BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN CAO SƠN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN CAO SƠN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ KHỐI PHỔ LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 62 72 04 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng hướng dẫn PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Lê Thị Hồng Hảo Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Trần Cao Sơn i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập nghiên cứu thực luận án hướng dẫn PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Lê Thị Hồng Hảo, Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS TS Thái Nguyễn Hùng Thu, Phó hiệu trưởng Trường Đại học Dược Hà Nội, Trưởng môn Hóa Phân tích - Độc chất TS Lê Thị Hồng Hảo, Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, hai người Thầy, Cô tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ cho kiến thức quý báu để hoàn thành luận án Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho tham gia học tập hoàn thành luận án thời gian quy định Các Thầy, Cô Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất Phòng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Trường PGS Phạm Gia Huệ nguyên Trưởng Bộ môn Hoá phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội người thầy đóng góp ý kiến, dẫn hoàn thành luận án Các anh chị em Khoa Độc học dị nguyên đồng nghiệp Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia động viên, giúp đỡ chia với khó khăn công việc Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm động viên trình học tập thực luận án Tác giả luận án Trần Cao Sơn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ x ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 1.1.1 Định nghĩa hóa chất bảo vệ thực vật 1.1.2 Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật 1.1.3 Một số nhóm hóa chất bảo vệ thực vật 1.2 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 13 1.2.1 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật giới 13 1.2.2 Tình hình sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật Việt Nam 14 1.2.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật an toàn hiệu 15 1.3 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 16 1.3.1 Khái niệm dư lượng mức dư lượng tối đa 16 1.3.2 Quy định mức dư lượng tối đa 17 1.3.3 Sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trồng thuốc bảo quản dược liệu 19 1.3.4 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu sản phẩm dược liệu 22 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT 23 1.4.1 Các phương pháp xử lý mẫu 23 1.4.2 Một số kỹ thuật dùng phân tích hóa chất bảo vệ thực vật 39 Chương ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 50 2.1.1 Hoá chất bảo vệ thực vật 50 iii 2.1.2 Đối tượng phân tích 54 2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 55 2.2.1 Hoá chất, thuốc thử 55 2.2.2 Chất chuẩn 55 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 57 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 58 2.3.1 Phương pháp khảo sát thực địa 58 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 59 2.3.3 Phương pháp xử lý mẫu 60 2.3.4 Phương pháp phân tích sắc ký khối phổ 60 2.3.5 Phương pháp thẩm định 61 2.3.6 Phương pháp phân tích mẫu thực 64 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 64 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 65 3.1.1 Khảo sát lựa chọn hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng dược liệu 65 3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích HCBVTV sắc ký khối phổ 76 3.1.3 Xây dựng quy trình chiết HCBVTV từ dược liệu sản phẩm dược liệu 85 3.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật số dược liệu sản phẩm dược liệu 100 3.2 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN TỪ DƯỢC LIỆU 115 3.2.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu tươi 115 3.2.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu khô 116 3.2.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật thực phẩm chức có thành phần thảo dược 117 3.2.3 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trà xanh 120 Chương BÀN LUẬN 122 iv 4.1 VỀ VIỆC XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 122 4.1.1 Về khảo sát hoá chất bảo vệ thực vật sử dụng dược liệu 122 4.1.2 Lựa chọn đối tượng nguyên liệu nghiên cứu 124 4.1.3 Về phương pháp xử lý mẫu 126 4.1.4 Về phương pháp phân tích sắc ký khối phổ 132 4.1.5 Về kết thẩm định phương pháp 138 4.2 VỀ DƯ LƯỢNG HOÁ CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRONG DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM TỪ DƯỢC LIỆU 141 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144 KẾT LUẬN 144 KIẾN NGHỊ 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 146 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL1 v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Giải thích AOAC Hiệp hội cộng đồng phân tích (Association of analytical communities) APCI Ion hóa hóa học áp suất khí (Atmospheric pressure chemical ionization) APPI Ion hóa quang học áp suất khí (Atmospheric pressure photo ionization) BVTV Bảo vệ thực vật ChE Cholinestase D-SPE Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction) ECD Detector bắt điện tử (Electron capture detector) EI Va chạm điện tử (Electron impact) EPA Cục Bảo vệ môi trường Mỹ (Environmental protection agency) 10 ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization) 11 FAO Tổ chức Nông nghiệp Lương thực (Food and agriculture organization) 12 FDA Cục dược phẩm thực phẩm Hoa Kỳ (Food and drug administration) 13 FL Huỳnh quang (Fluorescence) 14 GACP Thực hành tốt trồng thu hái dược liệu (Good agriculture and collection practice) 15 GAP Thực hành tốt nông nghiệp (Good agriculture practice) 16 GC Sắc ký khí (Gas chromatography) 17 GCB Than đen hoạt tính (Graphite carbon black) 18 GC-MS Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography mass spectrometry) 19 GC-MS/MS Sắc ký khí khối phổ hai lần (Gas chromatography tandem mass spectrometry) 20 GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography) 21 HCBVTV Hóa chất bảo vệ thực vật 22 HLB Cân thân nước, thân dầu (Hydrophilic lipophilic balance) 23 HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) vi TT Chữ viết tắt Giải thích 24 IAC Sắc ký lực miễn dịch (Immunoaffinity chromatography) 25 IS Chất chuẩn nội (Internal standard) 26 LC Sắc ký lỏng (Liquid chromatography) 27 LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass spectrometry) 28 LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry) 29 LOD Giới hạn phát (Limit of detection) 30 LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantification) 31 LD50 Liều chết trung bình (Median lethal dose) 32 LPME Vi chiết pha lỏng (Liquid phase microextraction) 33 MAE Chiết với hỗ trợ vi sóng (Microwave-assisted extraction) 34 MRL Giới hạn dư lượng tối đa (Maximum residue limit) 35 MMM Phương pháp đa dư lượng (Multiresidues multiclasses method) 36 MRM Kiểm soát đa phản ứng (Multi reaction mornitoring) 37 MS Khối phổ (Mass spectrometry) 38 MSPD Phân tán pha rắn mẫu thử (Matrix solid phase dispersion) 39 NCI Ion hóa hóa học âm (Negative chemical ionization) 40 NPD Detector nitơ phosphor (Nitrogen phosphorus detector) 41 PCI Ion hóa hóa học dương (Positive chemical ionization) 42 PDA Chuỗi diod quang (Photo-diod array) 43 PSA Các amin bậc bậc (Primary secondary amines) 44 PS-DVB Polystyren divinylbenzen 45 SE Chiết dung môi (Solvent extraction) 46 SFE Chiết siêu tới hạn (Supercritical-fluid extraction) 47 SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction) 48 SPME Vi chiết pha rắn (Solid phase microextraction) 49 TPP Triphenyl phosphat 50 UV-VIS Tử ngoại khả kiến (Ultra violet – Visible) 51 WHO Tổ chức Y tế giới (World health organization) 52 WTO Tổ chức Thương mại giới (World trade organization) vii DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Phân loại HCBVTV theo mối nguy Bảng 1.2 Số lượng hoạt chất HCBVTV phép sử dụng, hạn chế sử dụng cấm sử dụng Việt Nam 14 Bảng 1.3 Quy định Dược điển Việt Nam IV giới hạn HCBVTV 17 Bảng 1.4 Giá trị MRL mặc định số nước 19 Bảng 1.5 Một số ứng dụng phương pháp QuEChERS để phân tích HCBVTV dược liệu sản phẩm từ dược liệu 38 Bảng 1.6 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV GC-MS 44 Bảng 1.7 Một số ứng dụng phân tích đồng thời HCBVTV LC-MS 48 Bảng 2.1 Một số HCBVTV nghiên cứu luận án [113][129] 50 Bảng 2.2 Thông tin chất chuẩn sử dụng nghiên cứu 55 Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa tỷ lệ ion 62 Bảng 3.1 Các HCBVTV tiêu thụ phổ biến địa phương khảo sát 66 Bảng 3.2 Sự phổ biến HCBVTV theo nhóm phân loại 69 Bảng 3.3 Danh mục thuốc dược liệu địa phương khảo sát 71 Bảng 3.4 Danh mục HCBVTV sử dụng trồng thuốc 73 Bảng 3.5 Các điều kiện MS LC-MS/MS để phân tích HCBVTV 76 Bảng 3.6: Các thông số hoạt động tối ưu nguồn ion hoá 78 Bảng 3.7 Khảo sát gradient pha động (A = acid acetic 0,1%; B = methanol) 80 Bảng 3.8 Điều kiện gradient để tách hỗn hợp HCBVTV 81 Bảng 3.9 Độ lặp lại hệ thống LC-MS/MS 82 Bảng 3.10 Điều kiện MS GC-MS/MS sử dụng nghiên cứu 84 Bảng 3.11 Độ lặp lại hệ thống GC-MS/MS 85 Bảng 3.12 So sánh phương pháp chiết pH dịch chiết đo 91 Bảng 3.13 Tỷ lệ ion xác nhận ion định lượng HCBVTV 102 Bảng 3.14 Các nồng độ HCBVTV sử dụng để khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn 103 Bảng 3.15 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn HCBVTV mẫu dây thìa canh103 viii Sắc đồ aldicarb – chuẩn 100 ng/ml Sắc đồ acetamiprid – mẫu trắng PL43 Sắc đồ abamectin – mẫu trắng Sắc đồ carbaryl – mẫu trắng PL44 Sắc đồ thiamethoxam – mẫu trắng Sắc đồ carbofuran - mẫu trinh nữ hoàng cung PL45 Sắc đồ atrazin – mẫu bồ công anh Sắc đồ carbendazim – mẫu mã đề PL46 Sắc đồ acetamiprid – mẫu hoa nhài Sắc đồ acetamiprid – mẫu TPCN 09-27 PL47 Sắc đồ carbofuran – mẫu TPCN 12-05 PL48 Phụ lục Kết thử nghiệm liên phòng PL49 Phụ lục 10 Quy trình phân tích đồng thời dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu sản phẩm dược liệu Nguyên lý Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dược liệu sản phẩm dược liệu chiết kỹ thuật QuEChERS (viết tắt quick - nhanh, easy – dễ, cheap – rẻ tiền, effective – hiệu quả, rugged - ổn định, safe – an toàn) dựa việc chiết lỏng lỏng với dung môi acetonitril (MeCN) có bổ sung đệm acetat muối MgSO4, NaCl giúp cho trình tách lớp hiệu (Đối với mẫu chứa nhiều tannin, bổ sung thêm (CH3COO)2Pb để loại tạp) Dịch chiết làm kỹ thuật chiết pha rắn phân tán (d-SPE) với chất hấp phụ MgSO4 khan; amin bậc một, bậc hai (PSA) than đen graphite (GCB) để loại bỏ acid hữu cơ, loại nước thừa thành phần tạp khác Dịch chiết cuối phân tích LC-MS/MS GC-MS/MS Phạm vi áp dụng Phương pháp áp dụng để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật sau dược liệu sản phẩm từ dược liệu, bao gồm abamectin, acephat, acetamiprid, acetochlor, aldicarb, aldrin, atrazin, azoxystrobin, carbaryl, carbendazim, carbofuran, carboxin, chlorothalonil, chlorpyrifos, cypermethrin, dichlorvos, dimethoate, edifenphos, emamectin, endosulfan sulfat, fenobucarb, imidachlorprid, indoxacarb, isoprocarb, methiocarb, methomyl, permethrin, profenofos, tebuconazole, thiamethoxam trichlorfon Giới hạn định lượng HCBVTV nhỏ 0,01 mg/kg Phương pháp mở rộng để xác định HCBVTV khác propoxur, Dụng cụ, thiết bị Sử dụng thiết bị dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm thiết bị dụng cụ sau: - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) gồm máy sắc ký lỏng Shimadzu với bơm cao áp LC 20AD-XR, ổn nhiệt cột CTO-20A tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR ghép nối với máy khối phổ ba tứ cực 5500 QQQ - ABSciex, hệ thống sử dụng khí Nitơ từ sinh khí AB-3G Peak Scientific Hệ thống sắc ký khí khối phổ hai lần (GC-MS/MS) gồm máy sắc ký khí GC 7890A khối phổ MS 7000B Agilent Máy lắc vortex, IKA - Máy đồng mẫu HR1843, Phillips Máy li tâm Z383K, Hermle Cân phân tích (có độ xác 0,0001 g) XT22A, Precisa - Cân kĩ thuật (có độ xác 0,01 g), Precisa - PL50 - Cột sắc ký lỏng XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) tiền cột tương ứng (20 mm x 3,9 mm; 3,5 µm) Waters Cột sắc ký khí DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm) Agilent - Pipet loại: 1, 2, 5, 10, 20 mL Micropipet điều chỉnh thể tích: 10-100 µL, 100-1000 µL, 1000-5000 µL Ống ly tâm Teflon 50 mL, có nắp kín - Lọ đựng mẫu loại 1,8 mL, màu nâu dùng cho tiêm mẫu GC LC Các dụng cụ thông thường phòng thí nghiệm: cốc, ống đong, phễu, giấy lọc… Hóa chất, thuốc thử Các hoá chất sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm - Methanol dùng cho LC-MS Merck tương đương Acetonitril dùng cho LC-MS Merck tương đương Acid acetic (CH3COOH) Merck tương đương - Magnesi sulfat khan (MgSO4) Merck tương đương Dạng bột, độ tinh khiết > 98%, nung 500 0C > để loại thừa Natri acetat khan (CH3COONa) natri acetat trihydrat (NaOCOCH3.3H2O) Merck tương đương - Chì acetat (CH3COO)2Pb Merck tương đương Dinatri citrat sesquihydrat Merck tương đương Trinatri citrat dihydrat Merck tương đương - Chất hấp phụ PSA (primary secondary amines) Agilent tương đương Chất hấp phụ GCB (graphite carbon black) Agilent tương đương - Dung dịch acetonitril chứa 1% acid acetic (v/v): Hút 10 ml acid acetic băng hòa vào acetonitril đến lít - Hỗn hợp muối: Cân 6,0 g MgSO4, 1,5 g NaOAc (hoặc 2,5 g NaOAc.3H2O) 1,5 g NaCl cho vào túi dụng cụ chứa đậy kín Lắc trộn Mỗi hỗn hợp sử dụng cho mẫu phân tích - Hỗn hợp chất hấp phụ (d-SPE): Cân 150 mg MgSO4, 40 PSA 7,5 mg GCB cho vào ống ly tâm nhỏ ml Lắc trộn Mỗi hỗn hợp sử dụng cho mẫu phân tích - Nước cất hai lần Chuẩn bị dung dịch chuẩn - Chuẩn đơn HCBVTV Dr Ehrenstorfer Sigma-Aldrich có độ tinh khiết 95% - Các dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL: Cân xác lượng chất chuẩn khoảng 100,0 mg 32 HCBVTV, hoà tan acetonitril có chứa 1% PL51 acid acetic, cho vào bình định mức 100 mL khác bổ sung dung môi đến vạch Nồng độ dung dịch chuẩn gốc tính toán theo lượng cân thực tế độ tinh khiết chất chuẩn Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản từ 05°C, giữ năm - Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: lấy xác mL dung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL HCBVTV cho vào bình định mức 100 mL thêm acetonitril có chứa 1% acid acetic đến vạch Dung dịch bảo quản từ 0-5°C, có - thể giữ tháng Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian µg/mL: lấy xác mL dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 10 µg/mL cho vào bình định mức 10 mL thêm acetonitril có chứa 1% acid acetic đến vạch Dung dịch bảo quản từ 0-5°C, có - thể giữ tháng Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ng/mL: pha từ dung dịch chuẩn trung gian dung môi acetonitril có chứa 1% acid acetic dịch chiết mẫu trắng (sử dụng để xây dựng đường chuẩn mẫu) Các dung dịch pha sử dụng Chuẩn bị mẫu 6.1 Chuẩn bị mẫu sơ Toàn mẫu xay nhỏ (đối với mẫu rắn), lắc trộn (đối với mẫu lỏng) Lượng mẫu đem đồng tối thiểu 200 g Mẫu sau đồng nên phân tích ngay, trường hợp không phân tích bảo quản nhiệt độ mát 2-8 0C, túi kín không để ngày 6.2 Xử lý mẫu thử Quy trình xử lý mẫu dược liệu tươi - Cân xác khoảng 15 g mẫu cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm xác 15,0 ml acetonitril có chứa 1% acid acetic Lắc xoáy phút - Cho thêm hỗn hợp muối gồm g MgSO4 khan 1,5 g CH3COONa chuẩn bị trước Lắc mạnh tay phút ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút Hút ml lớp acetonitril phía cho vào ống ly tâm ml có chứa 150 mg - MgSO4,50 mg PSA 7,5 mg GCB (ống d-SPE) Lắc xoáy phút, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút phút Hút 0,5 ml dịch chiết vào lọ mẫu dùng cho GC LC - Phân tích GC-MS/MS LC-MS/MS Cần thực phân tích vòng 24 sau chuẩn bị mẫu PL52 Quy trình xử lý mẫu dược liệu khô, mẫu thực phẩm chức - Cân xác khoảng g mẫu cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm 15 ml nước vào ống ly tâm, lắc tay để trộn Để yên thời gian - không 15 phút Thêm xác 15,0 ml acetonitril có chứa 1% acid acetic Lắc xoáy phút Cho thêm hỗn hợp muối gồm g MgSO4, 1,5 g CH3COONa 1,5g NaClđã - chuẩn bị trước Lắc mạnh tay phút ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút Hút ml lớp acetonitril phía cho vào ống ly tâm ml có chứa 150 mg MgSO4,50 mg PSA 7,5 mg GCB (ống d-SPE) Lắc xoáy phút, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút phút Hút 0,5 ml dịch chiết vào lọ mẫu dùng cho GC LC Phân tích GC-MS/MS LC-MS/MS Cần thực phân tích vòng 24 sau chuẩn bị mẫu Quy trình xử lý mẫu chè - Cân xác khoảng g mẫu cho vào ống ly tâm 50 ml Thêm 15 ml nước vào ống ly tâm, lắc tay để trộn Để yên thời gian - không 15 phút Thêm xác 15,0 ml acetonitril có chứa 1% acid acetic Lắc xoáy phút Cho thêm hỗn hợp muối gồm g MgSO4, 1,5 g (CH3COO)2Pb 1,5g NaCl chuẩn bị trước - Lắc mạnh tay phút ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút phút Hút ml lớp acetonitril phía cho vào ống ly tâm ml có chứa 150 mg MgSO4,50 mg PSA 7,5 mg GCB (ống d-SPE) - Lắc xoáy phút, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút phút Ghi chú: Mẫu sau chiết nên phân tích ngay, phân tích bảo quản 2-8 0C không ngày 6.3 Mẫu trắng: Mẫu trắng tiến hành tương tự mẫu thử mẫu dược liệu sản phẩm dược liệu phù hợp xác định hóa chất bảo vệ thực vật phân tích Mẫu trắng cần chuẩn bị đủ để pha đường chuẩn mẫu 6.4 Mẫu kiểm tra Tiến hành tương tự mẫu thử có cho thêm lượng chuẩn xác biết nồng độ Tối thiểu lô mẫu phân tích cần có mẫu QC: Thêm xác 75 µl chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml vào mẫu sau cân để thu nồng độ dung dịch cuối 50 ng/ml 100 ng/ml PL53 Phân tích sắc ký khối phổ 7.1 LC-MS/MS Điều kiện LC: - Cột sắc ký XBridge BEH C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) tiền cột tương ứng (20 mm x 3,9 mm; 3,5 µm) Waters - Nhiệt độ cột: 30oC Thể tích tiêm mẫu: 10 µL Pha động gồm hai kênh A (acid acetic 0,1% nước) B (methanol) với chế độ gradient sau: Thời gian (phút) Tốc độ dòng (mL/phút) Kênh A: HCOOH 0,1 % nước (% V/V) Kênh B: Methanol (% V/V) 0,01 0,7 75 25 1,00 0,7 75 25 8,00 0,7 10 90 12,00 0,7 10 90 13,00 0,7 75 25 15,00 0,7 75 25 Điều kiện - Nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương (+), với thông số sau: Thông số MS (đơn vị) Giá trị tối ưu DP (V) 90 EP (V) CUR (psi) 20 CAD (psi) ISV (V) 5500 TEM (oC) 450 GS1 (psi) 25 GS2 (psi) 15 Dwell time (ms) 25 PL54 - Các giá trị ion mẹ, ion lượng bắn phá lựa chọn tối ưu cách tiêm trực tiếp dung dịch HCBVTV 100 ng/mL vào máy MS Các thông số sau: Định lượng Xác nhận Ion mẹ [M+H]+ (m/z) Ion (m/z) Acetochlor 270 224 13 24 148 25 10 Aldicarb 213 116 15 14 89 15 12 Atrazin 216 96 31 12 104 37 16 Azoxystrobin 404 372 19 12 344 31 28 890,5 305 31 12 567,5 17 20 Acetamiprid 223 126 25 16 56 19 10 Carbaryl 202 145 13 18 127 37 16 Carbofuran 222 165 15 10 123 29 14 Carbendazim 192 160 23 16 132 39 16 10 Carboxin 236 143 19 16 87 29 14 11 Dichlorvos 221 109 23 16 127 18 20 12 Dimethoat 230 199 13 22 125 27 18 13 Edifenphos 311 283 17 32 109 35 16 14 Emamectin 886,5 158 39 14 302 35 22 15 Fenobucarb 208 152 11 12 95 19 20 16 Imidacloprid 256 209 21 12 175 27 20 17 Indoxacarb 528 249 21 30 293 17 18 18 Isoprocarb 194 95 19 14 137 11 18 19 Methiocarb 226 169 11 22 121 23 20 20 Methomyl 163 88 13 14 106 13 24 21 Profenofos 373 303 23 34 345 17 32 22 Propoxur 210 111 19 16 93 31 14 23 Tebuconazol 308 125 39 18 151 31 20 24 Thiamethoxam 292 211 15 12 181 29 22 25 Trichlorfon 257 109 23 16 221 15 22 26 TPP (IS) 327 77 61 12 - - - TT HCBVTV Abamectin PL55 CE CXP Ion (eV) (V) (m/z) CE CXP (eV) (V) 7.2 GC-MS/MS Máy sắc ký khí GC 7890A Agilent với điều kiện phân tích sau: - Cột sắc ký DB5-MS (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm) Agilent - Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 250oC - Chế độ tiêm mẫu: không chia dòng (splitless) - Khí mang heli, tốc độ dòng 0,8 mL/phút - Chương trình nhiệt độ: 60oC (giữ phút), tăng 20oC /phút lên 180oC (0 phút), sau tăng 4oC /phút lên 260oC (giữ phút) - Nhiệt độ phận kết nối sắc ký khí khối phổ: 280oC Bộ tiêm mẫu tự động CTC-Pal: - Thể tích tiêm mẫu µL Khối phổ MS 7000B Agilent - Nguồn ion hoá: EI 70 eV - Nhiệt độ nguồn Ion: 230oC - Thời gian cắt dung môi: phút - Các giá trị ion mẹ, ion lượng bắn phá lựa chọn tối ưu HCBVTV Các điều kiện tối ưu sau: HCBVTV Acephat Aldrin Chlorothalonil Chlorpyrifos Cypermethrin Ion mẹ (m/z) Ion sản phẩm (m/z) CE (eV) 136 94 14 Định lượng 136 42 Xác nhận 263 193 34 Định lượng 255 220 14 Xác nhận 264 168 28 Định lượng 266 133 32 Xác nhận 314 258 14 Định lượng 316 260 14 Xác nhận 163 127 Định lượng 163 91 12 Xác nhận Ghi Endosulfan sulfat 272 237 16 Định lượng 270 235 16 Xác nhận Permethrin 163 127 Định lượng PL56 HCBVTV TPP Ion mẹ (m/z) Ion sản phẩm (m/z) CE (eV) 183 168 12 Xác nhận 326 169 34 Nội chuẩn Ghi Tính toán kết Căn vào đường chuẩn tương quan tỷ lệ diện tích HCBVTV chia cho diện tích nội chuẩn TPP nồng độ HCBVTV tương ứng, ta tính hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật dung dịch chạy máy Hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật mẫu tính theo công thức sau: đó: + X hàm lượng HCBVTV mẫu (µg/kg); + Cx hàm lượng HCBVTV dịch phân tích (ng/mL); + V thể tích dịch chiết (mL); + m khối lượng mẫu (g) - Đối với mẫu dược liệu tươi: X có giá trị Cx (V = 15 mL m ≈ 15 g) - Đối với mẫu dược liệu khô, mẫu TPCN (viên, gói), mẫu chè khô: X có giá trị 3Cx (V = 15 mL m ≈ g) Kiểm soát chất lượng - Phân tích lần song song; kết không lệch 10 % so với giá trị trung bình, tiến hành phân tích lại thêm lần - Mẫu QC phải đạt độ thu hồi từ 70 đến 120% PL57 ... DƯỢC LIỆU VÀ SẢN PHẨM CHẾ BIẾN TỪ DƯỢC LIỆU 115 3.2.1 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dư c liệu tươi 115 3.2.2 Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật dư c liệu khô 116 3.2.3 Dư lượng. .. HCBVTV từ dư c liệu sản phẩm dư c liệu 85 3.1.4 Thẩm định phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật số dư c liệu sản phẩm dư c liệu 100 3.2 DƯ LƯỢNG HÓA CHẤT BẢO VỆ THỰC VẬT TRÊN... hóa chất bảo vệ thực vật số dư c liệu sản phẩm từ dư c liệu sắc ký khối phổ thực với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp phân tích đa dư lượng HCBVTV dư c liệu sản phẩm từ dư c liệu