưa lời giải thích cho đặc tính dễ chịu loại rượu thu với KU1 so với M522 nồng độ nitơ thấp, điều với OAVs thể bảng The behavior of strain KU1, in which higher concentrations of these compounds are produced when nitrogen availability is low, contradicts the concept raised in many reports stating that the increase in ester production is directly related to the increase of nitrogen in the must On the other hand, this contradictory behavior of KU1 could also explain why several studies did not observe a consistent correlation between YAN grape musts and esters and fatty acid concentration (Rapp & Versini, 1996; Lambrechts & Pretorius, 2000) Esters and fatty acids have also been considered ‘metabolic wastes’ with a potentially toxic effect on the cell (Peddie, 1990) A limited production of these compounds by KU1 at a high nitrogen concentration compared with M522 can be understood as an efficient behavior of this strain in relation to nitrogen usage More interestingly, the profiles of fatty acids and esters obtained with KU1 are quite similar to the higher alcohol and isoacid profiles shown in Fig 3a, b Production of -butyrolactone, 3methylthio-1- propanol and ethyl 4hydroxybutanoate Limited information about the production of these compounds by yeast can be found in the literature Although -butyrolactone was characterized as being negatively related to YAN level in grape must (Bosso, 1996), our results, which were obtained over a very wide range of nitrogen concentrations, showed a direct relationship with low nitrogen levels Such low nitrogen levels have not been considered in other reports The profile of -butyrolactone production also resembles that of higher alcohols and isoacids The relation of -butyrolactone with ethyl-4hydroxybutanoate production was proposed previously (Muller et al., 1973) however, an important strain difference was observed Những hoạt động dòng KU1, hợp chất tạo với nồng độ cao nitơ có sẵn thấp, mâu thuẫn với khái niệm nêu báo cáo nói tăng sản phẩm este chắn liên quan trực tiếp với tăng nitơ Mặt khác, biểu mâu thuẫn KU1 giải thích số nhà nghiên cứu không quan sát mối tương quan thích hợp YAN nước ép nho với este nồng độ acid béo (Rapp & Versini, 1996; Lambrechts & Pretorius, 2000) Este acid béo xem “chất thải chuyển hóa” có khả gây độc cho tế bào (Peddie, 1990) Sự hạn chế sản xuất hợp chất KU1 nồng độ nitơ cao so với M522 hiểu biểu hiệu chúng việc sử dụng nitơ Đáng quan tâm hơn, cấu hình acid béo este thu KU1 tương tự alcohol bậc cao nồng độ isoacid thể hình 3a,b Sự sản xuất -butyrolactone, 3methylthio-1-propanol and ethyl 4hydroxybutanoate Thông tin hạn chế việc sản xuất hợp chất nấm men tìm thấy tài liệu Mặc dù đặc trưng -butyrolactone không liên quan đến mức độ YAN nước ép nho (Bosso, 1996), theo kết chúng ta, thu phạm vi nồng độ nitơ rộng, cho thấy mối quan hệ với nồng độ nitơ thấp Lượng nitơ thấp không xem xét báo khác Các thông tin việc sản xuất -butyrolactone giống với alcohol bậc cao isoacid Mối quan hệ việc sản xuất -butyrolactone ethyl 4-hydroxybutanoate đề xuất trước (Muller et al., 1973); nhiên, khác biệt quan trọng quan sát for KU1 in ethyl-4-hydroxybutanoate production Recently, 3-methylthio-1propanol production was described to be negatively related to the nitrogen concentration of the medium (Moreira et al., 2002) However, our results showed a different behavior for M522 at lower nitrogen levels, indicating a positive relation with this thioalcohol (Fig 6b), which is more consistent with the general behavior of higher alcohols shown in Fig In summary, depending on the yeast strain utilized, the formation of aroma compounds presented different responses when nitrogen was added to the medium Nitrogen addition could also decrease ester and fatty acid concentration during fermentation of a strain, such as KU1, a phenomenon not described previously to the best of our knowledge From a chemical point of view, in our artificial medium, it was possible to obtain a clear discrimination between both model strains evaluated through the analysis of key compounds produced after fermentation like higher alcohols, fatty acids, ethyl esters and lactones Major differences between strains in relation to aroma compound concentrations were obtained at a higher nitrogen level (400 mgN/L) Based on these two strains and the appropriate conditions determined in this work, our results will allow the development of data models for metabolic footprinting methods for industrial yeast strain discrimination From a biotechnological point of view, the results obtained had shown a better adaptation of strains such as KU1 for the fermentation of grape varieties with considerably variable character such as most of the red Vitis vinifera and some white grapes such as Sauvignon Blanc, Chardonnay, Riesling and Muscats KU1 sản xuất ethyl 4hydroxybutanoate Gần đây, sản xuất 3methylthio-1-propanol biết không liên quan đến nồng độ nitơ môi trường (Moreira et al., 2002) Tuy nhiên, kết cho thấy biểu khác M522 nồng độ nitơ thấp, mối liên quan với thioalcohol (hình 6b), phù hợp với biểu chung alcohol bậc cao hình Tóm lại, tùy thuộc vào chủng nấm men sử dụng, hình thành hợp chất thơm đưa câu trả lời khác cho việc nitơ thêm vào môi trường Nitơ thêm vào làm giảm nồng độ este acid béo suốt trình lên men chủng, KU1, biểu không mô tả trước đem đến kiến thức tốt cho Từ tầm nhìn hóa học, môi trường nhân tạo chúng tôi, có phân biệt rõ ràng việc đánh giá mô hình chủng thông qua việc phân tích hợp chất quan trọng sản xuất sau trình lên men alcohol, acid béo, ethyl ester lactone Sự khác chủ yếu chủng liên quan đến nồng độ hợp chất thơm tạo mức nitơ cao (400 mgN/L) Dựa chủng điều kiên thích hợp xác định nghiên cứu này, kết cho phép phát triển mô hình liệu cho phương pháp có trước ngành công nghiệp phân biệt chủng nấm men Từ tầm nhìn công nghệ sinh học, kết thu cho thấy thích nghi tốt chủng KU1 cho trình lên men nhiều loại nho với đăc tính biến đổi phần lớn Vitis vinifera đỏ vài nho trắng Sauvinon Blanc, Chardonnay, Riesling Muscaft On the contrary, strains like M522 would be more suitable for fermentation of neutral varieties, in which fermentation aromas such as esters and fatty acids would contribute toward improving the fruity intensity of the wine when the nitrogen level of these grape musts is increased Acknowledgements We would like to thank Prof Patrick Moyna and Dr Carina Gaggero for the critical comments made for this manuscript We would also thank PDT, INIA and CSIC of UdelaR for financially supporting this project Ngược lại, chủng M522 thích hợp với trình lên men loại môi trường trung tính, mùi hương lên men este acid béo đóng góp vào việc cải thiện hương vị trái rượu mà lượng nitơ nước ép nho tăng Lời cảm ơn Chúng xin chân thành cám ơn Giáo sư Patrick Moyna tiến sĩ Gaggero cho góp ý quan trọng để làm thảo Chúng xin cảm ơn PDT, INIA CSIC UdelaR hỗ trợ tài dự án .. .Sự sản xuất hợp chất thơm trình lên men rượu vang Saccharomyces cerevisiae: ảnh hưởng nitơ đồng hóa nấm men lên hai chủng mô hình Tóm tắt Sự đóng góp chất chuyển hóa lên men nấm men đến... quan hệ YAN hợp chất thơm khác sản xuất chủng nấm men sử dụng nghiên cứu điều kiện thí nghiệm khác Mục đích nghiên cứu để mô tả chủng S cerevisiae sản xuất hợp chất men hương thơm (este, rượu, axit... sử dụng chủng mô hình xác định mặt hóa học cho việc nghiên cứu hoạt động sinh lý nấm men sản xuất chất chuyển hóa, đáp ứng với bổ sung đạm để xác định mức men nitơ đồng hóa thích hợp cho chủng