i HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẬU NINH THUẬN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2016 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẬU NINH THUẬN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu nhóm nghiên cứu, số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có công bố công trình khác Tác giả luận văn Đậu Ninh Thuận ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nghiêm Ngọc Minh - Phó Viện trƣởng Viện Nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy tâm huyết giúp đỡ tạo điều kiện cho để thực đề tài nghiên cứu khoa học phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Thầy tận tình hƣớng dẫn, dành thời gian trao đổi, định hƣớng nhƣ động viên, nhắc nhở dìu dắt trình nghiên cứu, thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể anh chị phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, đặc biệt ThS Nguyễn Thị Hoài Thu KS Phạm Thùy Linh tạo điều kiện, giúp đỡ, bảo tận tình cho suốt trình thực hiện, nghiên cứu, hoàn thành luận văn Bên cạnh đó, xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Khoa học sống Trƣờng ĐH Khoa học - Đại học Thái Nguyên với Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu trƣờng nhƣ viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần để hoàn thành tốt luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên ng y tháng năm 2016 HỌC VIÊN Đậu Ninh Thuận iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG viii MỞ ĐẦU .1 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột SEB giới Việt Nam .3 1.1.1 Khái quát tình hình ngộ độc thực phẩm 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm S aureus v độc tố ruột SEB giới v Việt Nam .5 1.2 Giới thiệu Staphylococcus aureus 1.2.1 Lịch sử phát .9 1.2.2 Đặc điểm phân loại 10 1.2.3 Đặc điểm vi khuẩn học 12 1.3 Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B 17 1.3.1 Cấu trúc phân tử v chế gây độc SEB 18 1.3.2 Gen seb 19 1.3.3 Triển vọng ứng dụng SEB 20 1.4 Các kỹ thuật xác định S aureus phòng thí nghiệm 21 1.4.1 Các kỹ thuật thông thường xác định S aureus 21 1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 22 1.4.3 Một số kỹ thuật dựa miễn dịch 24 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu, trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 27 2.1.1 Vật liệu 27 2.1.2 Các kit 27 2.1.3 Hóa chất máy móc v thiết bị sử dụng 27 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng số .29 2.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 30 2.2.3 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony - PCR) 31 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 31 iv 2.2.5 Phương pháp tinh sản phẩm từ gel agarose 32 2.2.6 Phương pháp tách dòng gen seb vector pTZ57R/T .32 2.2.7 Phương pháp xử lý enzym hạn chế gen seb v vector biểu pET22b(+) 33 2.2.8 Phương pháp ghép nối gen ngoại lai v o vector pET22b(+) 37 2.2.9 Phương pháp biến nạp DNA plasmid v o tế b o khả biến E coli 37 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .43 3.1 Tách chiết DNA tổng số chủng Staphylococcus aureus 43 3.2 Tách dòng gen seb534 43 3.2.1 Nhân gen seb534 từ chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 43 3.2.2 Tinh sản phẩm PCR 44 3.2.3 Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector tách dòng pTZ57R/T 45 3.2.4 Xác định trình tự gen seb534 46 3.3 Thiết kế vector biểu pET22(b+) mang gen seb534 48 3.3.1 Xử lý enzym cắt hạn chế tạo đầu cắt so le gen seb534 v vector pET22(b+) 48 3.3.2 Gắn đoạn gen đích seb534 v o vector biểu pET22(b+) .50 3.3.3 Chọn lọc dòng tế b o chứa vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) .51 3.4 Tối ưu điều kiện biểu gen seb534 tế b o E coli BL21(DE3) 53 3.4.1 Biểu gen seb534 tế b o E coli BL21(DE3) 53 3.4.2 Tối ưu điều kiện biểu gen seb534 55 3.5 Tinh protein tái tổ hợp SEB534 59 KẾT LUẬN .62 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter APS Ammonium persulphate Bp Base pair dH2O Nƣớc khử ion DNA Deoxyribonucleic acid DNase Deoxyribonuclease dNTP Deoxyribonucleotide EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid Kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria - Bertani Ml Milliliter OD Optical density PBS Phosphate buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid S aureus Staphylococcus aureus SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEB Staphylococcal enterotoxin B SEs Staphylococcal enterotoxins TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA vi TEMED Tetramethylethylenediamine v/p Vòng/phút v/v volume/volume w/v Weight/volume WHO World Health Organization wtSEB Wild type SEB vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 12 Hình 1.2 Vi khuẩn tụ cầu S aureus Gram dƣơng dƣới kính hiển vi .12 Hình 1.3 Các độc tố định S aureus 16 Hình 1.4 Cấu trúc tinh thể protein SEB .18 Hình 1.5 Cơ chế gây độc siêu kháng nguyên 19 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Hình 2.2 Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T .32 Hình 2.3 Cấu trúc vertor biểu pET22(b+) 35 Hình 3.1 Sản phẩm tách DNA tổng số chủng S aureus 43 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb534 44 Hình 3.3 Kết tinh sản phẩm PCR 44 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp gel agarose 1% 45 Hình 3.5 Điện di đồ sản phẩm cắt seb534/pTZ57R/T .46 enzym hạn chế EcoRI HindIII .46 Hình 3.6 Trình tự gen seb534 chủng S aureus 47 Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm seb534 sau tinh 49 Hình 3.8 Điện di đồ plasmid pET22(b+) sau cắt enzym hạn chế .49 Hình 3.9 Kết biến nạp vector tái tổ hợp seb534/pET22(b+) .50 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc 52 để chọn dòng mang plasmid tái tổ hợp seb534/pET22(b+) 52 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid seb534/pET22(b+) dòng khuẩn lạc 53 Hình 3.12 Điện di đồ kiểm tra biểu protein SEB534 .54 Hình 3.13 Điện di đồ ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534 56 Hình 3.14 Điện di đồ ảnh hƣởng nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543 57 Hình 3.15 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cảm ứng 58 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh .60 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam từ năm 2007 - 2014 Bảng 1.2 Sơ tình hình nhiễm độc S aureus giới năm gần .6 Bảng 1.3 Sơ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng toàn quốc từ 2007 - 2016 Bảng 1.4 Phân loại khoa học S aureus 10 Bảng 2.1 Cặp mồi sử dụng cho tách dòng .27 Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng 28 Bảng 2.3 Các máy móc thiết bị sử dụng 29 Bảng 2.4 Thành phần PCR .30 Bảng 2.5 Thành phần gel tách 12% 40 Bảng 2.6 Thành phần gel cô 5% 40 Bảng 3.1 Độ tƣơng đồng gen seb534 chủng S aureus nghiên cứu với số chủng vi khuẩn ngân hàng gen giới (NCBI) 47 55 Để cải thiện tính tan thu đƣợc lƣợng protein SEB534 tốt nhất, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian nuôi biểu đến khả biểu gen seb534 tế bào khả biến E coli BL21(DE3) 3.4.2 Tối ưu điều kiện biểu gen seb534 Rất nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, thời gian cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng, protein vật chủ, thành phần nồng độ chất dinh dƣỡng… làm ảnh hƣởng đến tổng hợp protein SEB tế bào khả biến E coli BL21(DE3) Cho nên việc khảo sát điều kiện tối ƣu cho tổng hợp protein ngoại lai điều quan trọng Chúng tiến hành khảo sát yếu tố nhiệt độ nuôi cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian nuôi cảm ứng để thu đƣợc lƣợng protein SEB tốt phục vụ cho nghiên cứu 3.4.2.1 Kết tối ưu nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ yếu tố ảnh hƣởng lớn phức tạp đến tổng hợp protein tái tổ hợp tế bào chủ Thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng vi khuẩn E coli 37oC Tuy nhiên, nhiệt độ không nhiệt độ thích hợp cho tổng hợp protein tái tổ hợp Bởi 37oC nhiệt độ thích hợp cho protease nội bào hoạt động, protein ngoại lai bị phân cắt sau tổng hợp, điều ảnh hƣởng đến hiệu suất biểu chất lƣợng protein Bên cạnh đó, nhiệt độ tối ƣu protein tái tổ hợp đƣợc điều khiển promoter mạnh nhƣ T7 promoter đƣợc tổng hợp ạt lƣợng lớn khoảng thời gian ngắn Trong đó, protein chức khác tham gia vào trình tạo cấu trúc protein bậc cao lại không đƣợc tổng hợp với tốc độ tƣơng ứng Điều ảnh hƣởng đến cấu trúc thứ cấp protein tái tổ hợp thông thƣờng làm cho protein đƣợc tổng hợp dƣới dạng không tan, có hoạt tính thấp chí hoạt tính Với mục đích thu đƣợc lƣợng lớn protein SEB với hoạt tính cao, không lẫn nhiều protein E coli, dễ dàng tinh protein nghiên cứu sau này, định tiến hành khảo sát khả tổng hợp protein SEB tái tổ hợp điều kiện nhiệt độ khác 20oC, 28oC 37oC với nồng 56 độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM thời gian cảm ứng Sau nuôi cảm ứng tế bào đƣợc thu lại để kiểm tra mức độ biểu tính chất protein tái tổ hợp Thành phần phản ứng bƣớc tiến hành nhƣ mô tả mục 2.2.12 Dịch chiết phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12% Kết đƣơc thể hình 3.13 Hình 3.13 Điện di đồ ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534 1: Protein SEB534 không cảm ứng IPTG 2-4: Protein thu nhiệt độ khác tương ứng theo thứ tự l 37oC; 28oCv 20oC; M: Thang chuẩn protein Kết hình cho thấy: giếng số xuất băng protein SEB534 đậm, rõ nét hẳn so với hai băng protein SEB534 giếng số giếng số Điều cho thấy, nhiệt độ 37oC protein tái tổ hợp SEB534 đƣợc biểu tốt so với điều kiện nhiệt độ 28oC 20oC Từ kết trên, lựa chọn 37oC nhiệt độ cảm ứng thích hợp để thực nghiên cứu 3.4.2.2 Kết tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG Sự biểu gen đích seb534 thành protein tái tổ hợp SEB đƣợc điều khiển T7 lac promoter đƣợc kiểm soát chặt chẽ chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranoside) có môi trƣờng Do đó, để seb534 biểu E Coli BL21(DE3) sau biến nạp đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin chất cảm ứng IPTG 57 Khi môi trƣờng nuôi cấy có chất cảm ứng IPTG, T7 lac promoter hoạt động, khởi động sinh tổng hợp T7 polymerase T7 polymerase đƣợc tạo thành bám vào vị trí T7 promoter để khởi đầu trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp SEB Nồng độ chất chất cảm ứng IPTG ảnh hƣởng đến mức độ biểu protein SEB Lƣợng protein SEB tạo nồng độ IPTG thấp nhƣng nồng độ cao lại gây độc cho tế bào Bên cạnh đó, IPTG hóa chất đắt tiền nên việc xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG cần bổ sung nồng độ thấp mà hiệu biểu protein SEB cao tiết kiệm đƣợc chi phí Trong thí nghiệm tiến hành khảo sát IPTG nồng độ sau: 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; mM 37oC thu mẫu sau cảm ứng để kiểm tra mức độ biểu Dịch chiết phần cặn tế bào đƣợc kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12% Thành phần phản ứng bƣớc tiến hành nhƣ mô tả mục 2.2.12 Kết đƣợc thể hình 3.14 Hình 3.14 Điện di đồ ảnh hƣởng nồng độ IPTG tới hàm lƣợng protein SEB543 M: Thang chuẩn protein; 1: Mẫu không cảm ứng IPTG; 2-5: Protein SEB534 thu sau cảm ứng IPTG nồng độ khác theo thứ tự l : 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM; mM; Kết hình cho thấy: Ở giếng 2, 3, 4, với nồng độ IPTG khác từ thấp đến cao xuất băng protein SEB534 Tuy nhiên, giếng thứ 3, với nồng độ IPTG 0,5 mM cho băng protein SEB534 đậm rõ nét so với băng giếng 2, Do đó, chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,5 mM cho nghiên cứu 58 3.4.2.3 Kết tối ưu thời gian nuôi cấy Để thu đƣợc protein tái tổ hợp SEB với lƣợng lớn, chất lƣợng tốt, tiết kiệm chi phí thời gian cần phải tối ƣu hoá thời gian cảm ứng Trong trình cảm ứng, lƣợng protein tái tổ hợp đƣợc tạo thành tỷ lệ thuận với lƣợng sinh khối tế bào cảm ứng Do đó, tiến hành khảo sát thời điểm thu mẫu từ đến sau bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5 mM nuôi cấy 37oC Protein thu đƣợc giai đoạn đƣợc điện di kiểm tra gel polyacrylamide 12% Thành phần phản ứng bƣớc tiến hành nhƣ mô tả mục 2.2.12 Kết thí nghiệm đƣợc thể hình 3.15 Hình 3.15 Điện di đồ khảo sát ảnh hƣởng thời gian nuôi cảm ứng tới hàm lƣợng protein SEB534 1-5: Protein SEB thu thời điểm từ đến giờ; M: Thang chuẩn protein Hàm lƣợng protein SEB534 tăng dần sau nuôi biểu hàm lƣợng protein tổng số có chiều hƣớng giảm dần Do vậy, lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng cho trình tổng hợp protein SEB534 Từ thí nghiệm cho thấy: điều kiện tối ƣu để cảm ứng biểu protein tái tổ hợp SEB534 chủng biểu E coli BL21(DE3) nhiệt độ 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM, thời gian cảm ứng Protein SEB534 sau biểu tối ƣu điều kiện khác đƣợc kiểm tra tính tan cách dùng lysozyme siêu âm để phá tế bào, dịch phá đƣợc 59 kiểm tra gel polyacrylamide Kết cho thấy, việc thay đổi điều kiện biểu không cải thiện đƣợc tính tan SEB534 Kết tƣơng tự với nghiên cứu trƣớc protein tái tổ hợp đƣợc biểu với lƣợng lớn E coli, khoảng 70% protein tái tổ hợp biểu dạng không tan [62] Công bố Agrawal cộng rằng, với biểu protein SEB nguyên v n E coli sử dụng hệ vector pQE30UA, protein SEB thu đƣợc dạng không tan tinh cần phải có urea [14] Một công trình nghiên cứu khác việc tạo đột biến điểm, tạo đột biến đoạn biểu vùng gen seb, đoạn gen đƣợc đƣa vào hệ vector mang protein dung hợp maltose-binding protein (MBP) nhằm cải thiện tính tan protein tái tổ hợp Các đoạn gen khác SEB đƣợc đƣa vào vector H-MBP-T biểu E coli cho thấy: protein SEB nguyên v n, SEB đột biến cắt 11 amino acid đầu C, protein biểu dạng tan dạng đột biến đoạn, biểu đoạn gen ngắn khác, protein tái tổ hợp tồn dạng không tan [58] Nhƣ vậy, việc biểu protein dạng tan phụ thuộc nhiều yếu tố nhƣ: chất protein, hệ biểu hiện, điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng Để cải thiện tính tan protein tái tổ hợp, nhiều hãng sản xuất vector thiết kế thêm protein dung hợp với protein ngoại lai biểu 3.5 Tinh protein tái tổ hợp SEB534 Trong dịch chiết thô thu đƣợc sau cảm ứng IPTG, protein lẫn nhiều tạp chất, cần tinh để thu đƣợc protein mong muốn với độ tinh cao phục vụ cho nghiên cứu Theo thiết kế vector biểu pET22(b+), protein SEB đƣợc tổng hợp có đuôi His-tag với acid amin histidine liên tục đầu C Phƣơng pháp tinh cột Ni-NTA dựa vào liên kết lực ion niken (Ni2+) với vòng imidazole histidine Khi acid amin histidine gần liên kết chúng với ion niken mạnh Trên sở đó, protein tái tổ hợp gen seb534 mã hóa liên kết đặc hiệu với ion niken Các phân tử protein tế bào đƣợc tổng hợp đuôi His-tag không gắn đƣợc với ion Ni2+ Protein tái tổ hợp đƣợc giữ lại cột đƣợc tách cho qua dung dịch đệm có chứa nồng độ imidazole thích hợp Protein SEB tồn dạng không tan nƣớc mà tan 60 đƣợc môi trƣờng biến tính điển hình nhƣ môi trƣờng có urea M Vì vậy, protein SEB đƣợc tinh từ dịch protein tổng số tế bào chủ E coli BL21(DE3) điều kiện đệm có chứa urea M Việc thu mẫu đƣợc tiến hành theo phân đoạn liên tục để kiểm tra protein SEB bắt đầu tách khỏi cột từ phân đoạn kết thúc phân đoạn Trong trình tinh thu mẫu protein SEB, tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm trƣớc sau tinh gel polyacrylamide 12% Các phân tử protein đƣợc xử lý SDS mecarpthanol, chúng bị phá vỡ cấu trúc bậc bậc trở thành dạng phân tử polymer cấu trúc bậc Đồng thời, SDS tạo thành lớp vỏ ion làm phân tử trở nên tích điện âm đồng Mecarthanol làm giảm liên kết disulphit hình thành tiểu phần cysteine Do vậy, phân tách gel phụ thuộc vào trọng lƣợng kích thƣớc phân tử protein Sản phẩm tinh tinh protein SEB534 đƣợc điện di gel polyacrylamide 12% đƣợc thể hình 3.16 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh M: Thang chuẩn protein; 1: Protein SEB sau tinh sạch; 2: Phân đoạn dịch qua cột với đệm rửa; 3: Phân đoạn dịch phá sau chảy qua cột Kết điện di đồ sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh cho thấy: giếng 1, sản phẩm protein SEB534 tái tổ hợp sau tinh cho 61 băng đậm, với khối lƣợng phân tử khoảng 22 kDa với kích thƣớc tính toán lý thuyết Nhƣ vậy, tinh thành công protein SEB534 dạng tự nhiên với độ tinh cao, quy trình tinh qua cột lực SEB phù hợp Cùng với việc biểu tinh thành công SEB534, nhóm nghiên cứu thuộc đề tài KC.04.14/11-15 Nghiêm Ngọc Minh làm chủ nhiệm tiến hành nghiên cứu biểu gen seb có kích thƣớc 720 bp tinh protein SEB720 Kháng nguyên tái tổ hợp SEB534 SEB720 đƣợc tiến hành kiểm tra độc tính kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để đƣa lựa chọn tốt cho việc sử dụng kháng nguyên khối lƣợng 22 kDa hay 28 kDa cho việc tạo kháng thể đơn dòng để chế tạo que thử nhanh phát độc tố SEB tụ cầu vàng gây 62 KẾT LUẬN Đã nhân dòng xác định trình tự gen seb534 từ chủng tụ cầu vàng S aureus đƣợc phân lập Thái Nguyên Đã thiết kế đƣợc vector pET22b(+) biểu gen seb534 mã hóa cho kháng nguyên SEB Đã biểu tối ƣu điều kiện biểu protein tái tổ hợp SEB534 chủng biểu E coli BL21(DE3) với nhiệt độ nuôi cấy 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM thời gian cảm ứng Đã tinh thành công protein tái tổ hợp SEB534 KIẾN NGHỊ Xác định nồng độ protein tái tổ hợp SEB534 sau tinh kiểm tra độc tính protein tái tổ hợp SEB534 đối tƣợng thử nghiệm (chuột thỏ) Nhân dòng biểu tinh protein tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng đột biến độc tính 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2011), Chiến lược quốc gia an to n thực phẩm giai đoạn 2011- 2020 v tầm nhìn 2030, Bộ Y tế, tr 4-20 Phạm Văn Ca, Cao Văn Viên (2005), “Tình hình kháng kháng sinh Staphylococcus aureus Viện Y học lâm sàng bệnh nhiệt đới năm 20022003”, Tạp chí Y học dự phòng tập XV, 1(73), tr 51-54 Lê Huy Chính (2009), Vi sinh y học, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Văn Dịp (1993), Ứng dụng nguyên lý sinh vật học v di truyền học để xác định tính chất dịch tễ học Staphylococcus aureus, Trƣờng Đại học Y Hà Nội, tr 3-5 Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thanh Yến, Phan Thị Kim, Nguyễn Thị Sợt, Nguyễn Thị Khánh Sâm (2005), Tình hình ô nhiễm vi khuẩn v nhận thức vệ sinh an to n thực phẩm người kinh doanh thức ăn đường phố Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, Đỗ Thị Hòa (2006), “Phòng chống tụ cầu trùng vàng”, Khoa học phổ thông số 30/06 Lâm Quốc Hùng (2009), Phòng chống ngộ độc Việt Nam năm 2008 dự báo v giải pháp phòng chống ngộ độc thực phẩm năm 2009 Cục an toàn vệ sinh thực phẩm, Bùi Thị Mai Hƣơng, Nguyễn Thị Vân Lan, Nguyễn Lan Phƣơng (2007), Mức độ ô nhiễm v đặc điểm sinh vật hóa học chủng Staphylococcus aureus sinh enterotoxin thức ăn đường phố H Nội,Kỷ yếu hội nghị khoa học an toàn vệ sinh thực phẩm Lần thứ 4, Nhà xuất Y học, tr 243-249 Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phƣơng, Bùi Thị Kiều Nƣơng, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga, (2006), Khảo sát tính chất kháng kháng sinh số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa Y học Thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề Y tế công cộng Y học dự phòng, phụ tập 10(số 4), tr 406-411 64 10 Lê Văn Nam, Trần Viết Tiến, Phạm Văn Ca, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Vũ Trung (2014), “Nghiên cứu biểu lâm sàng tình trạng kháng kháng sinh Staphylococcus aureus bệnh viện nhiệt đới trung ƣơng bệnh viện quân y 103”, Tạp chí Y học Việt Nam, tập 433, tr 42-45 11 Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Phƣơng, Bùi Kiều Nƣơng (2003), Đánh giá mức độc ô nhiễm vi sinh vật thức ăn đường phố th nh phố Hồ Chí Minh năm 2002 Viện Vệ Sinh Y tế Công Cộng Thành phố Hồ Chí Minh, Thông tin khoa học, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm 12 Lê Duy Thành, Đinh Đoàn Long, Trần Thị Hồng (2009), Cơ sở sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục, tr 134-150, tr 195-200 13 Tạ Thành Văn (2010), PCR v số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, tr 11-26 Tiếng Anh 14 Agrawal R., Singh P K., Sharma S K., Kamboj D V., Goel A K , Singh L (2012), “Highly expressed recombinant SEB for antibody production and development of immunodetection system”, Indian J Microbiol 52, pp 191–196 15 Baba T., Bae T., Schneewind O., Takeuchi F., Hiramatsu K (2008), “Genome sequence of Staphylococcus aureus strain Newman and comparative analysis of staphylococcal genomes: polymorphism and evolution of two major pathogenicity islands”, J Bacteriol 190(1), pp 300-310 16 Balaban N.,Rasooly A (2000), “Staphylococcal enterotoxins”, International Journal of Food Microbiology61(1), pp 1-10 17 Bayles K W., Iandolo J J (1989), “Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal enterotoxin D”, J Bacteriol 171(9), pp 4799-806 18 Bean N H., Griffin P M., Goulding J S., Ivey C.B (1990), “Foodborne disease outbreaks, year summary, 1983-1987”, J Food Prot 53, pp 711-728 19 Bergdoll M S (1989), Staphylococcus aureus, In: Foodborne Bacterial Pathogens (Doyle, M.P., ed) Marcel Dekker, Inc., New York, NY, USA: 463-523 65 20 Bohach G A., Schlievert P M (1987), “Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C1 gene and relatedness to other pyrogenic toxins”, Mol Gen Genet 209(1), pp 15-20 21 Bohach G A., Schlievert P.M (1989), “Conservation of the biologically active portions of staphylococcal enterotoxins C1 and C2”, Infect Immun 57(7): 2249-2252 22 Bruce A G., Kermit D H (2009), CBRNE - Staphylococcal Enterotoxin B, http://emedicine.medscape.com/article/830715-overview 23 Capucine L., Sylvie P., Francoise D and Patrick F (2003), “Detectio and genotyping by real-time PCR of the Staphylococcal enterotoxin genes sea to sej”, Molecuilar and Cellular Probes 17, pp 139-147 24 Chang H C., Bergdoll M S (1979), “Purification and some physicochemical properties of staphylococcal enterotoxin D”, Biochemical 18, pp 1937-1942 25 Chiang Y C., Chang, L T., Lin, C W., Yang, C Y & Tsen, H Y (2006) PCR primers for the detection of staphylococcal enterotoxins K, L, and M and survey of staphylococcal enterotoxin types in Staphylococcus aureus isolates from food poisoning cases in Taiwan Journal of food protection 69(5), pp 1072-9 26 Chiang Y C., Liao W W., Fan C M., Pai W Y., Chiou C S., Tsen H Y (2008), “PCR detection of Staphylococcal enterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and survey of SE types in Staphylococcus aureus isolates from food-poisoning cases in Taiwan”, Int J Food Microbiol 121(1), pp 66-73 27 Christopher L J., Saleem A K (1986), “Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus”, Journal of bacteriology 166(1): 29-33 28 Collins C H., Patricia M L., Grange J M (1995), Staphylococcus and Micococcus, Collines and Lyne’s Microbiological Methods, pp 353-359 29 Couch J L., Soltis M T and Betley M J (1988), “Cloning and nucleotide sequence of the type E staphylococcal enterotoxin gene”, Journal of bacteriology170, pp 2954-2960 66 30 Cremonesi P (2005), "Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products”, Mol Cell Probes 19(5), pp 299-305 31 Darányi J., Buzna D (1926), “Aboutthe use of staphylococci in disinfection experiments”, Medical microbiology and immunology 105, pp 560-563 32 Ejem A., Damaris A., Timothy R and Ed G (2006), “Staphylococcal Enterotoxin B as a Biological Weapon: Recognition, Management, and Surveillance of Staphylococcal Enterotoxin”, Applied Biosafety11(3), pp 120-126 33 Genigeorgic C A (1989), “Present state of knowledge on staphylococcal intoxication”, Int J Food Microbiol 9, pp 327-360 34 Haeghebaert S., Le Q F., Gallay A., Bouvet P., Gomez M., Vaillant V (2002), "Les toxi-infections alimentaires collectives en France, en 1999 et 2000”, Bull Epidémiol Hebdo 23, pp 105-109 35 Henghold W B (2004), “Other biologic toxin bioweapons: ricin, staphylococcal enterotoxin B, and trichothecene mycotoxins”, 2nd Dermatol Clin 22(3), pp 257-262 36 Herron O L., Fitzgerald J R., Musser J M., Kapur V (2007), “Molecular correlates of host specialization in Staphylococcus aureus”, PlosOne 2(10): E1120 37 Hilmberg S D., Blake P A (1984), "Staphylococcal food poisoning in the United State”, J Am Med Assoc 251, pp 487-489 38 Hisaya K O., Katsuhiko O., Ken'ichi I., Yoshihiro I., Dong-Liang H., Hidehito K., Naoyuki S., Akio N., Takehiko U., Kunihiro S (2008), “Identification and Characterization of Two Novel Staphylococcal Enterotoxins, Types S and T”, Infect Immun 76(11), pp 4999-5005 39 Hovde C J., Hackett S P., Bohach G A (1990), “Nucleotide sequence of the staphylococcal enterotoxin C3 gene: sequence comparison of all three type C staphylococcal enterotoxins” Mol Gen Genet 220(2) 40 Huang L Y., Bergdoll M S (1970), “The primer structure of staphylococcal enterotoxin B”, J Biol Chem 245, pp 3518-3525 67 41 Jones C L., Khan S A (1986), “Nucleotide Sequence of the Enterotoxin B Gene from Staphylococcus aureus”, J Bacteriol 166(1), pp 29-33 42 Jordan E O., Burrows W (1934), “Further observations on staphylococcus food poisoning”, Am J Hyg 20, pp 604-610 43 Kadariya J., Smith T C., Thapaliya D (2014), “Staphylococcus aureus and Staphylococcal Food-Borne Disease: An Ongoing Challenge in Public Health”, Biomed Res Int 2014; 2014: 827965 44 Korolev S., Pinelis D., Savransky V., Komisar J., Vogel P., Fegeding K (2003), “Toxicity of the staphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions”, Toxicology 187(2/3), pp 229-238 45 Kusumaningrum H D., Van Putten M M., Rombouts F M., Beumer R R (2002), “Effects of antibacterial dishwashing liquid on foodborne pathogens and competitive microorganisms in kitchen sponges”, J Food Protect 65(1), pp 61-65 46 Leggiadro R J (2000), “The threat of biological terrorism: a public health and infection control reality”, Infect Control Hosp Epidemiol 21(1), pp 53-56 47 Martin M C., Fueyo J M., Gonzalez-Hevia M A., Mendoza M C (2004), “Genetic procedures for identification of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus from three food poisoning outbreaks”, Int J Food Microbiol 94(3), pp 279-286 48 Mary K S and John L M (2002), “Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches”, Food control 15, pp 5-10 49 Mead P S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L F., Bresee J S., Shapiro C., Griffin P M., Tauxe R V (1999), “Food-related illness and death in the United States”, Emerg Infect Dis 5(5), pp 7-25 50 Monaco M., Pedroni P., Sanchini A., Bonomini A., Indelicato A., Pantosti A (2013), “Livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus responsible for human colonization and infection in an area of Italy with high density of pig farming”, BMC Infect Dis 13(1), pp 258 68 51 Mossong J., Decruyenaere F., Moris G., Ragimbeau C., Olinger C M., Johler S., Perrin M., Hau P., Weicherding P (2015), “Investigation of a staphylococcal food poisoning outbreak combining case-control, traditional typing and whole genome sequencing methods, Luxembourg, June 2014”, Euro Surveill 2015, 20(45) 52 Munson S H., Tremaine M T., Betley M J., Welch R A.(1998), “Identification and characterization of staphylococcal enterotoxin types G and I from Staphylococcus aureus”, Infect Immun 66(7), pp 3337-3348 53 Omoe K., Ishikawa M., Shimoda Y., Hu D L., Ueda S., Shinagawa K (2002), “Detection of seg, seh, and sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S aureus isolates Harboring seg, seh, or sei genes”, J Clin Microbiol 40(3), pp 57-62 54 Reginald W B and Gayle A L (2001), Bacteriological Analytical Manual Online (Chapter12: Staphylococcus aureus), Center for Food Safety & Applied Nutrition, U S Food and Drug Administration 55 Salasia S I., Tato S., Sugiyono N., Ariyanti D., Prabawati F (2011), “Genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovines, humans, and food in Indonesia”, J Vet Sci 12(4), pp 353-361 56 Schmitt M., Schuler S U., Scmidt L W (1990), “Temperature limits off growth, Tnase, and enterotoxin production of Staphylococcus aureus strain isolated from food”, Int J Food Mcrobiol 11, pp 1-19 57 Ulrich R G., Sidell S., Taylor T J., Wilhelmsen C L., Franz D R (1997), Staphylococcal enterotoxin B and related pyrogenic toxins, In the textbook of military medicine, warfare, weaponry, and the casuality Medical aspects of chemical and biological warfare Falls Church, VA: Office of the Surgeon General, Department of the Army Available at: 58 Varshney A K., Wang X., Cook E., Dutta K., Scharff M D., Goger M J., Fries B C (2011), “Generation, characterization, and epitope mapping of neutralizing and protective monoclonal antibodies against Staphylococcal enterotoxin B induced lethal shock”, J Biol Chem 286, pp 9737-9747 69 59 Wei H L., Chiou C S (2001), Molecular subtyping of Staphylococcus aureus from an outbreak associated with a food handler, Epidemiol Infect 128, pp.15-20 60 Wieneke A A., Roberts D., Gilbert R J (1993), “Staphylococcal food poisoning in the United Kingdom, 1969-90”, Epidemiol Infect 110, pp 519-531 61 William G Gilroy (2005), Drug-resistant staph infections becoming an increasingly difficult health challenge, University of Notre Dame 62 Yang Z., Zhang L., Zhang Y., Zhang T., Feng Y., Lu X., Lan W., Wang J., Wu H., Cao C., Wang X (2011), “Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method”, Plos One 6(7), e22981 Internet 63 http://swampie.wordpress.com/2008/02/17/ 64 http://wiki.ggc.edu/wiki/Necrotizing_Fasciitis_Spring_'13 65 http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/staph.html 66 http://lumen.nd.edu/2005_04/Drug-resistantstaph.shtml 67 http://www.sciencedaily.com/releases/ 2007/05/070521145512.html 68 http://bioinfo.bact.wisc.edu/ themicrobialworld/stawilliph.html 69 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K1213 70 https://www.addgene.org/12651/ ... ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐẬU NINH THUẬN BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) TỪ CHỦNG TỤ CẦU VÀNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS ĐƢỢC PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên... Biểu tinh Staphylococcal enterotoxin B (SEB) từ chủng tụ cầu vàng Staphylococcus aureus phân lập Thái Nguyên Mục tiêu đề tài: Nhân dòng, biểu gen seb534 tự nhiên tinh protein tái tổ hợp SEB... trình tự gen seb534 tự nhiên từ chủng tụ cầu vàng S aureus đƣợc phân lập Thái Nguyên - Nghiên cứu tạo vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên SEB - Nghiên cứu điều kiện để tối ƣu khả biểu protein