BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VÕ VIẾT HÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA MỘT SỐ SẢN PHẨM NANO BẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VÕ VIẾT HÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA MỘT SỐ SẢN PHẨM NANO BẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hƣờng Hoa GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn này, nhận đƣợc giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, chuyên gia nhiều lĩnh vực, anh chị kỹ thuật viên, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu TS Lê Thị Hƣờng Hoa trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Việt Hùng cho nh ng lời khuyên quí báu tạo điều kiện giúp đỡ trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị khoa Nghiên cứu & phát triển, khoa Mỹ phẩm, khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thành luận văn Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, môn Hóa phân tích - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trƣờng Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè - nh ng ngƣời động viên, khích lệ sống học tập! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 Học viên Võ Viết Hùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT … DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ BẠC VÀ NANO BẠC 1.1.1 Tính chất kim loại bạc .2 1.1.1.1 Tính chất vật lý 1.1.1.2 Tính chất hóa học 1.1.2 Công nghệ nano, đặc tính phƣơng pháp điều chế nano bạc 1.1.2.1 Công nghệ nano .2 1.1.2.2 Đặc tính hạt nano bạc .3 1.1.2.3 Phƣơng pháp điều chế nano bạc  Phƣơng pháp khử vật lý  Phƣơng pháp ăn mòn laze  Phƣơng pháp khử hóa học  Phƣơng pháp khử hóa lý .5  Phƣơng pháp khử sinh học 1.1.3 Tác dụng diệt khuẩn nano bạc .6 1.1.4 Cơ chế kháng khuẩn nano bạc .8 1.1.5 Ứng dụng nano bạc .10 1.1.5.1 Lĩnh vực y tế 10 1.1.5.2 Công nghiệp mỹ phẩm 11 1.1.5.3 Công nghiệp thực phẩm, gia dụng .11 1.1.5.4 Lĩnh vực môi trƣờng .11 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HẠT NANO BẠC 12 1.2.1 Phân tích phổ UV-VIS 12 1.2.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua 13 1.2.2.1 Giới thiệu 13 1.2.2.2 Nguyên lý hoạt động tạo ảnh TEM 14 1.2.2.3 Ƣu điểm hạn chế TEM 14  Điểm mạnh TEM 14  Điểm yếu TEM 15 1.2.3 Kính hiển vi điện tử quét 15 1.2.3.1 Giới thiệu 15 1.2.3.2 Nguyên lý hoạt động tạo ảnh SEM 15 1.2.3.3 Ƣu điểm kính hiển vi điện tử quét 16 1.2.4 Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động 16 1.2.5 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử 17 1.2.5.1 Nguyên tắc 17 1.2.5.2 Cấu tạo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử 17 1.2.5.3 Phƣơng pháp AAS với kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu lửa 18 1.2.6 Các phƣơng pháp định lƣợng bạc .19 1.3 TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA NANO BẠC 20 1.3.1 Nguyên tắc………………………………………………………… 20 1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý khả gây bệnh số loài VSV dùng nghiên cứu 20 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 23 2.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Chất chuẩn 24 2.2.2 Chủng chuẩn 24 2.2.3 Hóa chất, dung môi .24 2.2.4 Môi trƣờng nuôi cấy VSV 24 2.2.5 Thiết bị, dụng cụ 25 2.2.5.1 Thiết bị 25 2.2.5.2 Dụng cụ 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng số tiêu kiểm nghiệm 26 2.3.1.1 Kiểm nghiệm hình dạng kích thƣớc nano bạc SEM 26 2.3.1.2 Định tính, định lƣợng nano bạc AAS 26  Khảo sát điều kiện tối ƣu cho định tính, định lƣợng nano bạc AAS 26  Đánh giá phƣơng pháp định tính, định lƣợng nano bạc AAS 26 2.3.1.3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn .27 2.3.1.4 Xây dựng quy trình thử cho số tiêu kiểm nghiệm 28 2.3.2 Khảo sát số ảnh hƣởng tới hình dạng, kích thƣớc hạt nano bạc 28 2.3.2.1 Tỷ lệ nồng độ AgNO3 PVP - K30 28 2.3.2.2 Tốc độ khuấy dung dịch AgNO3 28 2.3.2.3 Tốc độ bơm NaBH4 28 2.3.3 Áp dụng để kiểm nghiệm số sản phẩm 28 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 3.1 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH BÀO CHẾ TỚI HÌNH DẠNG, KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN BẠC 30 3.1.1 Tỷ lệ nồng độ AgNO3 PVP - K30 31 3.1.2 Tốc độ khuấy dung dịch AgNO3 32 3.1.3 Tốc độ bơm NaBH4 .32 3.2 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM 32 3.2.1 Kiểm nghiệm hình dạng kích thƣớc nano bạc SEM 32 3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu 33 3.2.1.2 Tiến hành đo 33 3.2.1.3 Đánh giá 34 3.2.1.4 Kết đo 34 3.2.1.5 Dự kiến tiêu hình dạng kích thƣớc tiểu phân bạc 37 3.2.2 Định tính, định lƣợng nano bạc AAS 37 3.2.2.1 Khảo sát điều kiện thích hợp cho phân tích bạc AAS 37  Khảo sát lựa chọn nồng độ acid 37  Khảo sát lựa chọn độ rộng khe 38  Khảo sát lựa chọn tốc độ khí .39  Khảo sát chiều cao đầu đốt 41 3.2.2.2 Quy trình thử 42 3.2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích bạc AAS 43  Tính thích hợp hệ thống .43  Độ đặc hiệu phƣơng pháp 44  Khoảng tuyến tính 47  Độ lặp lại .48  Độ .49 3.2.2.4 Định lƣợng bạc số sản phẩm .52 3.2.3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc 53 3.2.3.1 Chuẩn bị môi trƣờng dung dịch pha loãng 53 3.2.3.2 Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm .53 3.2.3.3 Tiến hành .54 3.2.3.4 Kết quả……………………………………… …………… .55 3.2.3.5 Dự kiến tiêu tác dụng diệt khuẩn dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc ppm .57 3.2.4 Dự thảo số tiêu kiểm nghiệm sản phẩm nghiên cứu 58 3.2.4.1 Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm .58 3.2.4.2 Dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc ppm .59 CHƢƠNG BÀN LUẬN .60 4.1 VỀ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG BẠC BẰNG AAS 60 4.2 VỀ XÁC ĐỊNH HÌNH DẠNG VÀ KÍCH THƢỚC TIỂU PHÂN NANO BẠC 61 4.3 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN………… ……………………62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AAS Quang phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic absorption spectroscopy) DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam, lần xuất thứ DLS Tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering) DNA 2’- deoxyribonucleic acid GLP Thực hành tốt phòng thí nghiệm (Good Laboratory Practice) ISO International Organization for Standardization MRSA Staphylococcus aureus kháng Methicillin MRSE Staphylococcus epidermidis kháng Methicillin PVP Polyvinylpyrrolidon SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscope) SPR Cộng hƣởng plasmon bề mặt (Surface Plasmon Resonance) TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) UV – VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) VSV Vi sinh vật WHO Tổ chức Y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Ký hiệu Tên bảng Trang Bảng 1.1 Số nguyên tử bạc đơn vị thể tích Bảng 2.2 Các mẫu nghiên cứu 23 Bảng 2.3 Công thức cho lít hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 23 Bảng 2.4 Công thức cho lít nƣớc súc miệng nano bạc ppm 23 Bảng 3.5 Kết kiểm nghiệm hình dạng kích thƣớc nano bạc 04 mẫu thử SEM Độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm, pha dung dịch acid nitric có nồng độ khác Độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm với độ rộng khe khác Độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm với tốc độ khí khác Độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm với chiều 36 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 38 39 40 41 cao đầu đốt khác Bảng 3.10 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 43 Bảng 3.11 Kết khảo sát khoảng tuyến tính 47 Bảng 3.12 48 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ lặp lại hỗn dịch nano bạc 1000 ppm Kết khảo sát độ lặp dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc ppm Kết khảo sát độ hỗn dịch nano bạc 1000 ppm Kết khảo sát độ dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc ppm Hàm lƣợng bạc mẫu nghiên cứu Bảng 3.17 Giới hạn nhiễm khuẩn mẫu 55 Bảng 3.18 Số lƣợng vi sinh vật hỗn dịch gốc 55 Bảng 3.19 Pha chế hỗn dịch làm việc 56 Bảng 3.20 Số lƣợng vi sinh vật sau tiếp xúc 30 giây với mẫu thử 56 Bảng 3.21 Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau tiếp xúc 30 giây với mẫu thử Dự thảo số tiêu hỗn dịch nano bạc 1000 57 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.22 49 51 52 53 58 S mutans ATCC 700610 S sanguinis ATCC 10556 C albicans ATCC 10231 Dung dịch AgNO3 nước súc miệng P aeruginosa ATCC 9027 S.aureus ATCC 6538 S mutans ATCC 700610 S sanguinis ATCC 10556 C albicans ATCC 10231 PHỤ LỤC 3: YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƢƠNG PHÁP THỬ CỦA CÁC CHẾ PHẨM NGHIÊN CỨU HỖN DỊCH NANO BẠC 1000 PPM I YÊU CẦU KỸ THUẬT Chỉ tiêu TT Tính chất Yêu cầu Hỗn dịch trong, màu vàng đậm - Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn phải dƣới 100nm Hình dạng kích thƣớc tiểu phân bạc - Tỷ lệ tiểu phân bạc có kích thƣớc 30-40nm phải không dƣới 90% - Tỷ lệ tiểu phân bạc có hình cầu phải đạt 90% Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ vạch phát xạ đặc Định tính trƣng nguyên tố Bạc bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn Định lƣợng Hàm lƣợng bạc chế phẩm phải đạt từ 95 đến 105% so với lƣợng ghi nhãn II PHƢƠNG PHÁP THỬ Tính chất Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu Hình dạng kích thƣớc tiểu phân bạc Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử hẹp quét bề mặt mẫu Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực ghi nhận phân tích xạ phát từ tƣơng tác chùm điện tử với bề mặt mẫu vật Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu đƣợc hình ảnh rõ nét tiểu phân bạc, để xác định kích thƣớc tiểu phân nhỏ nhất, lớn tỷ lệ tiểu phân hình cầu tổng số tiểu phân vi trƣờng Chuẩn bị mẫu  Đặt mẫu: Lấy khoảng 20 µl chế phẩm, nhỏ lên băng carbon đƣợc làm ethanol tuyệt đối, vừa nhỏ vừa sấy cho chế phẩm đƣợc dàn khô  Tạo màng dẫn điện: Phủ màng kim loại lên mẫu phƣơng pháp tạo màng phún xạ (sputtering) Sau đặt giá đỡ gắn mẫu vào buồng mẫu, dùng bơm hút chân không tới áp suất 0,1 Pa để loại bỏ nƣớc oxy Tiến hành trình phủ màng kim loại lên mặt mẫu, đƣa vào đo Tiến hành đo Gắn mẫu vào giá, lấy tiêu cự đo gia tốc kV đến kV với cƣờng độ dòng điện 10 µA Điều chỉnh độ phóng đại thích hợp để chụp ảnh tiểu phân nano bạc, chỉnh cho ảnh rõ nét nhất, tiến hành chụp ghi lại ảnh Đánh giá Chọn vị trí, vị trí khoảng μm2, điểm ảnh hình Xử lý để thu kết sau: - Tỷ lệ tiểu phân hình cầu: Đếm tổng số tiểu phân số lƣợng tiểu phân hình cầu vị trí quan sát Tính tỷ lệ trung bình tiểu phân hình cầu so với tổng số tiểu phân vị trí - Kích thƣớc tiểu phân bạc: Đo kích thƣớc tiểu phân lớn nhất, tiểu phân nhỏ kích thƣớc (một cách tƣơng đối) đa số tiểu phân vi trƣờng theo thƣớc đo ảnh Định tính: Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - Chuẩn bị dung dịch thử có nồng độ khoảng ppm - Chuẩn bị dung dịch bạc chuẩn có nồng độ ppm - Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm dung dịch thử điều kiện nhƣ mô tả phần định lƣợng - Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ vạch phát xạ đặc trƣng nguyên tố Bạc bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn Định lƣợng: Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Điều kiện đo: - Đèn cathod rỗng Ag - Cƣờng độ đèn 4,0 mA - Bƣớc sóng 328,1 nm - Độ rộng khe: 0,4 nm - Loại lửa: Acetylen – không khí nén - Tốc độ khí acetylen: 1,0 ml/phút - Chiều cao đầu đốt: 7,5 mm Quy trình thử  Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Hút xác 5,0 ml dung dịch bạc chuẩn gốc 1000 ppm vào bình định mức 100,0 ml Thêm dung dịch acid nitric 1,0% đến vừa đủ, lắc đều, thu đƣợc dung dịch bạc chuẩn 50 ppm Hút xác nh ng thể tích dung dịch bạc chuẩn 50 ppm vào bình định mức pha loãng dung dịch acid nitric 1% đến vừa đủ để thu đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ bạc 0,5 ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 4,0 ppm 5,0 ppm  Chuẩn bị dung dịch thử Hút xác 5,0 ml hỗn dịch nano bạc 1000 ppm vào bình định mức 100,0 ml Thêm 10 ml dung dịch acid nitric 10% lắc đều, đun cách thủy 10 phút, để nguội, thêm nƣớc trao đổi ion vừa đủ đến vạch thu đƣợc dung dịch bạc cỡ 50 ppm Pha loãng dung dịch acid nitric 1% để đƣợc dung dịch có nồng độ bạc cỡ 2,0 ppm  Cách đo - Khởi động hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử - Mở đƣờng nƣớc, mở van khí - Bật đèn, để ổn định đèn 15 phút - Bật lửa - Khi tín hiệu đƣờng ổn định, tiến hành đo dung dịch chuẩn, từ nồng độ thấp tới nồng độ cao, đo dung dịch thử theo thông số đƣa mục khảo sát điều kiện đo Dựng đƣờng chuẩn thực nghiệm biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ nồng độ bạc dãy chuẩn Nồng độ bạc dung dịch thử đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn  Cách tính toán kết Hàm lƣợng (%) bạc so với lƣợng ghi nhãn đƣợc tính theo công thức: C×f × 100 X (%) = V×A đó: C: Nồng độ chế phẩm suy từ đƣờng chuẩn (ppm) f: Hệ số pha loãng mẫu thử V: Thể tích mẫu thử đem pha loãng (ml) A: Nồng độ nhãn chế phẩm (ppm) DUNG DỊCH NƢỚC SÚC MIỆNG NANO BẠC PPM I YÊU CẦU KỸ THUẬT TT Chỉ tiêu Tính chất Yêu cầu Dung dịch trong, màu xanh dƣơng - Kích thƣớc tiểu phân bạc lớn phải dƣới 100nm Hình dạng kích thƣớc tiểu phân bạc - Tỷ lệ tiểu phân bạc có kích thƣớc 30-40nm phải không dƣới 90% - Tỷ lệ tiểu phân bạc có hình cầu phải đạt 90% Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ vạch phát xạ đặc Định tính trƣng nguyên tố Bạc bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn Định lƣợng Tác dụng diệt khuẩn Hàm lƣợng bạc chế phẩm phải đạt từ 90 đến 110% so với lƣợng ghi nhãn Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc với mẫu thử phải không dƣới 99,95% II PHƢƠNG PHÁP THỬ Tính chất Bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu Hình dạng kích thƣớc tiểu phân bạc Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử hẹp quét bề mặt mẫu Việc tạo ảnh mẫu vật đƣợc thực ghi nhận phân tích xạ phát từ tƣơng tác chùm điện tử với bề mặt mẫu vật Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu đƣợc hình ảnh rõ nét tiểu phân bạc, để xác định kích thƣớc tiểu phân nhỏ nhất, lớn tỷ lệ tiểu phân hình cầu tổng số tiểu phân vi trƣờng Chuẩn bị mẫu  Đặt mẫu: Lấy khoảng 20 µl chế phẩm, nhỏ lên băng carbon đƣợc làm ethanol tuyệt đối, vừa nhỏ vừa sấy cho chế phẩm đƣợc dàn khô  Tạo màng dẫn điện: Phủ màng kim loại lên mẫu phƣơng pháp tạo màng phún xạ (sputtering) Sau đặt giá đỡ gắn mẫu vào buồng mẫu, dùng bơm hút chân không tới áp suất 0,1 Pa để loại bỏ nƣớc oxy Tiến hành trình phủ màng kim loại lên mặt mẫu, đƣa vào đo Tiến hành đo Gắn mẫu vào giá, lấy tiêu cự đo gia tốc kV đến kV với cƣờng độ dòng điện 10 µA Điều chỉnh độ phóng đại thích hợp để chụp ảnh tiểu phân nano bạc, chỉnh cho ảnh rõ nét nhất, tiến hành chụp ghi lại ảnh Đánh giá Chọn vị trí, vị trí khoảng μm2, điểm ảnh hình Xử lý để thu kết sau: - Tỷ lệ tiểu phân hình cầu: Đếm tổng số tiểu phân số lƣợng tiểu phân hình cầu vị trí quan sát Tính tỷ lệ trung bình tiểu phân hình cầu so với tổng số tiểu phân vị trí - Kích thƣớc tiểu phân bạc: Đo kích thƣớc tiểu phân lớn nhất, tiểu phân nhỏ kích thƣớc (một cách tƣơng đối) đa số tiểu phân vi trƣờng theo thƣớc đo ảnh Định tính: Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - Chuẩn bị dung dịch thử có nồng độ khoảng ppm - Chuẩn bị dung dịch bạc chuẩn có nồng độ ppm - Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch bạc chuẩn ppm dung dịch thử điều kiện nhƣ mô tả phần định lƣợng - Dung dịch thử phải cho độ hấp thụ vạch phát xạ đặc trƣng nguyên tố Bạc bƣớc sóng 328,1 nm tƣơng ứng với dung dịch chuẩn Định lƣợng: Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử Điều kiện đo: - Đèn cathod rỗng Ag - Cƣờng độ đèn 4,0 mA - Bƣớc sóng 328,1 nm - Độ rộng khe: 0,4 nm - Loại lửa: Acetylen – không khí nén - Tốc độ khí acetylen: 1,0 ml/phút - Chiều cao đầu đốt: 7,5 mm Quy trình thử  Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn Hút xác 5,0 ml dung dịch bạc chuẩn gốc 1000 ppm vào bình định mức 100,0 ml Thêm dung dịch acid nitric 1,0% đến vừa đủ, lắc đều, thu đƣợc dung dịch bạc chuẩn 50 ppm Hút xác nh ng thể tích dung dịch bạc chuẩn 50 ppm vào bình định mức pha loãng dung dịch acid nitric 1% đến vừa đủ để thu đƣợc dãy dung dịch chuẩn có nồng độ bạc 0,5 ppm; 1,0 ppm; 2,0 ppm; 3,0 ppm; 4,0 ppm 5,0 ppm  Chuẩn bị dung dịch thử Hút xác 10,0 ml dung dịch nƣớc súc miệng nano bạc ppm vào bình định mức 25,0 ml, thêm 2,5 ml dung dịch HNO3 10%, đun cách thủy 30 phút, để nguội, thêm nƣớc trao đổi ion vừa đủ để thu đƣợc dung dịch bạc cỡ ppm  Cách đo - Khởi động hệ thống máy quang phổ hấp thụ nguyên tử - Mở đƣờng nƣớc, mở van khí - Bật đèn, để ổn định đèn 15 phút - Bật lửa - Khi tín hiệu đƣờng ổn định, tiến hành đo dung dịch chuẩn, từ nồng độ thấp tới nồng độ cao, đo dung dịch thử theo thông số đƣa mục khảo sát điều kiện đo Dựng đƣờng chuẩn thực nghiệm biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ nồng độ bạc dãy chuẩn Nồng độ bạc dung dịch thử đƣợc tính toán dựa vào đƣờng chuẩn  Cách tính toán kết Hàm lƣợng (%) bạc so với lƣợng ghi nhãn đƣợc tính theo công thức: C×f × 100 X (%) = V×A đó: C: Nồng độ chế phẩm suy từ đƣờng chuẩn (ppm) f: Hệ số pha loãng mẫu thử V: Thể tích mẫu thử đem pha loãng (ml) A: Nồng độ nhãn chế phẩm (ppm) Tác dụng diệt khuẩn Chuẩn bị môi trường dung dịch pha loãng  Môi trường thạch Casein đậu tương (Soyabean Casein Digest Agar) Casein thủy phân pancreatin 15,0 g Đậu tƣơng thủy phân 5,0 g NaCl 5,0 g Nƣớc 1000 ml pH 7,3 ± 0,2  Môi trường thạch Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar) Dextrose 40,0 g Hỗn hợp Pepton đậu tƣơng thủy phân pancreatin (1:1) 5,0 g Thạch 15,0 g Nƣớc 1000 ml pH 5,6 ± 0,2  Độ đục chuẩn McFarland số Hút xác 2,0 ml dung dịch bari clorid 0,048 M vào bình định mức dung tích 100 ml Pha loãng dung dịch acid sulfuric 0,18 M vừa đủ đến vạch, trộn Độ hấp phụ độ đục chuẩn số đo bƣớc sóng 625 nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18 M làm mẫu trắng, phải nằm khoảng 0,32 - 0,40 Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm  Các chủng vi sinh vật thử nghiệm: Vi khuẩn: - Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 - Staphylococcus aureus ATCC 6538 - Streptococcus mutans ATCC 700610 - Streptococcus sanguinis ATCC 10556 Vi nấm: - Candida albicans ATCC 10231  Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật gốc: Tăng sinh chủng vi khuẩn môi trƣờng thạch casein đậu tƣơng vô khuẩn, ủ 32 đến 35oC 24 h Đối với vi nấm, tăng sinh môi trƣờng thạch Sabouraud, ủ 20 đến 25oC 48 h Sau thời gian ủ, cho vào ống môi trƣờng ml nƣớc muối sinh lý vô khuẩn, rửa bề mặt thạch, tập trung dịch rửa vào bình chứa vô khuẩn Pha loãng dung dịch chủng thu đƣợc nƣớc muối sinh lý so sánh với độ đục chuẩn McFarland số để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật gốc có nồng độ khoảng 6×108 CFU/ml Hỗn dịch gốc đƣợc bảo quản từ – ºC sử dụng vòng 24 h sau gặt Đếm số lƣợng tế bào sống hỗn dịch vi sinh vật gốc phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV)  Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật làm việc: Dựa vào kết đếm số lƣợng vi sinh vật hỗn dịch gốc, dùng dung dịch nƣớc muối sinh lý pha loãng hỗn dịch gốc để đƣợc hỗn dịch vi sinh vật làm việc có nồng độ vi sinh vật từ 107 đến 108 CFU/ml Tiến hành Hút 10 ml chế phẩm vào ống nghiệm vô trùng Cấy vào ống nghiệm hỗn dịch làm việc loại vi sinh vật thử nghiệm, trộn Thể tích hỗn dịch chủng vi sinh vật làm việc chiếm 1,0 % thể tích mẫu Xác định số lƣợng vi sinh vật thời điểm 30 giây sau vi sinh vật tiếp xúc với mẫu phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mô tả chuyên luận 13.6 (Thử giới hạn nhiễm khuẩn, DĐVN IV) Song song xác định lại số lƣợng vi sinh vật hỗn dịch vi sinh vật làm việc phƣơng pháp đĩa thạch nhƣ mẫu thử Đánh giá kết Xác định số lƣợng vi sinh vật thời điểm bắt đầu thử nghiệm (R0) thời điểm sau 30 giây tiếp xúc với chế phẩm (Rt) Tính lƣợng giảm vi sinh vật thị thời điểm Rt: R (CFU/ml) = Ro - Rt Tính phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau 30 giây tiếp xúc công thức: R × 100/ R0 ... pháp đánh giá tác dụng diệt khuẩn chúng Để góp phần đánh giá chất lƣợng nh ng sản phẩm này, đề tài: Nghiên cứu xây dựng số tiêu kiểm nghiệm đánh giá tác dụng diệt khuẩn số sản phẩm nano bạc ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VÕ VIẾT HÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA MỘT SỐ SẢN PHẨM NANO BẠC LUẬN... tiêu sau: Xây dựng thẩm định số tiêu kiểm nghiệm số sản phẩm có chứa nano bạc (hỗn dịch nano bạc 1000 ppm dung dịch nước súc miệng nano bạc ppm) Áp dụng để kiểm nghiệm sản phẩm có chứa nano bạc