MỞ ĐẦU Từ xa xưa, Cordyceps spp hay Đông trùng hạ thảo biết đến loại dược liệu quý sử dụng y học Trong Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis, Cordyceps militariss, Cordyceps takaomontana… có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị cao adenosine, cordycepin, cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy – Ethyl – Adenosine – Analogs)… với nhiều tác dụng tăng cường khả miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị hen viêm phế quản, giảm khả suy thoái thận, kháng viêm, tiêu viêm, ức chế nhiều loại vi sinh vật có hại có vi khuẩn lao… Không sử dụng dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo dùng làm thực phẩm chức hỗ trợ điều trị số bệnh có ung thư nâng cao sức khỏe Hiện nay, thị trường Việt Nam lưu hành số sản phẩm Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana đến từ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản chủ yếu từ Trung Quốc Trên thực tế, Cordyceps sinensis phân bố đặc thù Tây Tạng, việc nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo chưa hiệu quả, nguồn sản phẩm khai thác từ tự nhiên nên giá thành cao Cordyceps militaris nghiên cứu nuôi nhân tạo quy mô lớn số nước Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc… Việt Nam tiến hành nhân nuôi quy mô nhỏ, nhiên chưa chủ động nguồn giống, phụ thuộc vào nước ngoài, nên bị động khó kiểm soát chất lượng giống sản phẩm tạo Trong đó, nghiên cứu cho thấy, Cordyceps takaomontana có chứa hợp chất sinh học quý Cordyceps militaris Cordyceps sinensis hàm lượng thấp Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol có Cordyceps takaomontana có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50 mức ng/ml [13, 26] mạnh so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ đến 6,6 lần [33] beauvericin với 12 tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư u ác tính người với liều lượng gây độc khác nhau, kháng 10 loại vi khuẩn gram dương loại vi khuẩn gram âm gây bệnh người [42] Tại Việt Nam, Phạm Quang Thu cộng (2009, 2010) phát Cordyceps takaomona vườn quốc gia Tam Đảo Còn khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, Nghệ An thu thập 29 mẫu, có Cordyceps takaomontana số loài có hoạt tính sinh học cao Cordycepssp2., Ophiocordyceps unilateralis…[58] Tại Vườn Quốc gia Pù Mát, Trần Ngọc Lân cộng (2008) xác định 200 mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi Cordyceps takaomontana có 11 loài, Isaria tenuipes (thể vô tính Cordyceps takaomontana) loài phổ biến Như vậy, nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana Việt Nam phong phú, khai thác nên chủ động nguồn giống Ngoài ra, kỹ thuật nhân nuôi không khắt khe, nguồn nguyên liệu đầu vào cho nghiên cứu sản xuất loại nấm Việt Nam gạo, nhộng tằm dồi Do đó, việc nghiên cứu khai thác, phát triển nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana tạo thể chứa hoạt chất sinh học có Beauvericin, để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược có tính khả thi, có ý nghĩa khoa học giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng đặt sở cho phát triển số ngành nghề mới, đầy tiềm Vì vậy, tiến hành thực đề tài: ―Nghiên cứu thu nhận Beauvericin từ Cordyceps spp thăm dò khả ức chế tế bào ung thƣ’’ Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn chủng Cordcyeps spp tìm điều kiện thích hợp cho tạo thể sinh hoạt chất sinh học Beauvericin có khả ức chế tế bào ung thư Nội dung nghiên cứu - Thu thập, phân lập, tuyển chọn định tên chủng Cordyceps spp có khả tạo thể - Lựa chọn môi trường hoạt hóa giống thạch môi trường lỏng - Nghiên cứu môi trường điều kiện nuôi thích hợp cho việc tạo thể sinh hoạt chất Beauvericin - Thử nghiệm đánh giá khả ức chế tế bào ung thư Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm Cordyceps spp 1.1.1 Giới thiệu Cordyceps spp Cordyceps spp loại nấm túi, nhà khoa học Trung Quốc phát lần Cao nguyên Tây Tạng Trung Quốc, loại dược liệu thực chất tượng sâu non (ấu trùng) loài côn trùng thuộc chi Thiarodes Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.ký sinh Thường gặp sâu non loài Thiatarodes baimaensis Thiarodes armoricanus, 46 loài khác thuộc chi Thitarodes bị Cordyceps sinensis ký sinh Theo số tài liệu, vào cuối mùa thu, đầu mùa đông bào tử dính vào da sâu non (ấu trùng), phát triển sâu non tạo sợi nấm, sợi nấm ăn sâu vào ấu trùng, sử dụng dinh dưỡng sâu non làm chất dinh dưỡng để phát triển Đến đầu mùa hạ, nấm phát triển mạnh, gây chết sâu sau chúng hình thành chồi, phát triển cao nhô lên khỏi mặt đất, gốc dính vào đầu sâu Vì vậy, dân gian thường gọi Nấm Cordyceps spp Đông Trùng Hạ Thảo, Nhộng trùng Thảo hay Đông trùng [55, 56, 60, 62] Theo Holiday (2004), Cordyceps spp phân loại theo hệ thống phân loại sau: Giới: Nấm (Fungi) Ngành: Ascomycota Lớp: Ascomycotes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Chi: Cordyceps Cordyceps spp loại nấm dược liệu quan trọng sử dụng rộng rãi y học truyền thống, đặc biệt Y học cổ truyển Trung Hoa Các nhà khoa học cho chi Cordyceps có gần 400 loài khác nhau, tính riêng Trung Quốc tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis, Zhang, C Shanxiensis Liu…Ngoài ra, có chủng Cordyceps Militaris, Cordyceps nutans Pat, C.tricentri Yasuda, C.gunnii Berk Tuy nhiên nay, nước giới, nghiên cứu đưa vào nuôi trồng nhân tạo số loại nấm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana…, loài nấm phân bố rộng cao nguyên Tây Tạng Trung Quốc, Bhutan Nepal, Vùng Đông Bắc Ấn Độ, độ cao 3500 – 5000 so với mặt nước biển Theo số nghiên cứu cho thấy, chủng nấm Cordyceps khác tìm thấy Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam [21, 47] Hình 1.1: Nấm Cordyceps sinensis tự nhiên (Nguồn Mycotherapie.nl) Theo sách y học cổ truyền, chủng nấm thuộc lớp Ascomycestes sống ký sinh vật chủ sâu non loài bướm (Caterpilar) họ cánh vẩy, đặc biệt, loài bướm đêm Hepialus armoricanus Loài bướm đẻ trứng, trứng nở thành ấu trùng, thành sâu non Mùa đông, sâu non chui xuống đất sinh sống Trong môi trường ẩm, bào tử nấm Ascomycestes thể sâu non, gặp điều kiện thích hợp nảy mầm phát triển thân sâu chuyển thành dạng sợi nấm Ban đầu, hệ sợi có màu trắng, dạng mảnh, dần sau, chúng phát triển nhanh thành khối dày, chắc, số biến thành màu vàng đậm nâu, số phát triển thành màu hồng nhạt, đến màu cam.Và nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, hệ sợi nấm nhanh chóng trở nên tối màu giống màu bùn từ 30 đên 60 ngày, toàn thân sâu lớp bọc bao sợi nấm Khi mùa hè đến, từ miệng sâu mọc cuống nấm, nhô lên khỏi mặt đất, cuống nấm phình ra, bề mặt cuống có mầm nhọn Các mầm nhọn nảy số hạt tròn, chứa bào tử nấm.Thân cao gần 10 cm Khi đào lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm dính liền với đầu xác sâu Ấu trùng bướm dài khoảng đến cm, dày 0.4 – 0.7 cm, sắc nâu vàng, ấu trùng với nhiều vạch ngang Sâu có cặp chân cụp khúc bụng cặp chân khác dài khúc Cắt ngang sâu, thịt sâu ruôt màu trắng ngả vàng, xung quanh có màu vàng sẫm hơn.Cây nấm mọc từ miệng sâu có đầu hình chùy chồi thuôn nhỏ lại Cây màu nâu, đen sẫm lại, dài khoảng dến cm, đường kính khoảng 0,3 cm 1.1.2 Chu trình sống chế xâm nhiễm Hàng năm, việc tìm Đông trùng hạ thảo tự nhiên từ vùng núi cao, thường diễn mùa hè Điều đặt mà người dân lại tìm vào mùa hè mà mùa khác? Câu trả lời đưa dựa vào vòng đời phát triển Cordyceps spp Hình 1.2: Cơ chế xâm nhiễm nấm Cordcyeps spp.vào côn trùng Côn trùng sau biến đổi thành ngài, chúng để trứng vào đất, sau trứng phát triển thành sâu non Vào mùa đông, sâu non sâu trưởng thành số loài nấm đất mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm sử dụng trực tiếp dinh dưỡng từ thể trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn này, nhiệt độ độ ẩm không khí thấp, nấm ký sinh dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ độ ẩm không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn hình thành thể nhú lên khỏi mặt đất, gốc dính liền thân sâu Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải giai đoạn khác Giai đoạn xâm nhập, bào tử nấm mọc mầm đến lúc kết thúc việc xâm nhập vào thể côn trùng Bào tử nấm sau mọc mầm, phát sinh mầm bệnh, giải phóng enzyme ngoại bào tương ứng với thành phần lớp vỏ cuticun côn trùng để phân hủy lớp vỏ protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase Các enzyme tạo cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác loài loài Enyzm protease chitinase hình thành thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) lớp biểu bì (thành phần protein) Quan trọng enzyme phân hủy protein (protease) enzyme phân hủy chitin (chitinase) côn trùng Hai enzyme có liên quan trực tiếp đến hiệu diệt côn trùng nấm ký sinh côn trùng [2] Giai đoạn tiếp theo, giai đoạn sống ký sinh nấm Hệ sợ nấm khoang thể tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi hình thành thể, phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả hô hấp ấu trùng khiến hoạt đông côn trùng trở nên chậm chạp phản ứng với tác nhân kích thích bên Kết làm vật chủ khả kiếm soát hoạt động sống dẫn đến chết [41] Giai đoạn cuối cùng, giai đoạn phát triển sau vật chủ chết, sợi nấm phát triển nhanh tiết độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch côn trùng.Trong giai đoạn gây độc vật chủ, số loài nấm giết chết vật chủ trước gây độc toàn thể côn trùng [6] 1.2 Tình hình nghiên cứu Cordyceps spp giới 1.2.1 Sự dạng phân bố Cordyceps spp có 400 loài khác theo hệ thống phân loại truyền thống loài xếp vào họ Clavicipitaceae Dựa đặc điểm hình thái đặc điểm cấu trúc phân tử, chúng xếp 162 đơn vị phân loại (Sung et al 2007) Cordyceps spp phân bố nước thuộc châu Á Trung Quốc, Nhật bản, Hàn Quốc, Thái Lan Việt Nam [21, 47] Mao X.L (2000) mô tả đặc điểm hình thái, công dụng ảnh minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố Trung Quốc, loài : Cordyceps barnesii Thwaites, Cordyceps capiata (Holmsk;Fk) Link, C.crassiora Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.hawkesii Gray, Cordyceps kyushensis Kobayasi, C.martialis Gray, C.militaris Link, C nutans Pat, C.ophoglossoides (Ehrenb) Link, C sinensis (Beck) Sacc, C sobolifera (Hill).Berk , C.tubeculata (Leb), Maire [30] Hình 1.3: Nấm Cordyceps sobolifera tự nhiên (nguồn http://blog.goo.ne.jp) Sung Jae Mo (2000) mô tả đặc điểm hình thái 25 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố Hàn Quốc, bao gồm loài sau: C.adaesanensis, C.agriota Kawamura, C.bifisispora, C.crassispora, C.discoideocapiata, C.formicarum, C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda, C.ishikariensis, C,kyushuensis, C martialis, C.militaris, C.nutans, C.ochraceostroma, C.ophoglossoides, C.oxycepphala, C.pentatoni, C.pruinosa, C.resea, C.scarabaeicola, C.sinensis, C.sphecocephala, C.tricentri, C.yongmoones [49] Hình 1.4: Chủng nấm Cordyceps gunnii tự nhiên (Nguồn Australianfungi) Tại Nhật Bản, Tsuguo Hongo Masana Izawa (1994) mô tả 33 loại nấm Đông Trùng Hạ Thảo: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C sobolifera, C.heteropoda, C.crilalis, C.militaris, C.purpureostroma, C.clavata, C.tricentri, C.takaomontana, C.ferruginosa, C.atrovirens, C.coccidiicola, C.neovolkiana, C.nigripoda, C.gracilioides, C.nutans, C.nakazawai, C.roeostroma, C.michiganensis, C.ruinosa, C.annullata, C.subbssesillis, C.stylophora, C.macularis, C.discoideocapitata, C.spheciceophala, C.japonensis, C.japonica, C.ophioglossoides, C.capita, C.intermedia f.michiniluensis [51] 1.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt chất sinh học Trong loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, chủng nấm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana số loài khác quan tâm nghiên cứu nhiều thành phần hóa học hoạt chất sinh học Các phân tích hoá học cho thấy, sinh khối (biomass) Đông trùng Hạ thảo Cordyceps militaris chứa 17 loại acid amin khác Ngoài có D-mannitol, lipid nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na, Cu, Zn ) Quan trọng sinh khối Đông trùng Hạ thảo có nhiều chất mang hoạt tính sinh học cao nhà khoa học dần khám phá nhờ tiến ngành hoá học hợp chất tự nhiên Nhiều hoạt chất chứng minh có giá trị dược liệu thần kỳ Trong phải kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs) [1] Ngoài ra, Đông trùng Hạ thảo chứa nhiều loại vitamin, 100g Đông trùng Hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K Hơn nữa, nhiều loại polysaccharides loạt nguyên tố hóa học (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V) tìm thấy chi nấm [1] Còn C takaomontana có adenosin 0,1%, manitol 7,42%, 17 loại amino acid, protein 40,24%, loại acid béo cao Oleic acid 38,35%, Linolenic acid 28,3%, Palmitic acid 17,08%, Linoleic 12,35%, Stearic acid 3,16%, Palmitoeic acid 0,76% (In Pyo Hong 2007) Polysaccharides phân lập từ thể vô tính C takaomontana có hoạt tính chống ung thư (Ban et al., 1998) Đặc biệt dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol thành phần hoá học quan trọng phát thể vô tính loài Cordyceps takaomontana Các hợp chất thể tác dụng diệt tế bào ung thư hiệu thông qua chế gây chết theo chương trình (apoptosis) Beauvericin phát nhiều loài nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (thể vô tính Cordyceps takaomontana) Beauvericin chất chuyển hóa cyclohexadepsipeptide liên quan đến nấm sở hữu loạt hoạt động sinh học thuốc trừ sâu, điều trị nhiễm ký sinh trùng, kháng khuẩn, kháng nấm, chống trùng sốt rét ức chế ung thư (Shin et al., 2009) 1.2.3 Nghiên cứu giá trị dược liệu Đông Trùng Hạ Thảo Trong loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, loài nấm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana quan tâm nghiên cứu nhiều giá trị dược liệu Các nghiên cứu cho thấy, sinh khối (biomass) Đông trùng Hạ thảo Cordyceps militaris chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao chứng minh 10 Hình 3.14: Ảnh hưởng thời gian thu hoạch tới lượng thể beauvericin Thể sau thu hoạch, đem phân tích Beauvericin Viện Hóa Sinh Biển,Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam (là đơn vị tham gia đề tài) Hợp chất sau tách chiết tinh sạch, đem chạy HPLC Kết thể hình 3.15 Beauvericin n A A Beauvericin n B A Thời gian lưu Hình 3.15: Pick sắc ký HPLC Beauvericin A Beauvericin chuẩn hãng Sigma B Beauvericin tách chiết từ C takaomontana B6 Kết hình 3.14 cho thấy nhận rằng, thời gian thu hoạch khác dẫn tới khác sản lượng thể thu hàm lượng 56 beauvericin có thể Từ hình 3.15 nhận thấy rằng, thời gian lưu bắt đầu xuất pick 26,9 phút chi đến 27,7 phút pick phân tử Beauvericin xuất với cường độ cao thời gian lưu 27,2 – 27,3, không xuất pick tương tự thời gian lưu khác Đối chiếu với pick Beauvericin chuẩn, pick Beauvericin tách chiết từ C takaomontana B6 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu Beauverici chuẩn Theo hình 3.14 cho thấy Ngày nuôi thứ 40, sản lượng thể đạt 15,5 g/lọ, hàm lượng Beauvericin 1,95 mg/g Đáng ý ngày nuôi thứ 45, khối lượng thể đạt mức 18,72 g/lọ hàm lượng Beauverin đạt cao 2,09 mg/g Đến ngày thu hoạch thứ 50, hàm lượng Beauvericin có giảm 0,04 mg/g khối lượng thể tươi 16,96 g/lọ Và hàm lượng Beauvericin giảm xuống 2,03 mg/g , khối lượng thể tươi 15,72 g/lọ vào ngày thứ 55 Sau ngày thứ 45, khối lượng thể đạt cao đồng thời hàm lượng Beauvericin đạt đỉnh Từ ngày thứ 45 trở đi, hàm lượng Beauvericin bắt đầu giảm Như vậy, sau nuôi điều kiện thích hợp, lựa chọn ngày nuôi thứ 45 tiến hành thu hoạch thể Các phân tích Beauvericin thể Cordyceps takaomontana làm sáng tỏ tác dụng hỗ trợ điều trị số bệnh có ung thư sản phẩm Từ thể quả, hàm lượng beauvericin chủng Cordyceps takaomontana B6 biến động khoảng 1,95 mg/g - 2,09 mg/g, cao so với chủng có nguồn gốc Thái Lan (0,915 mg/g) lên men môi trường rắn Trong đó, chủng tự nhiên Thái Lan hàm lượng Beauvericin dao động từ 0,0056 đến 0,038 mg/g (theo Sumalee Supothina et al , 2011) từ sinh khối lên men lỏng Isaria tenuipes (thể vô tính Cordyceps takaomontana) Thái Lan có hàm lượng Beauvericin thay đổi từ 2,7 – 32,2 mg/l (theo Jenifer J Luangsa-ard cộng (2009) Như vậy, hàm lượng beauvericin từ Cordyceps takaomontana B6 Việt Nam cao so với chủng C takaomontana có nguồn gốc Thái Lan lên men môi trường rắn 3.5 Xác định khối lượng cấu trúc Beauvericin 57 Sau mẫu tách chiết từ thể quả, dịch chiết chạy qua màng lọc 0,45µm sau bơm vào hệ thống HPLC, phân tích hệ thống MS Kết thu hợp chất Beauvericine dạng chất bột màu trắng Beauvericin tách chiết từ thể phân tích 1HNMR (400Mhz, CDCl2) Cấu trúc hoá học xác định dựa vào thông số phổ khối lượng ESIMS, định lượng Beauvericin đạt HPLC sắc ký đồ (UV 210 nm) Sự diện Beauvericin xác định ESI (bởi ion dương) Kết thể hình 3.16 [M+Na]+ [M+H]+ Hình 3.16: Phổ khối lượng ESI-MS Beauvericine m/z Tại thời gian lưu 27,1 – 27,3 phút phát mảnh 806, [M+Na]+ đặc trưng Beauvericin với cường độ cao đạt 100% rõ nét, tách biệt hoàn toàn với pick khác Như vậy, qua kết phân tích ESI – MS (hình 3.16), xác định khối lượng hợp chất tách có khối lượng 783 58 Hình 3.17: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR Beauvericine Từ hình 3.17, công thức phân tử Beauvericin có có mặt nhóm methyl, methylene, ba methane béo, năm methine thơm, đồng thời có mặt este cacbonyl Beauvericin có chứa tiểu phần D hydrocyisovaleryl N – methylphenylanalyl Thiết lập công thức hóa học Beauvericin, trình bày hình 3.18 Hình 3.18: Cấu trúc hóa học xác lập dựa kết phân tích phổ cộng hưởng từ Từ hình 3.18 rằng, cấu trúc hóa học Beauvericin phân lập từ thể Cordcyeps takaomontana giống với cấu trúc hóa học Beauverincin công bố có công thức phân tử C45H57N3O9 Như hoạt chất tách chiết từ thể Cordcyeps takaomontana Beauvericin 59 Kết từ hình 3.17 3.18 khẳng định hợp chất thu nhận Beauvericin.Tiếp tục kiểm tra HPLC mẫu thu nhận chất chuẩn Beauvericin Sigma Kết trình bày hình 3.16 cho thấy pick mẫu thu nhận pick mẫu chuẩn giống nhau, điều khẳng định thêm chất thu nhận chắn Beauvericin 3.6 Thử nghiệm đánh giá khả ức chế Beauvericin số dòng tế bào ung thư Thử nghiệm thực dòng tế bào ung thư HepG2 (ung thư gan), LU-1 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú) với nồng độ Beauvericine khác 0,8 µg/ml, µg/ml, 20 µg/ml 100 µg/ml, sử dụng Elipticine làm đối chứng dương Chất đối chứng dương Ellipticine hoạt động ổn định thí nghiệm, kết xử lý với r2 ≥ 0,99, giá trị thu có ý nghĩa mặt thống kê Kết trình bày bảng 3.7 cho thấy, dòng tế bào ung thư gan HepG2, với nồng độ Beauvericin 0,8 µg/ml, phần trăm ức chế tế bào Bảng 3.7: Khả ức chế số dòng tế bào ung thư Beauvericine % ức chế tế bào Nồng độ (µg/ml) Beauvericine HepG2 LU-1 Ellipticine* MCF-7 HepG2 LU-1 MCF-7 100 98,40 101,57 100,66 90,61 95,78 99,63 20 88,03 92,12 98,29 81,33 83,87 87,01 71,70 78,32 72,00 51,42 49,45 49,64 0,8 25,49 30,80 27,86 25,53 22,23 27,67 1,13 ± 0,30 1,76 ± 0,22 0,38 ± 0,07 0,40 ± 0,05 0,33 ± 0,05 IC50 2,14 ± 0,50 Ghi chú: Ellipticine thử nghiệm nồng độ 10 g/ml; g/ml; 0,4 g/ml 0,08 g/ml đạt 25,49%, nồng độ này, phần trăm ức chế tế bào dòng tế bào ung thư phổi LU-1 ung thư vú MCF-7 30,80% 27,86% Khi tăng nồng độ Beauvericin lên µg/ml, phần trăm ức chế tế bào dòng tế bào ung thư phổi LU1 đạt cao 78,32%, ung thư vú MCF-7 với 72,00 %, ung thư 60 gan HepG2 71,70 % Tại nồng độ 20 µg/ml, phần trăm ức chế tế bào 98,29% dòng tế bào ung thư vú MCF-7; 92,12 % dòng tế bào ung thư phổi LU-1, 88,03% dòng tế bào ung thư gan HepG2 Đặc biệt nồng độ 100 µg/ml, phần trăm ức chế tế bào dòng tế bào ung thư phổi U-1 đạt cao 101,57%, sau đến dòng tế bào ung thư vú MCF-7 dòng tế bào ung thư gan HepG2 100,66% 98,4% A B C D Hình 3.19: Tế bào ung thư phổi LU-1 tác động nồng độ beauvericin khác (A) Ở nồng độ 100µg/ml; (B) Ở nồng độ E 20µg/ml; (C) Ở nồng độ µg/ml ; (D) Ở nồng độ 0,8 µg/ml ; (E) Đối chứng Hình 3.19 cho thấy Beauverincin có tác động rõ rệt lên dòng tế bào ung thư phổi Ở đối chứng, tế bào phát triển bình thường, trải (hình E) Ở nồng độ 0,8 g/ml, mức độ gây độc thấp, tế bào chết bắt mầu đậm không 61 nhiều (hình D) Ở nồng độ g/ml, tế bào phát triển yếu, tế bào chết bắt mầu đậm tăng nhiều hơn, xen kẽ nhiều mảnh tế bào vỡ (hình C) Ở nồng độ cao 100 g/ml, hợp chất làm chết hầu hết tế bào, tế bào chết lại mảnh vỡ, không tế bào hình dạng nguyên vẹn (hình A) Giá trị IC50 Beauvericin dòng tế bào ung thư phổi LU-1 thấp nhất, đạt 1,13 µg/ml, dòng tế bào ung thư vú MCF-7 đạt mức 1,76 µg/ml cao dòng tế bào ung thư gan HepG2 đạt 2,14 µg/ml Như vậy, Beauvericin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư ba dòng thử nghiệm với giá trị IC50 từ 1,13 µg/ml 2,14 µg/ml Kết tương đồng với kết Qinggui Wang Lijian Xu (2012) 62 Chƣơng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ sáu mẫu Cordcyeps spp thu thập vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An, phân lập chủng có khả sinh trưởng phát triển tốt, ba chủng tạo thể quả, chủng B6 tạo thể nhiều Bằng phương pháp xác định trình tự ITS so sánh Ngân hàng gen, chủng B6 xác định tên khoa học Cordyceps takaomontana B6 Môi trường thạch SDAY (glucose 20g/l, cao nấm men 20g/l, thạch 20 g/l) môi trường thích hợp cho nhân giống cấp I Môi trường lỏng công thức 1- CT1 (glucose 20g/l, cao nấm men g/l, pepton 10g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4 0,5 g/l) tốt cho trình hoạt hóa giống chủng Cordyceps takaomonta B6 Tối ưu điều kiện nuôi chủng Cordyceps takaomonta B6 tạo thể quả, sinh hoạt chất sinh học có Beauvericin với điều kiện tối ưu: hàm lượng gạo lứt 40g/lọ 500ml, nhiệt độ nhân nuôi 25°C, độ pH 7, cường độ chiếu sáng 200 lux, độ ẩm 80%, thời gian thu hoạch 45 ngày Bằng phương pháp sắc ký khối phổ ESI-MS, sắc ký lỏng cao áp HPLC phương pháp cộng hưởng từ 1H-NMR xác định khối lượng phân tử, cấu trúc hóa học Beauverin hàm lượng Beauvericin 2,09 mg/g Thử nghiệm đánh giá khả ức chế số dòng tế bào ung thư Beauvericin thu nhận, hoạt tính gây độc tế bào ung thư với giá trị IC50 từ 1,13 µg/ml - 2,14 µg/ml, IC50 dòng tế bào ung thư phổi LU-1 1,13 µg/ml, dòng tế bào ung thư vú MCF-7 mức 1,76 µg/ml dòng tế bào ung thư gan HepG2 đạt 2,14 µg/ml 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định số hoạt chất có khả hỗ trợ hệ tim mạch, ức chế tế bào ung thư, tăng cường khả miễn dịch, Đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn thể 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đái Duy Ban (2009), ―Nghiên cứu phát loài Đông trùng Hạ thảo Isaria cerambycidae NSP Việt Nam xác định số hoạt chất sinh học Đông trùng Hạ thảo‖- Thông tin y học Bộ y tế, tháng 8/2009.) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2006), Chương trình Vi sinh vat hoc - Nấm sợi) Tô Quang Huyên Lê Thị Xuân, 2012 Trịnh Tam Kiệt (1996), ―Danh mục loài nấm lớn Việt Nam‖ Nhà Xuất Nông Nghiệp, Hà nội Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung (2001), Lớp ASCOMYCETES, Danh mục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Trần Ngọc Lân (2008), Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng vuồn Quốc Gia Pù Mát đành giá khả ký sinh số loài nấm loài sâu hại trồng, Đề tài cấp Giáo dục đào tạo Mã số: B2007-2725) Phạm Quang Thu (2009), Phát nấm Đông trùng Hạ thảo (Cordyceps gunnii (Berk.) Berk.) vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số 6, 96-99 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà,(2010), Phát nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps takaomontana Takushui Kummazawa Việt Nam Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số 6, 126-130 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà, Lê Thị Xuân (2011), Phân bố nấm Đông trùng Hạ thảo Isaria tenuis (Peck.) Samson Việt Nam, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, số 1, 93-97 10 Tô Quang Huyên Lê Thị Xuân, 2012, Thành phần loài nấm ký sinh côn trùng khu rừng di tích lịch sử cảnh quan môi trường Mường Phăng 64 huyện Điện Biên, tỉnh Điện Biên, Thông tin khoa học lâm nghiệp Số - tr 2380-2388 Tài liệu tiếng anh 11 Alley M.C, scudiero D.A, Monks A, Hursey M.L, Czerwinski M.J, Fine D.L, Abbott B.J, Mayo.J.G, Shoemaker.R.H, Boyd.M.R (1988): Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay Cancer Research No 48, 589-601 12 Ahn Y.J, Park S.J, Lê S.G, Shin S.C., Choi D.H 2000 Cordycepin: Selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps Miltaris against Clostridicum spp J Agric Food Chem 48: 2744-2748 13 Bunyapaiboonsri T1, Yoiprommarat S, Intereya K, Rachtawee P, HywelJones NL, Isaka M, Isariotins E and F, spirocyclic and bicyclic hemiacetals from the entomopathogenic fungus Isaria tenuipes BCC 12625 J Nat Prod 2009 Apr;72(4):756-9 14 Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME Mushrooms, tumors, and immunity Proc Soc Exp Biol Med 1999 Sep;221(4):281-93 Review 15 Castlebury, L.A.; Sutherland, J.B.; Tanner, L.A.; Henderson, A.L.; Cerniglia, C.E Use of a bioassay to evaluate the toxicity of beauvericin to bacteria World J Microb Biot 1999, 15, 119–121 16 Eiji Yokoyama, Masao Arakawa, Kenzo Yamagishi, Akira Hara Phylogenetic and structural analyses of the mating – type loci in Clavicitaceae, FEMS Microbiology letters, Volume 264, Issue 2, Pages 182-191 November 2006 17 14 (tai lieu) Ganassi, S.; Moretti, A.; Pagliai, A.M.B.; Logrieco, A.; Sabatini, M.A Effects of beauvericin on Schizaphis graminum (Aphididae) J Invertebr Pathol 2002, 80, 90–96 18 Grove, J.F.; Pople, M The insecticidal activit18y of beauvericin and the enniatin complex Mycopathologia 1980, 70, 103–12 - 105 65 19 In-PyHong et al ―synema production by isariatenuipes using Corlloed cocoon Silk Worm, Golden Silk, Int J Indust Etomol.voll, no.1,pp1-4 20 Jestoi, M Emerging Fusarium -Mycotoxins Fusaproliferin, Beauvericin, Enniatins, And Moniliformin—A Review Crit Rev Food Sci 2008, 48, 21– 49 21 Jonh H, Matt C (2008) Medicical value of the caterpillar fungi species of the genus Cordyceps (Fr) Link (Ascomycetes) A review International Journal Medicinal Mushroom.10(3): 219-234; 22 Kardon L.B.S, Angerhofer.C.K, Tsauri.S, Padmawinata.K, Pezzuto.J.M, Kinghorn A.D (1991): Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia; J Nat Prod., No 5, Vol 54, 1360-1367 23 Kikuchi H Miyagawa Y, Nakamura K, Sahashi Y, Inatomi S, Oshima Y A novel carbon skeletal trichothecane, tenuipesine A, isolated from an entomopathogenic fungus, Paecilomyces tenuipes 2004 Org Lett 2004 Nov 25;6(24):4531-3 24 Klauing JE, Kamendulis LM 2004 The role of oxidative stress in carcinogenesis Annu Rev.Pharmacol 44 239-267 25 Kobayashi, cordyceps species from Japan, BulL Natn Sci Mus., Tokyo, Ser B, I (4), December 22, 1982 26 Lee H, Kim Y J, Kim H W, Lee D.H, Sung M.K, Park T.2006 Introduce off apoptosis by Cordyceps Militaris though actication off caspase-3 leukemia HL-60 cels, Biol.Pharm.Bull, 29, 670 – 674 27 Leland, J.E.; McGuire, M.R.; Grace, J.A.; Jaronski, S.T.; Ulloa, M.; Park, Y.; Plattner, R.D Strain selection of a fungal entomopathogen, Beauveria bassiana, for control of plant bugs (Lygus spp.)(Heteroptera: Miridae) Biol Control 2005, 35, 104–114 28 Li Cui, Ming Sheng Dong, Xiao Hon chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan 2008 A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris , a Chinese 66 traditional medicinal mushroom World J Microbiol biotechol (2008) 24:483 -489 29 Logrieco A, Moretti A, Castella G et al (1998) "Beauvericin Production by Fusarium Species" Appl Environ Microbiol 64 (8): 3084– PMC 106821 PMID 9687479 30 Mao X.L 2000 The macrofungi in China, Henam Technical and Science Publication House 31 Meca, G.; Sospedra, I.; Soriano, J.M.; Ritieni, A.; Moretti, A.; Manes, J Antibacterial effect of the bioactive compound beauvericin produced by Fusarium proliferatum on solid medium of wheat Toxicon 2010, 56, 349– 354 32 Monks.A, Scudiero.D, Skehan.P, Shoemake.R, Paull.K, Vistica.D, Hose.C, Langley.J, Cronise.P, Campbell.H, Mayo.J, Boyd.M (1991): Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines; Journal of National Cancer Institute No.11, Vol 83, 757766 33 Nam KS, Jo YS, Kim YH, Hyun JW, Kim HW Cytotoxic activities of acetoxyscirpenediol and ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes Life Sci 2001 Jun 1;69(2):229-3 34 Nan J.X, Park E.J, Yang B.K, Song C.H, Ko G., Sohn D.H, 2001, antibiotic effect of extra cellula biopolymer from submerged mycelial cultures of cordyceps militariss on liver fibrosis induced by bile cut ligation ans scission in rats, Arch Phram.Rres 24:327-322) 35 Nilanonta, C; Isaka, M.; Kittakoop, P.; Trakulnaleamasai, S.; Tanticharoen, M.; Thebtaranonth, Y Precursor-directed biosynthesis of beauvericin analogs by the insect pathogenic fungus Paecilomyces tenuipes BCC 1614 Tetrahedron 2002, 58, 3355–3360 36 Nilanonta, C.; Isaka, Kamchonwongpaisan, M.; S.; Kittakoop, P.; Pittayakhajonwut, 67 Palittapongarnpim, D.; Tanticharoen, P.; M.; Thebtaranonth, Y Antimycobacterial and antiplasmodial cyclodepsipeptides from the insect pathogenic fungus Paecilomyces tenuipes BCC1614 Planta Med 2000, 66, 756–758 37 Oh GS, Hong KH, Oh H, Pae HO, Kim IK, Kim NY, Kwon TO, Shin MK, Chung HT 4-Acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol isolated from the fruiting bodies of Isariajaponica Yasuda induces apoptosis of human leukemia cells (HL-60) Biol Pharm Bull 2001 Jul;24(7):785-9 38 Peeters, H.; Zocher, R.; Kleinkauf, H Synthesis beauvericin by a multifunctional enzyme J Antibiot 1988, 12, 352–359 39 Peeters, H.; Zocher, R.; Madry, N.; Kleinkauf, H Incorporation of radioactive precursors into beauvericin produced by Paecilomyces fumosoroseus Phytochemistry 1983, 22, 1719–1720 40 Peeters, H.; Zocher, R.; Madry, N Oelrichs, P.B Cell-free synthesis of the desipeptide beauvericin J Antibiot 1983, 36, 1762–1766 41 Pramer D (1965) Fungal Parasites of Insects and Nematodes Bacteriological Review.29: 382 – 387) 42 Qinggui Wang Lijian Xu Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short review Molecules 2012 Feb 24;17(3):2367-77 43 Scudiero.D.A, Shoemaker.R.H Paull.K.D, Monks.A, Tierney.S, Nofziger.T.H, Currens.M.J, Seniff.D, Boyd.M.R (1988): Evaluation of a soluble Tetrazolium/Formazan assay for cell growth and drug sensivity in culture using human and other tumor cell lines; Cancer Research No.48, 4827-4833 44 Shin, C.G.; An, D.G.; Song, H.H.; Lee, C Beauvericin and enniatins H, I and MK1688 are new potent inhibitors of human immunodeficiency virus type-1 integrase J Antibiot 2009, 62, 687–690,) 45 Shimada A, Fujioka S, Koshino H, Kimura Y Nematicidal activity of beauvericin produced by the fungus Fusarium bulbicola Zeitschrift für Naturforschung C, 2010, 65(3-4):207-210 (Tach chiet Beau) 68 46 Shoemake R.H, Scudiero D.A, Suasville.E.A (2002): Application of highthroughput, molecular – targeted screening to anticancer drug discovery Curr Top Med Chem.; No 2, Vol 3, [229-246] 47 Sun HC, Jong CK, Jung SL, Chul SY, Jong HK, Hyo IC, Seung WK (2006) Morphological chaharacteristic of Cordyceps sinensis 16 and production of mycelia and exo-biopolyner from molasses in submerged culter Journal of industrial and Engineering Chemisstry 12(1):115 -120) 48 Sung Hak Lee, Hwang HS, Yun JW Antitumor activity of water extract of a mushroom, Inonotus obliquus, against HT-29 human colon cancer cells Phytother Res 2009 Dec;23(12):1784-9 doi: 10.1002/ptr.2836 49 SungJaeMo 2000, Insect – born fungus of Korea, Kangwon National University,Korea 50 Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM, Spatafora JW Phylogenetic Luangsa-Ard classification of JJ, Shrestha Cordyceps and B, the clavicipitaceous fungi Stud Mycol 2007;57:5-59 51 Tsuguo Hongo Masana Izawa, 1994, Mushroom in Japan, Yama – Kei Publisher, Japa 52 Xu, L.; Wang, J.; Zhao, J.; Li, P.; Shan, T.; Wang, J.; Li, X.; Zhou, L Beauvericin from the endophytic fungus, Fusarium redolens, isolated from Dioscorea zingiberensis and its antibacterial activity Nat Prod Commun 2010a, 5, 811–814 53 Yahagi S, An experimental study on cartilage and the morphogenesis induced by implanted demineralized dentin matrix., Shikwa Gakuho 1985 Feb;85(2):135-65 Japanese 54 Zhan, J.; Burns, A.M.; Liu, M.X.; Faeth, S.H.; Gunatilaka, A.A.L Search for cell motility and angiogenesis inhibitors with potential anticancer activity: Beauvericin and other constituents of two endophytic strains of Fusarium oxysporum J Nat Prod 2007, 70, 227–232 69 Tài liệu internet 55 http://blog.tamtay.vn/entry/view/864600/Duoc-thao-quy-hiem-Dong-trungha-thao.html; 56 http://khoahocviet.vn/dong-trung-ha-thao/; 57 http://www.nature.com/ja/journal/v62/n12/fig_tab/ja2009102t1.html 58 www.ngheandost.gov.vn 59 http://thaythuocgioi.net/dong-trung-ha-thao-thuoc-cai-lao-hoan-dong-hoixuan-sinh-luc 60 http://www.thuocbo.net/dong-trung-ha-thao/6-dong-trung-ha-thao/38-dongtrung-ha-thao-dang-nuoc.html 61 http://www.researchgate.net/publication/9008487_Beauvericin_cytotoxicity_ to_the_invertebrate_cell_line_SF-9; 62 http://voer.edu.vn/pdf/67654c1d/1; 70 ... cầu dòng tủy, ung thư bàng quang, ung thư não, ung thư hệ thống thần kinh, đầu ung thư cổ, ung thư biểu mô tế bào vảy đầu cổ, ung thư thận, ung thư phổi ung thư phổi tế bào nhỏ không nhỏ ung thư. .. chế lên dòng tế bào ung thư Beauvericin rộng, nhiều dòng tế bào Vì vậy, việc nghiên cứu khả kháng dòng tế bào ung thư Beauverincin nhà khoa học tập trung nghiên cứu 27 Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG... ung thư ruột kết, ung thư cổ tử cung, ung thư biểu mô cổ tử cung, ung thư máu; ung thư tinh hoàn; đại tràng RECTA ung thư, ung thư tuyến tiền liệt ung thư tuyến tụy Như vậy, nhận thấy phổ ức chế