ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -* - Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -* - Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Lai Thành TS Phạm Cẩm Phương Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lai Thành, người thầy trực tiếp hướng dẫn thực luận văn cao học Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc giúp hoàn thành nghiên cứu Trong trình nghiên cứu học tập, nhận lời nhận xét, góp ý quý báu từ thầy để thực tốt nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Cẩm Phương, người hướng dẫn người quản lý trực tiếp trình nghiên cứu làm việc Đơn vị Gen trị liệu Chị hỗ trợ, truyền đạt kiến thức cho đóng góp đáng giá để hoàn thành tốt nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, đặc biệt GS.TS Mai Trọng Khoa PGS.TS Trần Đình Hà, thầy tạo điều kiện hết mức cho tiến hành nghiên cứu Đơn vị Gen trị liệu - bệnh viện Bạch Mai Tôi xin cảm ơn tập thể cán Đơn vị Gen trị liệu, đặc biệt TS Nguyễn Thuận Lợi, ThS Nguyễn Tiến Lung, người dẫn, giúp đỡ tận tình suốt thời gian thực nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô công tác môn Sinh học Tế bào thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức quí giá để thực luận văn vận dụng công việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày 13 tháng 12 năm 2016 Nguyễn Tuấn Anh MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chương - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng .6 1.1.3 Chẩn đoán mô bệnh học ung thư đại trực tràng 1.1.4 Các chất điểm khối u thường dùng .9 1.2 MỘT SỐ CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .10 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 17 1.3.1 Đích VEGF - chống tăng sinh mạch bệnh nhân UTĐTT 18 1.3.2 Đích EGFR UTĐTT 20 1.3.3 Các tín hiệu hạ nguồn khác EGFR .24 1.3.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 25 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 27 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 27 2.1.3 Phương pháp chọn mẫu 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3 THIẾT BỊ, VẬT TƯ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 2.3.2 Các vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 29 2.3.3 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 2.4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 30 2.4.1 Sàng lọc bệnh nhân 30 2.4.2 Thu thập thông tin bệnh nhân 31 2.4.3 Xác định trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA 31 2.4.4 Phân tích kết SPSS 23.0 35 i Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA NHÓM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 3.2 BIẾN ĐỔI CỦA CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF VÀ PIK3CA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 41 3.2.1 Biến đổi gen KRAS .41 3.2.2 Biến đổi gen NRAS .43 3.2.3 Biến đổi gen BRAF 44 3.2.4 Biến đổi gen PIK3CA 45 3.2.5 Nhận xét chung 47 3.3 TƯƠNG QUAN GIỮA TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN GEN VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN 49 3.4 BÀN LUẬN .53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ .60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Tiếng Việt 61 Tiếng Anh 61 PHỤ LỤC - Phụ lục 1: Mẫu bệnh án nghiên cứu - Phụ lục 2: Qui trình tách DNA từ mô cố định formalin – vùi paraffin - Phụ lục 3: Qui trình định lượng DNA theo nguyên tắc huỳnh quang - Phụ lục 4: Quy trình phát đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF - Phụ lục 5: Quy trình tinh sản phẩm PCR - Phụ lục 6: Qui trình giải trình tự tự động máy 3500 Dx Genetic Analyzer (Applied Biosystems) sản phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle - 10 Phụ lục 7: Trình tự gen PIK3CA (NM_006218.3) - 12 - ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 – Con đường tín hiệu MAPK chế tác động thuốc kháng EGFR .12 Hình 1.2 – Con đường tín hiệu PI3K-AKT .15 Hình 2.1 – Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 30 Hình 3.1 – Một số kết phát đột biến gen KRAS phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (KRAS XL StrippAssay®) 42 Hình 3.2 – Một số kết phát đột biến gen NRAS phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (NRAS XL StripAssay®) 43 Hình 3.3 – Một số kết phát đột biến gen BRAF phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (BRAF 600/601 StripAssay®) 44 Hình 3.4 - Một số kết giải trình tự gen PIK3CA exon .45 Hình 3.5 – Một số kết trình tự gen PIK3CA exon 20 46 Hình 3.6 – Sơ đồ chi tiết tỷ lệ loại đột biến phát nhóm bệnh nhân nghiên cứu 48 Hình 3.7 – Các phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng di 56 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 - Các thuốc cấp phép điều trị UTĐTT di Bảng 1.2 - Giai đoạn theo hệ thống phân loại TNM cho UTĐTT tỷ lệ sống bệnh nhân sau năm Bảng 1.3 - Tần suất xuất đột biến RAS UTĐTT .14 Bảng 1.4 - So sánh số phương pháp phát đột biến gen phổ biến .17 Bảng 2.1 - Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 - Các vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.3 - Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.4 - Các loại đột biến phát kit StripAssay® (ViennaLab) .33 Bảng 2.5 - Trình tự mồi dùng để khuếch đại exon exon 20 gen PIKCA3 34 Bảng 3.1 - Thông tin đối tượng tham gia nghiên cứu 38 Bảng 3.2 - Tổng hợp đặc điểm 44 bệnh nhân UTĐTT nghiên cứu 40 Bảng 3.3 - Tổng hợp loại đột biến theo vị trí phát nghiên cứu 47 Bảng 3.4 - Mối tương quan trình trạng đột biến gen đặc điểm bệnh nhân 50 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ AKT/PKB Protein Kinase B BSC Best Supportive Care (chăm sóc hỗ trợ tốt nhất) CA 19-9 Cancer Antigen 19-9 CEA Carcinoembryonic Antigen DNA Deoxyribonucleic Acid EGF Epidermal Growth Factor (yếu tố tăng trưởng biểu bì) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) FDA US Food And Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) FFPE Formalin-Fixed Paraffin-Embedded formalin vùi parafin) JAK Janus Kinase MAPK/ERK Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular SignalRegulated Kinases (Mô cố định MEK/MAPKK/MAP2K Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase mTOR Mammalian Target of Rapamycin PDGF Platelet-Derived Growth Factor (yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor Factor (thụ thể yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDK1 Phosphoinositide-Dependent Kinase-1 PI3K Phosphotidylinositol–3 Kinase v PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate PTEN Phosphatase And Tensin Homolog STAT Signal Transducer and Activator of Transcription TNM Tumor - Nodule - Metastase (Khối u - Hạch vùng - Di xa) UTĐTT Ung thư đại trực tràng VEGF VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor (yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) vi MỞ ĐẦU Điều trị ung thư đại trực tràng (UTĐTT) có bước tiến lớn 10 năm qua, thời gian sống trung bình vượt qua số 30 tháng Đây kết đời thuốc điều trị bao gồm thuốc gây độc tế bào (irinotecan, oxaliplatin) thuốc điều trị đích (bevacizumab, aflibercept, cetuximab, panitunumab, regorafenib) tích hợp vào thành phác đồ điều trị tiêu chuẩn thực hành lâm sàng Chẩn đoán sớm bệnh điều trị phác đồ đóng vai trò quan trọng để kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên tất bệnh nhân đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích, hiệu thuốc phụ thuộc vào gen nằm đường tín hiệu phụ thuộc EGFR KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA Việc xác định trạng thái đột biến gen cần thiết việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân, tiên lượng tiến triển bệnh hạn chế tác dụng phụ thuốc Điều góp phần giúp nâng cao hiệu điều trị, tăng thời gian sống thêm giúp cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng có chất lượng sống tốt Xét khía cạnh kinh tế, vấn đề góp phần tránh lãng phí định điều trị thuốc điều trị đích (trong trường hợp thuốc không đem lại hiệu quả) Trong tương lai gần, việc xét nghiệm gen điều kiện cần thiết làm tiền đề triển khai việc điều trị cá thể hóa bệnh nhân ung thư đại trực tràng Trên giới, việc xác định trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA xét nghiệm cần thiết thực thường qui nước phát triển Ở Việt Nam, gen KRAS BRAF triển khai thực thường qui số bệnh viện lớn, NRAS bước đầu triển khai chưa có số liệu báo cáo, PIK3CA chưa có báo cáo bệnh nhân ung thư đại trực tràng Qua tìm hiểu phân tích tình hình nghiên cứu giới Việt Nam, xét thấy gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA dấu ấn sinh 68 Simkens L.H., Van Tinteren H., et al (2015), “Maintenance treatment with capecitabine and bevacizumab in metastatic colorectal cancer (CAIRO3): a phase randomised controlled trial of the Dutch Colorectal Cancer Group”, Lancet, 385 (9980), pp 1843-1852 69 Sridharan M., Hubbard J.M., and Grothey A (2014), “Colorectal cancer: how emerging molecular understanding affects treatment decisions”, Oncology (Williston Park), 28 (2), pp 110-118 70 Stec R., Semeniuk-Wojtas A., et al (2015), “Mutation of the gene as a prognostic factor in patients with colorectal cancer”, Oncol Lett, 10 (3), pp 1423-1429 71 Tabernero J., Van Cutsem E., et al (2014), “Aflibercept versus placebo in combination with fluorouracil, leucovorin and irinotecan in the treatment of previously treated metastatic colorectal cancer: prespecified subgroup analyses from the VELOUR trial”, Eur J Cancer, 50 (2), pp 320-331 72 Tournigand C., Andre T., et al (2004), “FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study”, J Clin Oncol, 22 (2), pp 229-237 73 Therkildsen C., Bergmann T.K., Henrichsen-Schnack T., Ladelund S., and Nilbert M (2014), “The predictive value of KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis”, Acta Oncol, 53 (7), pp 852-864 74 Tran B., Kopetz S., et al (2011), “Impact of BRAF mutation and microsatellite instability on the pattern of metastatic spread and prognosis in metastatic colorectal cancer”, Cancer, 117 (20), pp 4623-4632 75 Van Cutsem E., Kohne C.H., et al (2011), “Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to 69 tumor KRAS and BRAF mutation status”, J Clin Oncol, 29 (15), pp 2011-2019 76 Van Cutsem E., Peeters M., et al (2007), “Open-label phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best supportive care alone in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer”, J Clin Oncol, 25 (13), pp 1658-1664 77 Van Cutsem E., Tabernero J., et al (2012), “Addition of aflibercept to fluorouracil, leucovorin, and irinotecan improves survival in a phase III randomized trial in patients with metastatic colorectal cancer previously treated with an oxaliplatin-based regimen”, J Clin Oncol, 30 (28), pp 3499-3506 78 Vogelaar F., Van Erning F., et al (2015), “The prognostic value of Microsatellite Instability, KRAS, BRAF and PIK3CA mutations in stage II colon cancer patients”, Mol Med, pp 1-26 79 Wilhelm S.M., Dumas J., et al (2011), “Regorafenib (BAY 73-4506): a new oral multikinase inhibitor of angiogenic, stromal and oncogenic receptor tyrosine kinases with potent preclinical antitumor activity”, Int J Cancer, 129 (1), pp 245-255 80 Wood L.D., Parsons D.W., et al (2007), “The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers”, Science, 318 (5853), pp 1108-1113 81 Yang H., Higgins B., et al (2012), “Antitumor activity of BRAF inhibitor vemurafenib in preclinical models of BRAF-mutant colorectal cancer”, Cancer Res, 72 (3), pp 779-789 82 Zhang J., Zheng J., et al (2015), “Molecular spectrum of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in Chinese colorectal cancer patients: analysis of 1,110 cases”, Sci Rep, 5, pp 18678 70 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Mẫu bệnh án nghiên cứu BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã HSBA: Mã lưu trữ: Mã nghiên cứu: I PHẦN HÀNH CHÍNH: Họ tên: ………………………………………… Tuổi……3 Giới: Nam/Nữ Địa chỉ: Số nhà………… Thôn, phố………………Xã, phường……… …………… Huyện (Quận,TX)………….………………Tỉnh, Thành phố……………….…………… Ngày vào viện: ………/………/20…… Ngày viện ………/……/20…… Nghề nghiệp:.……………… ………… ………………………….…… …………… Thông tin liên lạc: ……………………………………………….……… ………… II PHẦN CHUYÊN MÔN: Lý vào viện:…… ………………………………….………………………… …… Chẩn đoán:………………………………… ……………… .Mã ICD10:…………… Vị trí khối nguyên phát:  Đại tràng trái  Đại tràng phải  Trực tràng Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm FFPE:  Phẫu thuật  Sinh thiết Vị trí lấy mẫu bệnh phẩm:  Tại chỗ  Nơi di Đặc điểm mô bệnh học:  Ung thư biểu mô tuyến  Ung thư biểu mô tuyến nhày  Ung thư biểu mô tế bào nhẫn  Khác Ghi rõ: Độ biệt hóa (trong trường hợp UTBM tuyến):  Cao  Vừa  Kém Tumor maker: CEA: CA 19-9: Chẩn đoán giai đoạn TNM Khối u nguyên phát (T) To T2   Tis T3   -1- T1  Hạch lympho vùng (N)  N0  N1  N2 Di cănxa (M)  M0  M1 Giai đoạn I  II  III TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN GEN KRAS:  Bình thường  Đột biến NRAS: BRAF: PIK3CA:  T4   III IV Ghi rõ:  Bình thường  Đột biến Ghi rõ:  Bình thường  Đột biến Ghi rõ:  Bình thường  Đột biến Ghi rõ: IV PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ Tia xạ tiền phẫu: u: Gy Tại hạch: Tia xạ đơn thuần: u: Gy Tại hạch: Phẫu thuật (tên): Tia xạ hậu phẫu: u: Gy Tại hạch: Hoá chất (phác đồ): Số đợt: Điều trị khác: Hà Nội, ngày ./ /20 Ký tên -2- Phụ lục 2: Qui trình tách DNA từ mô cố định formalin – vùi paraffin (Sử dụng sản phẩm QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit – Qiagen, C/N 56404) Chuẩn bị:  Hoá chất: Deparaffin solution, ethanol 96–100%, RNase A 100 mg/ml  Vật tư: ống ly tâm 1,7 ml, đầu tip có màng lọc, dao mổ  Thiết bị: pipet kèm giá đỡ, máy ly tâm, vortex, máy lắc rung ổn nhiệt (hoặc water bath, tủ ấm)  Đưa tất Buffer kit nhiệt độ phòng (15–25°C)  Nếu Buffer AL ATL xuất kết tủa, đun nóng lên 70oC lắc để hoà tan hoàn toàn  Lần sử dụng kit, thêm ethanol 96–100% vào Buffer AW1 AW2 (thêm 25 ml ethanol vào 19 ml Buffer AW1, 30 ml ethanol vào 13 ml Buffer AW2), đánh dấu chai Buffer bổ sung ethanol Tiến hành: Dùng dao mổ cắt phần mô chứa nhiều tế bào u, đưa vào ống ly tâm 1,7 ml Thêm 320 µl Deparaffin solution, đậy chặt nắp, vortex 10 giây Ly tâm nhanh để chất lỏng nắp ống lắng xuống Ủ mẫu 10 phút 56oC Đưa mẫu nhiệt độ phòng, thêm 180 µl Buffer ATL, vortex 10 giây Ly tâm tốc độ tối đa (khoảng 20.000 ×g) phút nhiệt độ phòng Lúc ống chia thành phân lớp: mẫu Buffer ATL dưới, deparaffin solution hòa tan paraffin Thêm 20 µl Proteinase K vào phân lớp ống, trộn pipet Ủ mẫu (hoặc đến mẫu tan hoàn toàn) 56oC Ủ mẫu 90oC -3- 10 Ly tâm nhanh để chất lỏng nắp ống lắng xuống 11 Đưa nhiệt độ phòng, thêm µl RNase A (100 mg/ml), ủ phút nhiệt độ phòng 12 Thêm 200 µl Buffer AL, trộn vortex 13 Thêm 200 µl ethanol 96-100%, trộn vortex Có thể xuất kết tủa trắng không ảnh hưởng tới chất lượng 14 Ly tâm nhanh để chất lỏng nắp ống lắng xuống 15 Đặt cột QIAamp MinElute lên ống ml sạch, chuyển toàn dung dịch lên cột, đậy nắp 16 Ly tâm 6.000 ×g phút, chuyển cột sang ống ml khác Nếu dung dịch không hết qua cột, ly tâm tốc độ cao cột không dung dịch 17 Thêm 500 µl Buffer AW1 vào cột, ly tâm 6.000 ×g phút, chuyển cột sang ống ml khác 18 Thêm 500 µl Buffer AW2 vào cột, ly tâm 6.000 ×g phút, chuyển cột sang ống ml khác 19 Ly tâm tốc độ tối đa phút để làm khô màng cột 20 Chuyển cột sang ống ly tâm 1,7 ml sạch, thêm 20-100 µl Buffer ATE vào màng cột, ủ 1-5 phút nhiệt độ phòng 21 Ly tâm tốc độ tối đa phút để thu DNA 22 DNA sử dụng bảo quản -20oC -4- Phụ lục 3: Qui trình định lượng DNA theo nguyên tắc huỳnh quang (Sử dụng sản phẩm Qubit™ dsDNA HS Kit – Molecular Probes, Q32851 máy Qubit® 3.0 Fluorometer – Invitrogen) Chuẩn bị  Ống pha trộn dung dịch, ống Qubit™ 0,5 ml (C/N Q32856)  Đầu tip có lọc Tiến hành Chuẩn bị ống Qubit™ 0,5 ml (gồm mẫu cần định lượng ống chuẩn) Pha Qubit™ Working Solution: pha Qubit™ dsDNA HS Reagent Qubit™ dsDNA HS Buffer (tỷ lệ 1:200), trộn Chia Qubit™ Working Solution vào ống Qubit™ 0,5 ml: 190 µL vào ống chuẩn, 198 µL vào ống mẫu cần định lượng Thêm 10 µL Qubit™ dsDNA HS Standard vào ống chuẩn tương ứng, trộn vortex khoảng 2–3 giây, ủ phút nhiệt độ phòng Thêm µL mẫu cần định lượng vào ống mẫu tương ứng, trộn vortex 2–3 giây, ủ phút nhiệt độ phòng Khởi động máy Qubit® 3.0 Fluorometer, hình Home nhấn DNA chọn dsDNA High Sensitivity Trên hình Standards, nhấn Yes để chạy chuẩn Nếu không chạy chuẩn máy, nhấn No chuyển sang bước Đưa ống chứa Standard #1 vào máy, đậy nắp, nhấn Read (quá trình đọc khoảng giây), lấy ống Standard #1 ra; làm tương tự với ống chứa Standard #2 Đưa ống mẫu vào máy, đóng nắp, nhấn Read , ghi lại kết hiển thị máy 10 Tính nồng độ DNA đo được: Nồng độ mẫu = -5- Giá trị hiển thị (ng/µL) 10 Phụ lục 4: Quy trình phát đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF (Sử dụng kit KRAS XL StripAssay® - ViennaLab 5-680, NRAS XL StripAssay® - ViennaLab 5-620, BRAF 600/601 StripAssay® - ViennaLab 5-560) Khuếch đại gen Chuẩn bị:  Thiết bị: máy PCR, pipet kèm giá đỡ  Vật tư tiêu hao: đầu tip 10 200 µl có lọc, ống PCR  Đặt Taq DNA Polymerase, Taq Dilution Buffer, DNA khuôn lên đá lạnh Tiến hành: Chuẩn bị phản ứng PCR: 15 μl Amplification Mix (nắp vàng) μl Taq Dilution Buffer 0,2 μl Taq DNA Polymerase μl DNA khuôn tổng hợp (nồng độ 1–10 ng/µl) Chuyển ống PCR vào máy chạy theo chu trình nhiệt (đã cài đặt sẵn): Trước chu kỳ đầu: 37oC - 10 phút, 94oC - phút 35 chu kỳ: 94oC - 60 giây, 70oC - 50 giây, 56oC - 50 giây, 60oC - 60 giây Sau chu kỳ cuối: 60oC – phút Giữ đá 2–8oC để sử dụng lâu dài Lai phát Chuẩn bị:  Thiết bị: pipet kèm giá đỡ, máy hút dịch chân không, bể ổn nhiệt (water bath), máy lắc điều nhiệt  Dụng cụ vật tư tiêu hao: đầu tip 10, 200 1000 µl, kẹp  Đưa máy lắc lên 45oC  Đưa Hybridization Buffer Wash Solution A lên 45oC  Đưa Teststrip, DNAT, Conjugate Solution, Wash Solution B, Color Developer nhiệt độ phòng Chuẩn bị Typing Tray -6-  Đánh dấu viền Teststrip bút chì (luôn di chuyển Teststrip kẹp sạch, không để tay trần tiếp xúc Teststrip) Chú ý – thông tin tính an toàn sản phẩm:  DNAT chứa NaOH 1,6%  Conjugate Solution, Wash Solution B chứa NaN3 0,05%  Conjugate Solution chứa streptavidin-alkaline phosphatase  Color Developer chứa nitro blue tetrazolium (NBT) 5-bromo-4-chloro-3indolyl phosphate (BCIP) Tiến hành: Lấy 10 μl DNAT vào góc giếng sử dụng Typing Tray Thêm 10μl sản phẩm PCR, mix đều, giữ phút nhiệt độ phòng Thêm 1ml Hybridization Bufer vào giếng, lắc nhẹ Đưa Teststrip vào giếng tương ứng, ủ 30 phút 45oC, lắc khoảng 50 vòng/phút, loại dịch Chú ý: di chuyển Teststrip kẹp sạch, không để tay trần tiếp xúc Teststrip; đậy nắp water bath để tránh làm thay đổi nhiệt độ; bước cần tiến hành liên tục, không để Teststrip bị khô Thêm 1ml Wash Solution A, xả từ từ, loại dịch Thêm 1ml Wash Solution A, ủ lắc 45oC 15 phút, loại dịch Lặp lại bước Thêm 1ml Conjugate Solution, ủ lắc nhiệt độ phòng 15 phút, loại dịch Thêm 1ml Wash Solution B, xả từ từ, loại dịch 10 Thêm 1ml Wash Solution B, ủ lắc nhiệt độ phòng phút, loại dịch 11 Lặp lại bước 10 12 Thêm 1ml Color Deverloper, ủ lắc 15 phút nhiệt độ phòng bóng tối 13 Rửa Test strips vài lần nước sạch, để khô bóng tối -7- Phân tích kết Dán teststrip Collector™ tương ứng Đặt Collector™ vào máy scan (chú ý mũi tên Collector™ tương ứng mũi tên máy scan) Kiểm tra đảm bảo dongle (USB chứa phần mềm) kết nối với máy tính Mở phần mềm StripAssay® Evaluator Trong phần Automatic Mode, nhấn Auto–Scan & Analyze , nhấn tiếp Start Scanning (phần mềm tự động scan Collector™ khoảng 5–10 giây) Trong tab Start / Acquisition, nhập tên người thực xét nghiệm vào ô Operator, nhập mã lô sản phẩm vào ô Assay Lot Number Trong tab Strips / Sample Info, dùng chuột di chuyển nhận dạng teststrip để phần mềm đọc kết xác (nếu đầu teststrip dấu chấm màu đỏ phầm mềm không đọc kết teststrip đó) Trong tab Results, nhập mã bệnh phẩm vào ô Sample ID, nhập tên bệnh nhân vào ô Patient, đánh dấu chọn vào ô Detailed Summary phần Report Trong tab Reporting, nhấn Print để in kết phân tích -8- Phụ lục 5: Quy trình tinh sản phẩm PCR (Sử dụng sản phẩm PCR Clean up system – Promega, A9281) Trộn 50 μl dung dịch Membrane Binding Solution với 50 μl sản phẩm PCR, vortex Chuyển toàn hỗn hợp lên cột, ly tâm tốc độ16.000 x g phút Thêm 700 μl dịch rửa Membrane Wash Solution lên cột, ly tâm tốc độ 16.000 x g phút Thêm 500 μl dịch rửa l Membrane Wash Solution lên cột, ly tâm tốc độ 16.000 x g phút Ly tâm tốc độ tối đa phút để làm khô màng cột Chuyển cột sang ống ly tâm 1,7 ml sạch, thêm 40 µl nước cất vào màng cột, ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm tốc độ tối đa phút để thu DNA -9- Phụ lục 6: Qui trình giải trình tự tự động máy 3500 Dx Genetic Analyzer (Applied Biosystems) sản phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle Khuếch đại gen PCR Chuẩn bị phản ứng PCR: Thành phần phản ứng Thể tích 2X PCR premix solution 25 ul Mồi xuôi 2,5 ul Mồi ngược 2,5 ul DNA tách chiết* ul Nước cất 15 ul Tổng thể tích 50 ul *Thể tích DNA điều chỉnh pha loãng cho nồng độ tương 1-5 ng/ul phản ứng Xếp ống chứa mẫu vào máy PCR chạy theo chương trình nhiệt sau (đã cài đặt sẵn máy): Trước chu kỳ đầu: 95oC - 10 phút 35 chu kỳ: 95oC - 30 giây, 55oC - 30 giây, 72oC - 30 giây Sau chu kỳ cuối: 72oC – phút Giữ đá 2–8oC để sử dụng lâu dài Điện di kiểm tra kết khuếch đại phản ứng gel agarose 1% Sản phẩm PCR tinh kit PCR Clean up system (PromegaA9281) theo hướng dẫn nhà sản xuất - 10 - Giải trình tự tự động Chuẩn bị phản ứng PCR Big Dye Thành phần phản ứng Thể tích 5X Big Dye buffer ul 2,5X Ready Reaction Premix ul Mồi xuôi ul Sản phẩm PCR tinh ul Nước cất 11 ul Tổng thể tích 20 ul Nồng độ sản phẩn PCR: 10-50 ng/ul Xếp ống chứa mẫu vào máy PCR chạy theo chương trình nhiệt sau (đã cài đặt sẵn máy): Trước chu kỳ đầu: 96oC - phút 25 chu kỳ: 96oC - 10 giây, 50oC - giây, 60oC – phút Giữ đá 2–8oC để sử dụng lâu dài Tinh sản phẩm big Dye temination để loại bỏ toàn big dye thừa đem đọc hệ thống phân tích di truyền Applied Biosystems 3500 Dx Genetic Analyzer Phân tích kết quả: So sánh kết giải trình tự gen bệnh nhân với trình tự GeneBank gen PIKCA3 NM_006218.3 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) phần mềm BioEdit version 7.1.9 So sánh trình tự acid amin bệnh nhân với trình tự acid amin chuẩn Genebank NP_006209 phần mềm Blast NCBI - 11 - Phụ lục 7: Trình tự gen PIK3CA (NM_006218.3) (trích dẫn từ National Center for Biotechnology Information) Trình tự exon 5’_TTATTCTCTATATCAAAAACATTCACAGATAAGTTAACAAGATCCTCATCAGG AGGAAAAGTAAATTGTTCACTACCATCCTCTAGTATCCTAATCTGGTCTTGTTGTT GGCTAACTTCAGCAGTTACTATTCTGTGACTGGTGTAATATTAACCAAATAAATTA CTGGATTTGTTCTACAAATATTATGTCTTAGATTGGTTCTTTCCTGTCTCTGAAAA TAAAGTCTTGCAATGAAAATAAATTATTTTACAACAGTTAATTAGCAATGTAAAAT TTATTGAAAATGTATTTGCTTTTTCTGTAAATCATCTGTGAATCCAGAGGGGAAAA ATATGACAAAGAAAGCTATATAAGATATTATTTTATTTTACAGAGTAACAGACTAG CTAGAGACAATGAATTAAGGGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACA CGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAG GTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAAC TGAATTTGGCTGATCTCAGCATGTTTTTACCATACCTATTGGAATAAATAAAGCAG AATTTACATGATTTTTAAACTATAAACATTGCCTTTTTAAAAACAATGGTTGTAAA TTGATATTTGTGGAAAATCATACTACATTGGTAGTTGGCACATTAAATGCTTTTTC TTACTCTGAATTCCTGATATGACTTTCTTTAGGATTGTTTAAAATATTCTAGTAG_ 3’ Trình tự exon 20 5’-AAAAGGATTTAGTATGAACCAATTCATACATTTAATACTTATTAAACTCCTGA CATGCCAGGCATTGTTGTAGGTGCTGGTAATAAAGCAGTTTTTAAAAAGTCCTTAT TCTCTTGAAGTTTACATTCTAGTGGGGTAAAGGGAATCAAAAGATGTTGGTAAGAG AAGTGAGAGAGGAATGCTATTTTTTTATAGCTTTGTCTACGAAAGCCTCTCTAATT TTGTGACATTTGAGCAAAGACCTGAAGGTATTAACATCATTTGCTCCAAACTGACC AAACTGTTCTTATTACTTATAGGTTTCAGGAGATGTGTTACAAGGCTTATCTAGCT ATTCGACAGCATGCCAATCTCTTCATAAATCTTTTCTCAATGATGCTTGGCTCTGG AATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGACCCTAGCCT - 12 - TAGATAAAACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCA CATCATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATTGGATCTTCCACACAATTAAACAGCA TGCATTGAACTGAAAAGATAACTGAGAAAATGAAAGCTCACTCTGGATTCCACACT GCACTGTTAATAACTCTCAGCAGGCAAAGACCGATTGCATAGGAATTGCACAATCC ATGAACAGCATTAGAATTTACAGCAAGAACAGAAATAAAATACTATATAATTTAAA TAATGTAAACGCAAACAGGGTTTGATAGCACTTAAACTAGTTCATTTCAAAATTAA GCTTTAGAATAATGCGCAATTTCATGTTATGCCTTAAGTCCAAAAAGGTAAACTTT GAAGATTGTTTGTATCTTTTTTTAAAAAACAAAACAAAACAAAAATCCCCAAAATA TATAGAAATGATGGAGAAGGAAAAAGTGATGGTTTTTTTTGTCTTGCAAATGTTCT ATGTTTTGAAATGTGGACACAACAAAGGCTGTTATTGCATTAGGTGTAAGTAAACT GGAGTTTATGTTAAATTACATTGATTGGAAAAGAATGAAAATTTCTTATTTTTCCA TTGCTGTTCAATTTATAGTTTGAAGTGGGTTTTTGACTGCTTGTTTAATGAAGAAA AATGCTTGGGGTGGAAGGGACTCTTGAGATTTCACCAGAGACTTTTTCTTTTTAAT AAATCAAACCTTTTGATGATTTGAGG-3’ Đoạn trình tự có màu nâu trình tự exon 20, không bôi màu intron phía trước phía sau chúng Đoạn trình tự có màu vàng trình tự mồi xuôi mồi ngược tương ứng cho phản ứng PCR Vị trí thường quan sát thấy đột biến exon màu xanh: c.1624G>A (E542K), c.1633G>A (E545K), c.1633G>C (E545Q), c.1634A>G (E545G), c.1634A>T (E545V), c.1636C>G (Q546E), c.1636C>A (Q546K), c.1637A>T (Q546L) c.1637A>C (Q546P), c.1637A>G (Q546R) Vị trí thường quan sát thấy đột biến exon 20 màu xanh: c.3140A>T (H1047L), c.3140A>G (H1047R) - 13 - ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -* - Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG... học ung thư đại trực tràng 1.1.4 Các chất điểm khối u thư ng dùng .9 1.2 MỘT SỐ CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .10 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ MỘT... cứu Bước đầu khảo khát số gen mang tính định hướng điều trị ung thư đại trực tràng” nhằm mục tiêu:  Khảo sát trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA bệnh nhân ung thư đại trực tràng