ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH-CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG 6: ỨNG DỤNG CỦA CHẤT XÚC TÁC SINH HỌC TRONG VIỆC SẢN XUẤT HÓA CHẤT CÓ ĐỘ TINH KHIẾT CAO Mục lục: I Giới thiệu Xúc tác sinh học có ảnh hưởng sâu rộng đến công nghiệp đời sống ngày người Chúng sản xuất quy mô lớn nông nghiệp, công nghiệp sản xuất thức ăn đồ uống Mặt khác, xúc tác sinh học có vai trò quan trọng hóa phân tích nhờ vào độ đặc hiệu độ nhạy cao Nhờ vào enzyme, việc phân tích trở nên hữu ích, tiện lợi an toàn Enzyme đóng vai trò quan trọng điều trị chuẩn đoán bệnh hay phân hủy chất ô nhiễm Enzyme đóng vai trò quan trọng sản xuất quy mô lớn hóa chất hữu Những quan tâm gần hóa chất hữu tăng lên từ mức độ chuyên biệt chọn lọc cao xúc tác enzyme Xúc tác sinh học hợp chất hữu đáp ứng giới hạn môi trường ngày nghiêm ngặt có nhu cầu lớn công nghiệp hóa chất dược phẩm Hơn nữa, sản xuất xúc tác quan trọng để sản xuất lớp thành phần hữu chúng mục tiêu tới nghiên cứu phân tử y sinh II Lên men Trong vài năm, tổng hợp acid ascorbic (vitamin C) D-ephedrine giữ mẫu phân lập việc sử dụng đươc kiểm soát xúc tác sinh học bên trình lên men chủng hoang dã (“wild-type” fermentation) Nó không trình công nghiệp quan trọng cho việc sản xuất hóa chất thương phẩm mà phần concept phân biệt chuyển đổi lên men rượu thành acid acetic sản xuất giấm hay việc sản xuất ethanol từ glucose, chuyển đổi D-glucitol thành L-sorbose việc sản xuất acid ascorbic Trong chuyển đổi lên men chủng hoang dã với Gluconobacter sp Để sản xuất acid acetic với Saccharosemyces cerevisiae để sản xuất ethanol, chủng phép sinh trưởng chất trước chuyển ssang trình chuyển đổi thích hợp Tương tự vậy, ví dụ sau, Acetobactor suboxydans phép tăng trưởng D-glucitol trước chuyển sang trình oxi hoá nó, L-sorbitol là sản phẩm Ascorbic acid D-ephedrin D-glucitol L-sorbose Dung môi hữu Mặc dù hiệu việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu hóa dầu, nhiều việc sản xuất giới dựa quy trình lên men Trong 75 năm qua nước Mỹ, nơi mà tổng sản suất năm đứng mức triệu Nguồn nguyên liệu hóa học biến động từ lên men sang hóa dầu quay trở ngược lại (Bảng 1) Nguồn Cacbon cho lên men từ glucose lấy từ tinh bột Một lượng lớn hơn, khoảng 9.5 triệu sản xuất năm Brazil từ mía đường Ngày nay, nguồn tiêu thụ chủ yếu động ô tô Bảng Tỷ lệ ethanol sản xuât lên men Mỹ Năm sản xuất 1920 193 195 1963 197 198 1911 % từ lên men 100 90 30 6.5 55 94 Ở kỷ XIX, với số quốc gia, việc bán thức uống có cồn phải chịu mức thuế lớn Vì để tránh khỏi việc chịu mức thuế ethanol dùng làm nhiên liệu, ethanol phải biến tính “denatured” phải thêm hóa chất để chúng trở nên không ăn Ethanol methyl hóa cách bổ sung lượng nhỏ methanol đủ để làm chúng trở nên độc uống Việc sử dụng methanol chúng có điểm sôi gần ethanol nên khó để chưng cất loại bỏ Thêm vào đó, ăn phải, methanol chuyển thành chất độc, chất không tiết bên cách dễ dàng nên nguy hiểm cho tiêu thụ người Vào kỷ XX, sức ép trị xã hội cho phép lên men để cạnh tranh hiệu với hóa dầu trình sản xuất Các thành tựu kỹ thuật hóa học, sinh học, kỹ thuật làm thuận tiện cho việc chuyển đổi cacbohydrate dầu nguyên liệu cho quy trình Việc sản xuất acetone cho thấy tác động khác Nguồn nguyên liệu kỷ XIX gỗ Sự chưng cất phá hủy cấu trúc gỗ sản xuất acetone methanol (Sơ đồ 1) Trong đó, gỗ nên để khô không khí 12 – 18 tháng trước chưng cất Sau gỗ cung cấp nhiệt để thành pyroligneous acid (hay gọi dấm gỗ) dung dịch màu sậm gỗ nung nóng điều kiện kỵ khí để hình thành than gỗ Dấm gỗ chứa 80 – 90% nước với 200 hợp chất hữu Dấm gỗ sau thêm chanh tiếp nhiệt để thu dung môi dễ bay acetone methanol gỗ Nhiệt pyroligneous acid chất dễ bay (acetone, chất rắn methanol) calcium acetate Nhiệt add lime chất dễ bay (acetone) Nhiệt chất rắn (calcium carbonate) Ở vương quốc Anh, gỗ nhập từ Úc, cung cấp bị cắt thể chiến I Chưng Sau đó,cất Weizmann phát Sơ thứ đồ phá hủy cấu trúc triển gỗ quy trình lên men dựa phát triển Clostridium acetobutilicum (sau gọi Baciillus macerans) tên tinh bột oxy Sản phẩm hỗn hợp acetone, butan-1-ol, ethanol tỷ lệ 6:3:1 khối lượng, ba dung môi có điểm sôi khác nên cho phép phân tách hiệu chúng chưng cất Sự phát triển dẫn đến loạt quy trình, với dòng Clostridia sản xuất acetone, butan-1-ol propan-2-ol việc phân tách sản phẩm Các quy trình làm cho việc sử dụng hiệu cacbohydrate đầu vào cho lên men ethanol, sản lượng dung môi khoảng 60% tối đa (theo lý thuyết) so với khoảng 80% cho ethanol Hình Con đường lên men acetone – butanol – ethanol (ABE) Clostridia Quy trình có liên quan đến quy trình lên men nấm men để sản xuất rượu, bia lên men ABE thực điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt Phương pháp vi sinh sớm tự tìm thấy cạnh tranh với phát triển công nghiệp hóa dầu, UK, việc sử dụng lên men để sản xuất acetone dừng lại vào năm 1957 Tuy nhiên, phương pháp sử dụng số nơi giới, đặc biệt Trung Quốc nơi mà dầu cung cấp Căn vào ưu vượt trội lên men thị trường ethanol US, không ngạc nhiên để thấy vài nhu cầu họ cho việc sản xuất acteton, butan-1-ol propan-2-ol Acid carboxylic Các trình lên men nguồn tạo nhiều acid carboxylic, sản phẩm kích thước lớn acid citric (5) amino acid L-glutamate (6) L-lysine (7) Sự sản xuất acid citric năm giới 0.5 triệu Thật vậy, số thấp ước tính sản phẩm đầu Far East (các nước Đông Đông Nam Á) Đặc biệt số nước Trung Quốc, nơi ước tính sản xuất mức cao 0.9 triệu tấn, thể cho phát triển năm trì 8.5% vòng 60 năm qua Citric acid L-glutamate L-lysine Mặc dù acid citric phân tử đối xứng (achiral) đơn giản tương đối gồm nguyên tử cacbon, việc sản xuất chúng không hiệu tổng hợp hóa học thực quy mô lớn với lên men Thậm chí quy mô tự lên men lớn với thùng dung tích 500 m3 sử dụng Mức độ sử dụng rộng rãi acid citric (các quy trình đa dạng điều chỉnh độ acid thực phẩm, làm bề mặt kim loại, thay gốc phosphate chất tẩy nhân tố để điều khiển đô sệt bùn sử dụng việc khoan dầu) quy trình lên men hiệu Một số amino acid sản xuất với số lượng lớn (Bảng 2) Chúng sử dụng hầu hết nguyên liệu thực phẩm, ví dụ để cung cấp thức ăn chăn nuôi Bởi D-enatiomers chuyển thành dạng có hoạt tính L-enatiomer thể động vật, racemate sản xuất hóa học thường xuyên thay đồng phân tự nhiên có nguồn gốc từ quy trình lên men Sự lựa chọn đường thực chủ yếu dựa sở kinh tế Ngược lại, việc cung cấp nguyên liệu ban đầu cho hợp chất khác chất làm có hàm lượng calo thấp Aspartame (8) imipenem kháng sinh β-lactam (thienamycin) (9), cần đầu vào bất đối xứng (chiral input) Sự tổng hợp hóa học sử dụng để sản xuất DL-methionine (10) glycerin, nhiều amino acid giá trị khác sản phẩm lên men sản xuất phụ thuộc vào việc sử dụng enzyme Bảng Một số amino acid sản xuất với số lượng lớn Amino acid Phương pháp sản xuất L-glutamic acid DL-methionine L-lysine Glycine L-aspartic acid L-phenylalanine DL-alanine L-cysteine L-arginine L-glutamine Vi sinh vật Hóa học Vi sinh vật Hóa học Enzyme Vi sinh vật Hóa học Ly trích enzyme Vi sinh vật Vi sinh vật Sản lượng năm (tấn) (1987) 340.000 250.000 70.000 6.000 4.000 3.000 1.500 1.000 1.000 850 Aspartame Imipenem Kháng sinh Sau khám phá penicillin, ngành công nghiệp kháng sinh có ảnh hưởng chủ yếu đến việc phát triển quy trình lên men Hơn trăm hợp chất lên men dựa sở thương mại, hầu hết sử dụng người, thú y nông nghiệp, yêu cầu cho nguyên liệu không lớn acid citric amino acid Nhiều nguyên liệu chuẩn bị sản phẩm kích thước thô, đặc biệt kanamycin (11) blasticidin (12), sử dụng nông nghiệp Nói chung giá trị chúng thực thể hóa học, đặc biệt cho ngành công nghiệp dược phẩm, không nằm sản phẩm tự lên men nằm hợp chất tạo chúng Từ vi khuẩn, 25.000 penicillin sản xuất năm đặc biệt có giá tri Trong bối cảnh đó, giá trị chúng sản phẩm lên men cạnh tranh protein tái tổ hợp Kanamycin Blasticidine S Sự khảo sát sản phẩm lên men nên minh họa là: (a) quy mô sản xuất, để cạnh tranh với công nghiệp hóa chất số lượng lớn, (b) phạm vi đơn vị hóa học, từ ethanol kháng sinh (c) giá trị ngành công nghiệp đặc biệt cung cấp nguyên liệu ban đầu cho tổng hợp hóa học III Steroids Steroids hormone động vật Tuy nhiên, tiềm sản xuất dược phẩm khai thác sản xuất phụ thuộc vào phương thức tách chiết estrone (13) từ urine thai ngựa Cholesterol mật acid nguồn tốt bước khởi đầu cần thiết cho chuyển hóa có liên quan đến oxi hóa Crom III, trình chuyển hóa không hiệu quả, Cho đến vào đầu năm 1940 Marker nhận progesterone (15) testosterone (16) tổng hợp từ diosgenin (17), steroid thu từ họ khoai tây (Dioscorea mexicana ) phát triển Mexico, dùng phát triển hóa chất tổng hợp estrone(13) diosgenin (17) progesterone (15) testosterone (16) hecogenin (19) Diosgenin steroid sapogenin, nguồn nguyên liệu quan trọng để chế tạo thuốc steroid bao gồm thuốc chống viêm (corticosteroids), progesterone, testosterone,… Bên cạnh có hecogenin (19) thuộc nhóm steroid sapogenin chất có Xidan châu Phi Đây nguồn sản phẩm tự nhiên bao gồm nguyên tố oxy C-12 có chức cho chuyển hóa nguyên tử cacbon kế cận C-11 Tuy nhiên cần bước hóa học để chuyển oxy từ C-12 thành -orientation C-11, nhằm thay đổi thành cấu trúc thuốc kháng viêm, ví dụ beclomethasone (20) beclomethasone (20) hydrocortisone (21) mestranol (22) Quy trình đơn giản hóa vào năm 1952 Petersen Murray mô tả hydro hóa C-11 xúc tác nấm Rhizopus arrhizus Mặc dù oxy hóa tạo 11hydroxysteroid nghịch đảo cấu hình nhóm hydroxyl tương đối đơn giản Quy trình trở nên hợp lý với hoạt hóa lại ứng dụng xúc tác sinh học có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất steroid tương lai Mặc dù phản ứng 11-hydroxylation ứng dụng quy trình thương mại không hiệu Quy trình có tính chọn lọc cao cường độ xúc tác chậm Nấm phát triển điều kiện lên men bình thường Steroid thêm vào nhằm phân tán nồng độ cuối 0.1 % 1% hòa tan môi trường lên men lỏng Xúc tác cho phản ứng cytochrome P-450 mono-oxygenase gắn với màng nội bào Đây enzyme phức tạp đòi hỏi co-factor NADPH để khử nguyên tử phân tử oxygen thành nước nguyên tử oxy khác kết hợp vào steroid Sự phân hủy chất chuyển vào tế bào chuyển sản phẩm khỏi xúc tác chậm, quy trình diễn vài ngày NADP+ bị khử thành NADPH bên tế bào Một vị trí khác steroid bị khử, đặc biệt vị trí 6x steroid dài tiếp xúc với tế bào Sự xử lý steroid nhờ vi sinh vật Curvularia iunata giới thiệu nhóm 11-hydroxyl, quy trình xúc tác thương mại phổ biến từ vi sinh vật thông qua biến đổi 17acetoxyl-11-deoxycortisol thành cortisol (hydrocortisone) (21) Phản ứng cần ý điều khiển khử 11-hydroxylation nguyên tố cacbon khác steroid bị oxy hóa đặc biệt dẫn xuất 9-OH 14-OH Vi sinh vật có khả hydro hóa hầu hết vị trí steroid có oxy hóa vị trí C-16 sử dụng quy trình sản xuất, ví dụ 9-fluoro-16-hydroxycortisol phản ứng xúc tác Streptomyces roseochromogenes ∆-dehydrogenation xúc tác Arthrobacter simplex Phản ứng sử dụng sản xuất hương liệu A-ring 19-norsteroids estrone (13) hay mestranol (22), số nhóm 19-methyl Đây phản ứng thích hợp với diện chất hữu không tan Nó cung cấp pha lỏng thứ cấp tan steroid Trong trường hợp tế bào A simplex cho phép diện toluene với số lượng thích hợp thêm vào phản ứng Hai lợi ích khác từ chuyển hóa từ vi sinh vật minh họa làm yếu tố bên ảnh hưởng đến quy trình sản xuất hóa chất công nghiệp Đến năm 1970, phủ Mexico bắt đầu kiểm soát củ hoang dã có khả chiết xuất diosgenin, năm 1976 giá tăng 20-fold tới 5600 $ Điều dẫn tới nghiên cứu nhằm tìm nguồn cung cấp khác Stigmasterol (23) thu từ đậu nành xem phương pháp thay mạch 17b sterol biến đổi từ đơn vị cacbon progesterone (15) Tuy nhiên, stigmasterol tự nhiên có pha trộn nhiều b-sitosterol (24), sử dụng mạch no b-sitosterol tích lỹ sản phẩm không mong muốn sản xuất stigmasterol thay diosgenin Stigmasterol (23) androstenedione (25) b-sitosterol (24) nor-gestrol (26) Nghiên cứu vi sinh vật bắt buộc sử dụng steroid, -sitosterol, khuôn cacbon cho thấy chúng thường bắt đầu oxi hóa mạch thẳng nhân steroid, tạo thành sản phẩm 17-keto steroid Sự hydro hóa tại C-9 ∆-dehydrogenation C-1 Những trình bị ức chế việc bổ sung kim loại nặng vào môi trường chuyển hóa kiềm hãm phân hủy sắt với -dipyridyl Một vài dòng vi sinh vật chứa enzyme có hại phân lập.Quá trình chuyển hóa với oxi hóa b-sitosterol từ androstenedione (25) vật liệu có ích để tổng hợp thuốc tránh thai Kết chất thải tích lũy 10 Acrylamide Nhiều vi sinh vật có chứa enzyme có khả thủy phân nitrile hữu cơ, enzyme phân loại khác khả phá giản chất béo hợp chất thơm, enzyme thủy phân nitrile tách chiết từ Rhodococcus rhodochrous thủy phân acrylonitrile thành acrylamide Quy trình thủy phân hóa học liên quan đến đồng xúc tác 100°C , khó để chuẩn bị khôi phục chất xúc tác tách chiết tinh chế acrylamide Quy trình sử dụng enzyme tiến hành 10°C , điều giúp tiết kiệm lượng giảm khả acrylonitrile acrylamide tự trùng phân trình phản ứng, sản phẩm thu hồi tinh khiết so với quy trình hóa học Acrylamide tinh khiết có khả trùng hợp cao so với sản phẩm tạo từ đường hóa học Phần lớn polyacrylamide dùng làm flocculant có khối lượng phân tử nhỏ polyme tổng hợp từ enzyme acrylamide, mà điều lại cần thiết quy trình kết tủa nên flocculant ưa chuộng Một vài quy trình công nghiệp xử lý nước hạn chế sử dụng thuốc thử tinh khiết Điều có nghĩa quy trình sản xuất acrylamide enzyme tăng từ 30.000 năm lên 200.000 năm VIII The chiral switch Ngày vài phản đối sử dụng enzyme sản xuất quy mô lớn, nhiên có nhiều quy trình công nghiệp tiến hành cho thấy nhiều lợi ích từ công nghệ mà có lợi nhuận thương mại Có hai thành phần dẫn đến ngày sử dụng chất xúc tác trích lọc từ enzyme từ phản ứng hóa học hữu nơi mà hóa học lập thể chuyển từ chiral sang chiral khác Yếu tố giảm chất thải sản phẩm phụ Thứ hai có mặt đồng phân đối hình không mong muốn dược phẩm không tinh khiết, dược phẩm bất hoạt không sao, hoạt động tác động khác so với sản phẩm tinh khiết, ví dụ thalicomide Chính quyền nêu rõ sản phẩm chiral phải phân loại kiểm tra nghiêm ngặt đồng phân chúng Hơn nữa, họ nghĩ loại thuốc chiral hoạt động nên bán kèm với đồng phân đối hình không hoạt động Cuộc tranh luận ảnh hưởng đến chương trình tổng hợp hóa học ngành công nghiệp dược phẩm nhóm người cho nên tổng hợp thuốc từ thành phần achiral Những người khác quan tâm đến phương pháp tổng hợp tạo đồng phân đối hình Chiral tinh khiết nhấn mạnh cần thiết phương pháp tổng hợp bất đối xứng, lúc biết đến "chiral switch" 25 Một vài nhà sản xuất hóa chất ngành dược phẩm sử dụng enzyme để tổng hợp chiral synthons Chiral cyanohydrins, α-amino, β-amino acid hydroxy số sản phẩm sản xuất trực tiếp từ tiền thân achiral Nhiều acid hydroxy acid citric đồng phân đối hình acid lactic sản phẩm lên men Tổng hợp số chất giống sản xuất aspartate chất phản ứng (cần lyase để thêm nước [chứ ammonia] qua liên kết đôi C-C) sử dụng tế bào trưởng thành Tinh chế fumarate hydrolyase sản xuất khoảng 500 L-(S)-malate năm, maleic hydrolyase xúc tác tổng hợp D-(R)-malate, sản phẩm ngày không thị trường Những phản ứng quan trọng tổng hợp L-carnitine captopril Lactate dehydrogenase hầu hết sinh vật chịu trách nhiệm tổng hợp đồng phân đối hình acid lactic tổng hợp dãy từ acid α-hydroxy đến α-keto Enzyme tinh khiết sử dụng phản ứng phức tạp phản ứng xúc tác lyase, nên cần đến chất khử NADH giúp tái chế enzyme, alcohol dehydrogenase Nguồn enzyme tái chế sau giảm hóa chất để ngăn tăng lên đồng sản phẩm oxy hóa (acetaldehyde) từ trạng thái cân acid keto hydroxy Thay vào đó, formate dehydrogenase sử dụng sản phẩm oxy hóa cuối nước CO D-glycerol-3-phosphat (sn-glycerol-3-phosphate), sử dụng sản xuất phospholipit, synthon khác mà sản phảm phải tái chế co-factor Nó tổng hợp từ glycerol ATP, với enzyme glycerol kinase để xúc tác, ADP tái chế enzyme riêng biệt Các nguồn phosohate este chủ yếu phosphoenol pyruvate, thay polyphosphate carbamoyl-phosphate chúng dễ tổng hợp IX Polymer synthesis Nucleic acids Sự tổng hợp trực tiếp deoxyribonucleic acid (DNA) thao tác kỹ thuật gen diễn enzyme xúc tác Có nhiều loại enzyme cắt giới hạn, chúng cắt mạch DNA điểm đặc trưng xác định trình tự local base, enzyme ligase nối lại đầu bị cắt, trinh tự base chèn vào, chúng chất xúc tác cần thiết Người ta bổ sung chất tổng hợp hóa học oligonucleotides ( đoạn nhỏ DNA), chèn vào Cuộc thảo luận kỹ thuật nằm phạm vi chương này, rộng quy mô việc tổng hợp nhỏ Nó chu trình sản xuất kỹ thuật thuật tiện có ý nghĩa lớn Tuy nhiên, giá trị rõ ràng từ ảnh hưởng kỹ thuật di truyền sinh học đại 26 Peptides Sự kết hợp chất xúc hóa học enzyme xúc tác sử dụng tổng hợp protein Nguồn gốc tự nhiên protein sinh vật tổng hợp nên Khi nguồn cung cấp bị giới hạn, kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép protein nguồn gốc tự nhiên thay sản phẩm mới, Kỹ thuật cho phép insulin chymosin có nguồn gốc động vật sản xuất với số lượng lớn E.coli loài vi sinh vật khác Kỹ thuật di truyền tế bào thực vật động vật, thực vật động vật thật sự, hữu dụng Bất kỹ nguồn dự trữ cung cấp thành phẩm hầu hết protein dạng sản phẩm tinh phẩm So sánh với khó khăn việc tinh lượng nhỏ vài protein từ nguồn gốc tự nhiên chúng, thành tựu kĩ thuật đáng ý Tuy nhiên, giới hạn để tổng hợp protein chứa 20 amino acid tự nhiên Phương pháp tổng hợp peptide ( hình 6.24) enzyme giúp tạo vô số loại protein, chí, tổng hợp hóa học có nhiều ứng dụng nữa, kĩ thuật chưa phù hợp cho sản xuất Hơn nữa, chưa có phương pháp tổng quát cho việc tổng hợp protein hoàn chỉnh từ đoạn peptide Tuy nhiên enzyme có vai trò quan trọng việc sản xuất peptide Trong hỗn hợp butan - 1,4 - diol nước, trypsin xúc tác trao đổi đuôi carboxyl alanine insulin lợn với đầu t-butyl ester threonine ( hình 6.25) Phản ứng chất chuyển đổi peptide nhóm acyl lysine chuyển từ nhóm amino 27 alanin tới nhóm khác threonine Sự chuyển dồi insulin lợn thành ester hormone người, chuyển đổi protein đơn giản có lợi sản phẩm thương mại Thermolysin protease khác, xúc tác tổng hợp peptide, nhà máy sớm sử dụng enzyme cho việc sản xuất chất tạo nhân tạo Aspartame, với quy mô 2000 năm Trong phản ứng đồng phân L hỗn hợp racemic hai đồng phân phenylalanine methyl ester phản ứng đặc hiệu với nhóm α-carboxyl đầu N bảo vệ L - aspartate Do hai việc tách đồng phân đối ảnh phenylalanine bảo vệ nhóm γ-carboxyl L-aspartate không cần thiết, mà đơn giản hóa trình tổng hợp Mặc dù thiên thủy phân tổng hợp, sản phẩm peptide, đầu N bảo vệ tiền thân este aspartame tạo thành muối không hòa tan với phần lại Dphenyl-alanine metyl este kết tủa Phản ứng kéo có lợi cho trình tổng hợp suất gần định lượng Trong bước cuối, đầu N - bảo vệ phân nủa Aspartate bị hoạt tính hóa học để tạp Aspartame Phần lại D-phenylalanyl methyl ester triết quang tái chế thông qua chu trình 28 Oligosaccharides Sản xuất thương mại sửa đổi oligosaccharides có tính quan trọng nhiều ngành công nghiệp Những trình thường thủy phân, vài trường hợp enzyme xúc tác cho transglycosylation lên carbohydrate khác vào nước, tạo loại polymer β-cyclodextrin mà cấu trúc macrocyclic gồm bảy phân tử glucose tất 1-4α liên kết tổng hợp từ tinh bột với enzyme từ loài Bacillus Chu kỳ carbohydrate hoạt động máy chủ phân tử hấp thụ phân tử nhỏ nhập vào trung tâm macrocycle Trong ngành công nghiệp thực phẩm hữu ích việc nắm bắt giữ lại hương vị sử dụng việc xây dựng dược phẩm Trong năm 1989, khoảng 850 sản xuất cho thị trường tăng lên nhanh chóng 29 Oligosaccharides phức tạp gắn liền với protein có chức miễn dịch công nhận mà ngành công nghiệp dược phẩm muốn khám phá Chúng có cấu trúc bao gồm có khoảng 10 15 monome carbohydrate cấu trúc phân nhánh tạo dựng phương thức hóa học, số lượng bước bảo vệ khử bảo vệ cần thiết để đảm bảo liên kết xác hình thành làm cho chất hóa học khó khăn Các chiến lược tổng hợp thường sử dụng enzyme xúc tác mà transglycosylation phản ứng quan trọng, từ nhà tài trợ đơn giản tổng hợp cyclodextrin, từ chất nucleotide phức tạp transferases cụ thể Trong vài năm tới có khả để trở thành mục tiêu quan trọng để tổng hợp quy mô lớn hơn, bao gồm bước enzyme Hình 6.27 Polyesters Một số polyeste tự nhiên polyhydroxybutyrate sản phẩm thương mại vi sinh - sinh vật Bên tế bào tổng hợp enzyme cao - polyeste trọng lượng phân tử không thực tế hợp lý quy mô tổng hợp khối nhỏ với trọng lượng phân tử vài ngàn ứng dụng thiết thực Các liên kết este hình thành điều kiện hoạt động nước thấp,và nồng độ 30 rượu axit cacboxylic cao Các phản ứng, mà ester ester kích hoạt 3,4-epoxyadipate butan - 1,4 - diol, mang lại sản phẩm không đối xứng mà chứng minh trung gian hữu ích cho trình tổng hợp hóa học polymer không đối xứng (Trong hóa học hữu cơ, transesterification trình trao đổi nhóm hữu R "của este với nhóm hữu R 'của rượu Những phản ứng thường xúc tác bổ sung chất xúc tác axit sở Các phản ứng thực với giúp đỡ enzym (biocatalysts) đặc biệt lipase Như với tổng hợp oligosacharides, quy trình quy mô nhỏ, việc sản xuất sửa đổi polyme đặc biệt trở thành mục tiêu quan trọng hóa học enzyme Hình 6.28 X New reaction conditions Cơ cấu ổn định protein phụ thuộc vào diện nước, enzyme có liên quan với xúc tác nước Thật vậy, lợi chúng, chúng xúc tác phản ứng khoảng nhiệt độ mà nước chất lỏng áp suất khí bình thường Tuy nhiên, có trường hợp ngoại lệ ví dụ trình tiêu hóa nhiệt độ cao tinh bột (6.6) Cũng không môi trường dung dịch 31 enzyme thường hành động ngăn cản việc sử dụng chúng chất xúc tác dung môi hữu (6.3, 6.4.2, 6.9.2, 6.9.4) Có lý đáng cho việc sử dụng enzyme phạm vi bình thường chúng Nhiệt độ cao tăng độ hòa tan chất trạng thái keo thích hợp trường hợp tinh bột: chúng ngăn chặn trình bị ngoại nhiễm giống chất hỗ trợ khử trùng, vô trùng, cuối cùng, chúng ảnh hưởng đến cân phản ứng cách tích cực theo chiều tạo sản phẩm cần thiết Dung môi hữu có ích lý tương tự, chúng có lợi phân chia khỏi pha lỏng chất sản phẩm mà ức chế xúc tác Tuy nhiên protein trở nên ổn định dãn nhiệt độ tăng chúng sử dụng dung môi hữu Các chất hóa học trình hiểu đủ phép bị ảnh hưởng tái thiết kế có chủ ý chuỗi polypeptide chúng cách thay đổi hóa học cấu trúc có cách lựa chọn cẩn thận điều kiện phản Ví dụ, ổn định protein dung môi hữu phụ thuộc vào log giá trị P xem thích hợp với chất xúc tác so với có giá trị cao Hơn nữa, số vi sinh vật ưa nhiệt, mà tự nhiên phát triển nhiệt độ cao (~ 60 C) có chứa enzyme đặc biệt ổn định mà có ích xúc tác o Thường enzyme hữu ích hỗn hợp, nơi nước dung môi có mặt hai pha riêng biệt Điều hữu ích nơi chất bị tan nước Nếu hàm lượng nước phản ứng liên quan đến enzyme thủy phân bị giảm dung môi không ảnh hưởng đến nồng độ tổng thể chất sản phẩm trạng thái cân mà chặn chất trung gian không ổn định mà không bị thủy phân Như Pottervin (xem chương I), ảnh hưởng để "đảo ngược" hành động loại bỏ nước từ chất 32 Hình 6.3 Đã có vài ví dụ phản ứng quy mô lớn điều kiện (Bảng 6.6) Mặc dù số dự án quy mô thí điểm, ester chất béo (xem sơ đồ 6.29) thực tế thương mại sản xuất sản phẩm thay bơ ca cao (50) methylethyltetradecanoate (isopropylmyristate) (51) Trước thành phần thực phẩm có giá trị, sau bị sử dụng chất độn công thức mỹ phẩm Việc kiểm soát hoạt động nước bị vấn đề kỹ thuật quan trọng enzyme dung môi gần cạn Trường hợp lipase xúc tác tổng hợp ester transesterification lượng cân hóa học nước giải phóng Mặc dù số nước cần thiết cho hoạt động enzyme nhiều ảnh hưởng đến cân trình tổng hợp thủy phân ester Hiệu tăng qui mô yêu cầu phương pháp khác tốt kiểm soát phương pháp sẵn có 33 Bảng 6.6: Chất xúc tác Nocardia corillina Horseradish peroxidase Trypsin ( protease) Subtilisin Mucor michei lipase Aspergillus niger Arthrobacter simplex isopropylmyristate Phản ứng Epoxidation – Octene Styrene – Teiradecene Phenol polymerization Transpeptidation Ester hydrolysis Transesterification Ester synthesis Steroid dehydrogenation Dung môi n – Hexadecane n – Hexadecane – Tetradecene (substrate) Ethylacetate Butan – 1,4 – diol Dioxane chloroform etc 60 -80oC petroleum ether Substrate mixture Toluene Hình 6.29 34 XI Kỹ thuật gene Sản phẩm protein kỹ thuật protein Quy trình kỹ thuật gene biến đổi tổng hợp protein hầu hết vi sinh vật vài tế bào khác lên men Các protein tái tổ hợp có giá trị thương mại insulin, erythropoietin interferon quan tâm đáng kể Nguồn enzyme protease đặc hiệu tự nhiên sử dụng sản xuất phô mai từ dày bê Quy trình sản xuất gia tăng chuyển đổi sinh vật tái tổ hợp năm Pfizer tiêu thụ Chymax Sự xúc tác sinh học quan trọng tinh khiết, nhiên hạn chế nhiều xúc tác sinh học có ích thường thu từ nguồn tự nhiên, sản phẩm thu từ biến đổi sinh vật tái tổ hợp cung cấp lượng hợp lý theo nhu cầu Công nghệ ngày có triển vọng phát triển tương lai Hoạt động enzyme phụ thuộc vào cấu trúc ba chiều gấp nếp trình tự sơ cấp amino acid chuỗi peptide Tính đặc trưng chọn lọc xúc tác tương tác chất với vị trí amino acid mạch protein Phân tích tương tác thường dựa vào tinh thể học tia X Tinh thể học tia X xác định xếp nguyên tử bên tinh thể dựa vào liệu phân tán tia X sau chiếu vào electron tinh thể Sau xây dựng hình ảnh chiều mật độ electron bên tinh thể, vị trí nguyên tử tính trung bình, liên kết hóa học thu thập Bước quan trọng tinh thể học tia X nhiễu xạ tia X từ tinh thể Một tinh thể vật rắn với nguyên tử bên có trật tự cố định lặp lặp lại dọc theo hướng gọi vector sở hay vector lưới (bais hay lattice) Nhiều chất chuyển dạng tinh thể muối, kim loại, khoáng chất, chất bán dẫn, phân tử vô cơ, hữu hay sinh học khác Sau thu dạng tinh thể chất, treo lên máy đo góc (goniometer) bắn tia X vào, tạo mẫu nhiễu xạ điểm gọi điểm phản xạ Tiếp theo, tinh thể xoay tròn từ từ (theo độ dời góc định) lần xoay ta lại thu thập mẫu nhiễu xạ Tập hợp ảnh 2D chuyển thành mô hình 3D mật độ electron bên tinh thể nhờ phương pháp toán học biến đổi Fourier liệu hóa học mẫu (tức ta biết thành phần hóa học chất) Từ đó, suy vị trí nhân nguyên tử mật độ electron liệu hóa học 35 Có vài quy tắc gấp cuộn protein Các khuôn mẫu thường bảo tồn enzyme có liên quan, thay thay đổi trình tự amino acid sơ cấp Toàn đặc trưng trung tâm xúc tác mô tả cấu trúc X-ray, chất chung xúc tác thường mô tả thông tin cấu trúc kết hợp với liệu từ phản ứng động học ứng dụng kỹ thuật gene để thay amino acid Không may, vài đặc trưng quan trọng xúc tác dựa vào vị trí xác tương tác, hạn chế X-ray Sự trao đổi amino acid dễ bị oxy hóa (tủa methionine) cải thiện tính ổn định enzyme thường hao phí hoạt động xúc tác mức thấp Sự kết hợp cầu nối disunfit làm tăng tính ổn định thường sẵn enzyme tự nhiên điều kiện thích hợp Những thay đổi vị trí hoạt động amino acid ảnh hưởng đến tính chất xúc tác, thay đổi đạt biến đổi hóa học đột biến tự nhiên chọn lọc Việc loại bỏ ảnh hưởng không thực tế cung cấp nhiều thông tin chế hóa học xúc tác enzyme Những quy tắc hiểu rõ hứa hẹn đem đến triển vọng tái thiết kế hợp lý enzyme Kỹ thuật chuyển hóa sản xuất acid ascorbic Phương pháp thích hợp xúc tác sinh học công nghiệp sử dụng kỹ thuật gen để tạo thành protein tế bào Các sản phẩm thương mại insulin, chymosin không ảnh hưởng đến trao đổi chất tế bào, sản phẩm cuối trình Mặt khác, tế bào bị biến đổi tạo thành enzyme tham gia vào hoạt động chuyển hóa tế bào, bắt đầu mở rộng đường chuyển hóa tế hai bước mong muốn, hoạt động đạt quy trình đột biến hay chọn lọc bình thường mà đạt thông qua bổ sung enzyme Khái niệm ứng dụng nhiều quy trình thương mại, số sản xuất acid ascorbic 36 Sơ đồ Quy trình tổng hợp Reichstein Những năm gần đây, có nhiều nỗ lực nhằm đơn giản hóa tổng hợp Reichstein (chapter 1) sản xuất khoảng 50000 acid ascorbic năm Đầu tiên nổ lực dựa oxi hóa glucose vi sinh vật từ 5-ketogluconate nhờ Acetobacter xylinum phát Brown Những vi sinh vật khác bao gồm Acetobacter sp Erwinia sp oxi hóa glucose từ 2,5-diketo-D-gluconate Sự khử hóa học kết hợp 2-keto-Dgluconate 2-keto-L-gluconate phụ thuộc vào tính chọn lọc khử nhóm cacbon, khử vi sinh vật khác Brevibacterium sp với Corynebacterium sp bao gồm regiospecific stereoselective thu sản phẩm nhanh tốt Đây chất trung gian trình ascorbate tổng hợp Reichstein Hai trình oxi hóa khử xảy đồng thời lên men Đột biến trình tự Acetobacter Corynebacterium làm biến đổi 80% glucose từ 2-keto-L-glunonate, giới hạn đạt vi sinh vật giới thiệu kỹ thuật gene Công ty công nghệ sinh học Genentech Inc sử dụng công nghệ 2,5-diketo-Dgluconate tinh chế từ Corynebacterium từ hiểu biết trình tự amino acid đem lại nhiều lợi ích, chúng dò thu gene từ enzyme Sau biến đổi gene Erwinia herbicola nhằm biến đổi enzyme oxi hóa 2,5-diketo-D-gluconate Vi sinh vật tái tổ hợp biến đổi trực tiếp 2-keto-L-gluconate thành glucose nhằm tạo đơn giản hóa cho quy trình Reichstein Trong quy trình, glucose cung cấp ascorbate khung carbon định hướng bị so sánh đảo ngược nhằm định hướng hợp tổng hợp Reichtein, biểu xúc tác sinh học Nồng độ cuối thu 20 g/l -1 thu sau 72h lên men 50% sinh khối dựa vào lượng glucose tạo thành 37 Tiềm xa công nghệ điều khiển sinh tổng hợp cephalosporin C Hai enzyme cần chuyển 7-aminoadipyl mạch chuyển hóa từ A.chrysogenum sau kỹ thuật tạo dòng tạo thành 7-ACA Hoạt động xúc tác cao enzyme thường bù đắp cường độ thấp, phản ứng nồng độ chất phản ứng cao Sự oxi hóa D-glucitol thành L-sorbose ngoại lệ D-glucitol sản phẩm quan trọng với sản lượng hàng năm khoảng 0.6 triệu tấn, 70m3 lên men khử hydro liên tục glucose chlorine để oxy hóa sản phẩm phụ điacetone L-sorbose tạo thành điện phân NaCl, cuối sản phẩm phụ 2-keto-L-gulonate dễ dàng thu hồi Ngược lại, tổng hợp trực tiếp vi sinh vật đòi hỏi nồng độ đường thấp (khoảng 40g/l-1); 2-keto-L-gulonate không dễ thu hồi Vấn đề phổ biến có ảnh hưởng tới sản xuất 7-ACA dòng tái tổ hợp từ A chrysogenum điều kiện cho lên men thu hồi quy trình nên phát triển Nó thường gặp khó khăn thay đổi quy trình mới, điều tốt nổ lực đơn giản hóa tổng hợp ví dụ cho chiến lược đầy hứa hẹn Một số sản phẩm tạo thành từ phương pháp sẵn Điều sớm thúc đẩy tiến công nghệ, hiểu rõ xúc tác sinh học với quy mô lớn dùng enzyme vi sinh vật tái tổ hợp XII Tài liệu tham khảo S.Roberts, N Turner,Introduction to biocatalysis using enzymes and microorganisms,1995,140-188 http://timtailieu.vn/tai-lieu/bai-giang-cac-san-pham-chuyen-hoa-25042/ http://123doc.org//document/1932252-nguon-nguyen-lieu-ban-tong-hopsteroid-tu-thuc-vat.htm http://www.sbi.uni-rostock.de/uploads/tx_templavoila/SBI_Courses_Abe5 fermentation.pdf https://en.wikipedia.org/wiki/Acetone%E2%80%93butanol %E2%80%93ethanol_fermentation http://www.chemguide.co.uk/organicprops/alcohols/manufacture.html http://www.karger.com/Article/PDF/103592 https://www.researchgate.net/publication/12379619_Metabolism_of_citric_acid_pr oduction_by_Aspergillus_niger_Model_definition_steadystate_analysis_and_constrained_optimization_of_citric_acid_production_rate 38 39 ... vai trò quan trọng sản xuất quy mô lớn hóa chất hữu Những quan tâm gần hóa chất hữu tăng lên từ mức độ chuyên biệt chọn lọc cao xúc tác enzyme Xúc tác sinh học hợp chất hữu đáp ứng giới hạn môi... acrylamise: tầm ảnh hưởng hóa chất Sử dụng hóa chất quy trình sản xuất thải nhiều chất độc hại mang lại nhiều tác động xấu đến môi trường Sử dụng enzyme làm xúc tác sinh học coi công nghệ sạch,... hoạt hóa lại ứng dụng xúc tác sinh học có ảnh hưởng đáng kể đến sản xuất steroid tương lai Mặc dù phản ứng 11-hydroxylation ứng dụng quy trình thương mại không hiệu Quy trình có tính chọn lọc cao