BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỊNH ANH VIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI ARDISIA THUỘC HỌ MYRSINACEAE Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỊNH ANH VIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI ARDISIA THUỘC HỌ MYRSINACEAE Ở VIỆT NAM Chuyên ngành : Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số : 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Phạm Quốc Long TS Nguyễn Thị Hồng Vân Hà Nội, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án công trình nghiên cứu riêng dƣới hƣớng dẫn khoa học GS.TS Phạm Quốc Long TS Nguyễn Thị Hồng Vân Các kết Luận án trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khoa học khác Nghiên cứu sinh Trịnh Anh Viên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Quốc Long TS Nguyễn Thị Hồng Vân – ngƣời Thầy giao đề tài hƣớng dẫn tận tình suốt trình thực Luận án Tôi xin chân chân thành cảm ơn Lãnh đạo, tập thể cán Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo, tập thể Thầy, Cô, nhà khoa học Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giảng dạy, hƣớng dẫn tạo điều kiện cho hoàn thành học phần, chuyên đề làm thực nghiệm suốt trình học tập, nghiên cứu Viện Tôi xin chân thành cảm ơn anh, chị, em công tác phòng Hóa sinh Nông nghiệp Tinh dầu - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, chân thành, nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi suốt trình làm thực nghiệm học tập phòng Tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Quốc Bình – Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đở trình thu thập mẫu thực vật giám định tên khoa học Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Lãnh đạo Trƣờng đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho trình nghiên cứu công tác Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, đồng nghiệp, bạn bè hỗ trợ, động viên suốt trình học tập thực Luận án Luận án đƣợc thực với tài trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số đề tài 104.01-2011.20 TS Nguyễn Thị Hồng Vân làm chủ nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Trịnh Anh Viên MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT I DANH MỤC BẢNG .III DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC PHỤ LỤC IX MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm hình thái phân loại họ Đơn nem (Myrsinacea) chi Ardisia Việt Nam 1.1.1 Họ Đơn nem (Myrsinacea) .3 1.1.2 Chi Ardisia 1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chung chi Ardisia 1.1.2.2 Các loài Ardisia phân bố Việt Nam .4 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia giới .14 1.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học chi Ardisia giới 14 1.2.1.1 Các hợp chất có khung tritecpen saponin 14 1.2.1.2 Các hợp chất có khung quinone .20 1.2.1.3 Các hợp chất có khung alkylphenol .23 1.2.1.4 Các hợp chất có khung isocoumarin .25 1.2.1.5 Các hợp chất có khung resorcinol 27 1.2.1.6 Các hợp chất có khung flavonoid 29 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Ardisia giới 31 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia Việt Nam 37 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 40 2.1.1 Mẫu thực vật 40 2.1.2 Một số đặc điểm thực vật loài Ardisia đƣợc nghiên cứu thành phần hóa học khuôn khổ luận án 41 2.1.2.1 Ardisia balansana Yang – Cơm nguội banlansa 41 2.1.2.2 Ardisia splendens Pit – Cơm nguội rạng 41 2.1.2.3 Ardisia insularis Mez – Cơm nguội đảo 41 2.1.2.4 Ardisia incarnata Pit – Cơm nguội thắm 41 2.1.3 Hình ảnh mẫu thực vật 42 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Phƣơng pháp xử lý chiết mẫu 42 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập hợp chất từ mẫu 43 2.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 43 2.2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 43 2.2.2.3 Sắc ký cột (CC) 43 2.2.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học 44 2.2.4 Các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học .44 2.2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 44 2.2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi rút 45 2.2.4.3 Phƣơng pháp thử độ độc tế bào in vitro 46 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 48 3.1 Sàng lọc đối tƣợng nghiên cứu theo định hƣớng hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn gây độc tế bào .48 3.1.1 Xử lý mẫu, tạo cao chiết metanol tổng 48 3.1.2 Các mẫu cao chiết ký hiệu 48 3.2 Chiết tách, phân lập hợp chất 49 3.2.1 Chiết tách, phân lập hợp chất từ rễ A balansana 49 3.2.1.1 Xử lý mẫu từ rễ A balansana 49 3.2.1.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc từ rễ A balansana 51 3.2.2 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A splendens 53 3.2.2.1 Xử lý mẫu A splendens .53 3.2.2.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc từ A splendens 55 3.2.3 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A insularis 58 3.2.3.1 Xử lý mẫu A insularis 58 3.2.3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập đƣợc từ A insularis 61 3.2.4 Chiết tách, phân lập hợp chất từ A incarnata .64 3.2.4.1 Xử lý mẫu A incarnata 64 3.2.4.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ A incarnata 66 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 4.1 Kết sàng lọc hoạt tính cao chiết metanol tổng 68 4.1.1 Kết sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 68 4.1.2 Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào cao metanol tổng .68 4.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất đƣợc phân lập 69 4.2.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ rễ cơm nguội balansa (A balansana) 69 4.2.1.1 Hợp chất AB-1 (angelicoidenol) 70 4.2.1.2 Hợp chất AB-2 (axit gallic) .71 4.2.1.3 Hợp chất AB-3 (metyl gallat) 72 4.2.1.4 Hợp chất AB-4 (quercetin) 73 4.2.1.5 Hợp chất AB-5 (myricitrin) 75 4.2.1.6 Hợp chất AB-6 (rutin) 76 4.2.2 Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập đƣợc từ cơm nguội rạng (A splendens) 79 4.2.2.1 Hợp chất AS-1 (myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside) 79 4.2.2.2 Hợp chất AS-2 (myricitrin) 84 4.2.2.3 Hợp chất AS-3 (desmanthin-1) 84 4.2.2.4 Hợp chất AS-4 (myricetin 3-O-(3"-O-galloyl)-α-L- rhamnopyranoside) 86 4.2.2.5 Hợp chất AS-5 (quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside) 88 4.2.2.6 Hợp chất AS-6 (quercetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside) 89 4.2.2.7 Hợp chất AS-7 (catechin) 91 4.2.2.8 Hợp chất AS-8 (benzyl O-β-D-glucopyranoside) .92 4.2.2.9 Hợp chất AS-9 (2-phenylethyl O-β-D-glucopyranoside) 94 4.2.2.10 Hợp chất AS-10 (3S, 5R, 6R, 9S-tetrahydroxymegastigman-7- ene) 95 4.2.2.11 Hợp chất AS-11 (corilagin) 96 4.2.2.12 Hợp chất AS-12 ((2S)-3-O-(9,12,15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-Dgalactopyranoside) 98 4.2.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ cơm nguội đảo (A.insularis) 101 4.2.3.1 Hợp chất AI-1 (ardinsuloside)………………… …………………… 101 4.2.3.2 Hợp chất AI-2 (bergenin) 109 4.2.3.3 Hợp chất AI-3 (norbergenin)……………………………… ………… 111 4.2.3.4 Hợp chất AI-4 (demethoxybergenin) .111 4.2.3.5 Hợp chất AI-5 (4-O-galloylbergenin) 113 4.2.3.6 Hợp chất AI-6 (myricitrin) .114 4.2.3.7 Hợp chất AI-7 (myricetin 3-O-(3''-O-galloyl)-α-L- rhamnopyranoside) .114 4.2.3.8 Hợp chất AI-8 (desmathine-2) 114 4.2.3.9 Hợp chất AI-9 (quercetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside)……….… …… 116 4.2.3.10 Hợp chất AI-10 (3-O-galloylepicatechin)………………… ……….…116 4.2.3.11 Hợp chất AI-11 (3-O-galloyl-3'-methoxyepicatechin)………… …… 118 4.2.3.12 Hợp chất AI-12 (axit gallic)………………………… ……………… 119 4.2.3.13 Hợp chất AI-13 (metyl gallat)……………………… …………… .119 4.2.3.14 Hợp chất AI-14 ((3S, 5R, 6R, 7E, 9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3O-β-D-glucopyranoside)……………………… ……………………………… 120 4.2.4 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ cơm nguội thắm (Ardisia incarnata) 122 4.2.4.1 Hợp chất AInc-1 (myricitrin) 122 4.2.4.2 Hợp chất AInc-2 (quercitrin) 122 4.2.4.3 Hợp chất AInc-3 (afzeline) .123 4.2.4.4 Hợp chất AInc-4 (3S, 5R, 6R, 9S-tetrahydroxymegastigman-7- ene ) 124 4.2.4.5 Hợp chất AInc-5 ((3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-Oβ-D-glucopyranoside) 124 4.2.4.6 Hợp chất AInc-6 ((2S)-3-O-(9, 12, 15-octadecatrienoyl)-glyceryl-β-D- galactopyranoside) 125 4.2.4.7 Hợp chất AInc-7 (angelicoidenol) 125 4.2.4.8 Hợp chất AInc-8 (axit gallic) 125 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập đƣợc…….… … 131 4.3.1 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 131 4.3.2 Hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 131 4.3.3 Hoạt tính gây độc tế bào .133 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 135 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 138 TÀI LIỆU THAM KHẢO .140 I DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân H-NMR Proton Magnetic Resonance spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tƣơng tác dị hạt nhân trực tiếp H→C COSY Corrrlated Spectroscopy Phổ COSY NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectra Phổ khối lƣợng ion hóa phun mù điện tử TMS Tetramethylsilane DMSO Dimethyl sulfoxide 13 C-NMR STT Số thứ tự MeOH Methanol EtOAc Ethylacetate EC50 Effective Concentration at 50% Nồng độ gây tác động sinh học cho 50% đối tƣợng thử nghiệm IC50 Inhibitory Concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử nghiệm MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu SRB Sulforhodamine B TCA Tricloacetic acid Axit tricloaxetic DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium Môi trƣờng nuôi cấy tế bào CS% Cell survival % % tế bào sống sót PL75 Phụ lục 29.3 Phổ DEPT hợp chất AI-13 Phụ lục 29.4 Phổ HSQC hợp chất AI-13 PL76 Phụ lục 30 Các phổ (3S,5R,6R,7E,9S)-megastigman-7-ene-3,5,6,9-tetrol 3-O-βD-glucopyranoside (AI-14) Phụ lục 30.1 Phổ 1H-NMR hợp chất AI-14 Phụ lục 30.2 Phổ 13C-NMR hợp chất AI-14 PL77 Phụ lục 30.3 Phổ HMBC hợp chất AI-14 Phụ lục 30.4 Phổ COSY hợp chất AI-14 PL78 Phụ lục 30.5 Phổ HSQC hợp chất AI-14 PL79 Phụ lục 31 Các phổ quercitrin (AInc-2) Phụ lục 31.1 Phổ 1H-NMR hợp chất AInc-2 Phụ lục 31.2 Phổ 13C-NMR hợp chất AInc-2 PL80 Phụ lục 30.3 Phổ HMBC hợp chất AInc-2 Phụ lục 30.4 Phổ HSQC hợp chất AInc-2 PL81 Phụ lục 32 Các phổ afzaline (AInc-3) Phụ lục 32.1 Phổ 1H-NMR hợp chất AInc-3 Phụ lục 32.2 Phổ 13C-NMR hợp chất AInc-3 PL82 Phụ lục 32.3 Phổ DEPT hợp chất AInc-3 Phụ lục 32.4 Phổ HMBC hợp chất AInc-3 PL83 Phụ lục 32.5 Phổ HSQC hợp chất AInc-3 PL84 Phụ lục 33 Các phổ dãn Myricetin 3,7-di-O-α-L-rhamnopyranoside (AS-1) Phụ lục 33.1 Phổ 1H-NMR dãn hợp chất AS-1 Phụ lục 33.2 Phổ 13C-NMR dãn hợp chất AS-1 PL85 Phụ lục 33.3 Phổ HMBC dãn hợp chất AS-1 Phụ lục 33.4 Phổ HSQC dãn hợp chất AS-1 PL86 Phụ lục 34 Các phổ dãn Ardinsuloside (AI-1) Phụ lục 34.1.a Phổ 1H-NMR dãn hợp chất AI-1 Phụ lục 34.1.b Phổ 1H-NMR dãn hợp chất AI-1 PL87 Phụ lục 34.2.a Phổ 13C-NMR hợp chất AI-1 Phụ lục 34.2.b Phổ 13C-NMR dãn hợp chất AI-1 PL88 Phụ lục 34.3.a Phổ HMBC dãn hợp chất AI-1 Phụ lục 34.3.b Phổ HMBC dãn hợp chất AI-1 PL89 Phụ lục 34.4.a Phổ HSQC dãn hợp chất AI-1 Phụ lục 34.4.b Phổ HSQC dãn hợp chất AI-1 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỊNH ANH VIÊN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ LOÀI ARDISIA THUỘC HỌ MYRSINACEAE. .. chi Cơm nguội (Ardisia) , họ Đơn nem (Myrsinaceae) làm đối tƣợng nghiên cứu cho đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae Việt Nam 2 Mục tiêu... hình nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Ardisia giới 31 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Ardisia Việt Nam 37 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG