LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN .3 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI 1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC BỆNH SỞI 1.2.1 Phạm vi vật chủ 1.2.2 Phương thức lây truyền 1.2.3 Tính cảm thụ - miễn dịch 1.2.4 Biểu trình dịch 1.3 VIRUS SỞI 1.3.1 Phân loại 1.3.2 Hình thái học 1.3.3 Thành phần hóa học 1.3.4 Cấu trúc 1.3.5 Đặc tính virus sởi 1.3.6 Quá trình nhân lên virus sởi tế bào 11 1.3.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển TB nhân lên virus 14 1.4 BỆNH SỞI 20 1.4.1 Chu kỳ phát triển virus sởi thể bệnh nhân 20 1.4.2 Triệu chứng bệnh 20 1.4.3 Biến chứng bệnh sởi 21 1.5 PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH SỞI 22 1.5.1 Vắc xin phòng bệnh sởi 22 1.5.2 Điều trị bệnh sởi 23 i LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 1.5.3 Tình hình tiêm chủng vắc xin sởi phòng bệnh Việt Nam 23 1.6 SẢN XUẤT VẮC XIN SỞI TẠI POLYVAC 25 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 26 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 27 2.2.1 Nguyên vật liệu 27 2.2.2 Thiết bị 28 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.3.1 Khảo sát nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trường nuôi cấy virus 29 2.3.2 Thiết kế nghiên cứu 29 2.3.3 Pha môi trường nuôi cấy virus M199 31 2.3.4 Quy trình thử nghiệm đánh giá chất lượng vắc xin sởi bán thành phẩm 36 2.3.5 Phân tích số liệu 37 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 Khảo sát mối quan hệ nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy virus với giá trị pH đo đƣợc môi trƣờng 38 3.2 Kết nghiên cứu nhóm I 40 3.3 Kết nghiên cứu nhóm II 41 3.4 Kết nghiên cứu nhóm III 43 3.5 Kết nghiên cứu nhóm IV 44 3.6 Kết nghiên cứu nhóm V 46 3.7 Đánh giá mối liên hệ pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V 47 3.8 Kiểm định chất lƣợng lô vắc xin sởi bán thành phẩm 49 3.9 Kết hiệu giá vắc xin sởi BTP sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 Polyvac 50 KẾT LUẬN .53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 ii LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Học viên Lê Tuấn Anh iii LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS Nguyễn Thúy Hƣờng – Trung Tâm Nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế, PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm – Viện Công Nghệ sinh học, Công nghệ Thực phẩm Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ hƣớng dẫn thực luận văn tốt nghiệp Trong thời gian học tập nghiên cứu vừa qua, nhận đƣợc giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô Bộ môn thầy cô Phòng Đào tạo Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Toàn nội dung nghiên cứu luận văn đƣợc thực hoàn thành Phòng Bán thành phẩm, phòng Môi Trƣờng Phòng Kiểm định thuộc Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (Polyvac) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán phòng ban Nhân xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (Polyvac) nơi công tác tạo điều kiện thuận lợi cho học tập làm việc, xếp thời gian để hoàn thành nhiệm vụ học tập Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp gia đình quan tâm giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp Hà Nội, tháng 09/2015 Học Viên Lê Tuấn Anh iv LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI BẢNG KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Bulk Vắc xin Sởi bán thành phẩm BS Bovine serum – Huyết bò BSA Bovin Serum Albumin - Albumin huyết bò CPE Cytopathic Effect - Hiệu hủy hoại tế bào CGI Cell Growth Index - Chỉ số phát triển tế bào EK Erythromycin & Kanamycin GM 5% BS Môi trƣờng phát triển 5% huyết bò HG Hiệu giá M199/PR (+) Môi trƣờng M199 có đỏ phenol M199/PR (-) Môi trƣờng M199 đỏ phenol MVVAC Vắc xin sởi sản xuất Việt Nam NBCS New born calf serum – Huyết bê sinh PFU Plaque Forming Unit – Đơn vị tạo đám hoại tử POLYVAC Trung tâm nghiên cứu sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế SCD Soybean Casein Digest – Môi trƣờng Casein đậu tƣơng TCMR Tiêm chủng mở rộng TGC Thioglycholate – Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn VX Vắc xin TB Tế bào TBĐV Tế bào động vật WFI Water for Injection – Nƣớc pha tiêm WHO Tổ chức Y tế Thế giới v LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các loại môi trƣờng sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 2.2: Nguyên vật liệu dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm .27 Bảng 2.3: Các loại môi trƣờng dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm .27 Bảng 2.4: Thiết bị dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm 28 Bảng 2.5: Bảng phân chia nhóm nghiên cứu 30 Bảng 2.6: Công thức môi trƣờng M199/PR(+) 31 Bảng 2.7: Công thức môi trƣờng M199/PR(-) 33 Bảng 2.8: Công thức pha chế thành phần môi trƣờng M199/PR (+) nhóm nghiên cứu nồng độ NaHCO3 khác 35 Bảng 2.9: Công thức pha chế thành phần môi trƣờng M199/PR (-) nhóm nghiên cứu nồng độ NaHCO3 khác 35 Bảng 2.10: Tiêu chuẩn đánh giá vắc xin sởi bán thành phẩm 36 Bảng 3.1 Kết đo pH môi trƣờng nuôi cấy virus nồng độ 38 NaHCO3 khác 38 Bảng 3.2 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin 40 sởi bán thành phẩm nhóm I .40 Bảng 3.3 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin 42 sởi bán thành phẩm nhóm II 42 Bảng 3.4 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin 43 sởi bán thành phẩm nhóm III 43 Bảng 3.5 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin 45 sởi bán thành phẩm nhóm IV 45 Bảng 3.6 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin .46 sởi bán thành phẩm nhóm V .46 Bảng 3.7: Kết pH môi trƣờng hiệu giá tƣơng ứng lô vắc 47 xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V 47 Bảng 3.8 Kết kiểm định chất lƣợng lô vắc xin sởi bán thành phẩm 49 từ nhóm I đến nhóm V 49 Bảng 3.9 Kết qủa tính toán hiệu suất sản xuất vắc xin sởi thành phẩm từ hiệu giá lô BTP nghiên cứu sản xuất thƣờng quy 52 vi LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Nguồn gốc chủng AIK-C .3 Hình 1.2 Cấu tạo hạt virus sởi Hình 1.3 Ảnh hƣởng pH lên hiệu giá virus sởi chủng Edmonston .8 Hình 1.4: Hiệu giá virus sởi giá trị pH khác Hình 1.5 Sự nhân lên virus sởi 11 Hình 1.6 Các virus sởi nẩy chồi qua màng sinh chất TB phôi gà sau 72 gây nhiễm 13 Hình 1.7 Các virion virus sởi sau thoát khỏi màng TB phôi gà nằm tập trung sát màng TB với đa dạng kích thƣớc .13 Hình 3.1 Giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy virus nồng độ NaHCO3 khác 39 Hình 3.2 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm I 41 Hình 3.3 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm II 42 Hình 3.4 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy viru hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm III 44 Hình 3.5 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm IV 45 Hình 3.6 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm V 47 Hình 3.7 Mối liên hệ pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V 48 Hình 3.8: Hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 51 vii LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỞ ĐẦU Bệnh sởi bệnh truyền nhiễm cấp tính virus sởi gây nên Bệnh lây nhiễm qua đƣờng hô hấp, tốc độ lan truyền nhanh dễ lây thành dịch, đặc biệt trẻ em, tỷ lệ cảm nhiễm với sởi cao 90% trẻ chƣa có miễn dịch bị nhiễm bệnh tiếp xúc với bệnh nhân sởi Bệnh có biểu sốt, dấu hiệu viêm đƣờng hô hấp điển hình phát ban [2,3] Bệnh sởi nguyên nhân thứ năm gây tử vong cho trẻ dƣới tuổi đứng đầu số bệnh truyền nhiễm Trƣớc có vắc xin sởi, bệnh thƣờng gây vụ bùng nổ dịch lớn khắp giới gây tử vong để lại biến chứng nghiêm trọng Những biến chứng sởi chủ yếu ỉa chảy, viêm phổi, viêm tai nặng viêm não để lại di chứng thần kinh[2,3,6] Biện pháp hiệu để phòng ngừa tiến tới toán bệnh sởi tiêm vắc xin sởi Vắc xin sởi vắc xin có tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao, khả miễn dịch kéo dài, hiệu lực bảo vệ vắc xin sởi đạt 90% [7,8] Từ năm 2008 trở trƣớc toàn vắc xin sởi sử dụng Chƣơng trình TCMR phải nhập với giá thành cao không chủ động Từ thực tế đó, POLYVAC đƣợc Bộ Y tế giao thực dự án sản xuất vắc xin sởi - dự án hợp tác Chính phủ Nhật Bản phủ Việt Nam với nguồn vốn ODA - nguồn vốn viện trợ không hoàn lại phủ Nhật Bản Mục tiêu dự án xây dựng sở sản xuất vắc xin sởi với công suất 7.5 triệu liều/năm đạt tiêu chuẩn GMP WHO, nhận chuyển giao kỹ thuật sản xuất vắc xin sởi Việt Nam, nhằm chủ động nguồn cung cấp vắc xin sởi cho trẻ em Việt Nam hƣớng tới xuất khẩu, giúp giảm gánh nặng bệnh tật giảm chi phí y tế bệnh sởi gây nên Quy trình sản xuất vắc xin sởi đƣợc chuyển giao công nghệ hoàn toàn từ Viện nghiên cứu Kitasato - Nhật Bản sang cho Polyvac từ nguyên liệu đầu đến vắc xin Sởi thành phẩm Trong đó, giai đoạn sản xuất vắc xin sởi có liên quan mật thiết với nhau, bên cạnh chủng virus tế bào môi trƣờng nuôi cấy yếu tố quan trọng trình sản xuất vắc xin sởi Năm 2009 Polyvac thực thành công việc nhận chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin sởi từ Viện Kitasato - Nhật Bản 1,3 triệu liều vắc xin sởi đƣợc đƣa vào chƣơng trình tiêm chủng mở rộng quốc gia để sử dụng cho trẻ LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI em Thành công ghi tên Việt Nam quốc gia khu vực Đông Nam Á sản xuất đƣợc vắc xin sởi Sự đời vắc xin sởi đánh dấu bƣớc phát triển ngành sản xuất vắc xin Việt Nam Tuy nhiên, hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm Polyvac sản xuất chƣa cao dẫn đến hiệu suất sản xuất thấp, làm tăng chi phí nhân công chi phí sản xuất tăng giá thành vắc xin Điều số yếu tố ảnh hƣởng liên quan đến tính chất lý, hóa virus sởi, có pH môi trƣờng sử dụng cho nuôi cấy virus Với kinh nghiệm trình sản xuất vắc xin qua năm, nhận thấy thành phần dinh dƣỡng có môi trƣờng, pH môi trƣờng nuôi cấy yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới phát triển nhân lên virus sởi, qua định tới hiệu giá vắc xin Do vậy, để nâng cao hiệu sản xuất vắc xin sởi việc nghiên cứu tìm pH tối ƣu phù hợp với điều kiện sản xuất Việt Nam quan trọng Trên sở đó, tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tìm pH tối ưu môi trường nuôi cấy virus sử dụng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm Polyvac” Đề tài nghiên cứu nhằm giải mục tiêu sau: Xác định pH tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm để thu đƣợc vắc xin sởi đạt hiệu giá cao Nội dung đề tài: o Thực sản xuất môi trƣờng nuôi cấy virus sử dụng dung dịch NaHCO3 để điều chỉnh pH môi trƣờng nồng độ NaHCO3 khác o Thực sản xuất lô vắc xin sởi bán thành phẩm để nghiên cứu tìm dải pH tối ƣu quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm o Thực lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vắc xin nhóm nghiên cứu phƣơng pháp PFU (chuẩn độ hiệu giá phƣơng pháp phủ thạch) để lựa chọn đƣợc dải pH môi trƣờng tối ƣu cho sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm đạt hiệu giá cao LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SỞI TRÊN THẾ GIỚI Sởi bệnh sốt phát ban đƣợc biết đến từ kỷ 17 Đến kỷ 19 Nil Filatow (1885) Clement Dukes (1894) mô tả khác loại sốt phát ban Năm 1900, Clement Dukes đề xuất gọi sởi “bệnh phát ban thứ tư” Trong thời gian dài, “bệnh phát ban thứ tư” nguyên nhân tử vong hàng đầu trẻ nhỏ Đến năm 1954 Enders Peebles lần phân lập đƣợc virus sởi đánh dấu bƣớc tiến nghiên cứu bệnh sởi sở vắc xin sởi bất hoạt đời Tuy nhiên vắc xin sởi bất hoạt hiệu thấp, nhà khoa học nghiên cứu sản xuất vắc xin sống giảm độc lực Sau số lần cấy chuyển tế bào phôi gà tạo đƣợc chủng virus giảm độc lực Edmonston A B Edmonston Edmonston A Schwarz AIK-C FF-8 Beckenham 4A Beckenham 16 ESC Edmonstone B Ed-Zagreb Belgrade Philips Moraten Hình 1.1 Nguồn gốc chủng AIK-C Trên giới có nhiều chủng virus đƣợc sử dụng cho sản xuất vắc xin Trong chủng AIK-C đƣợc đánh giá chủng có phản ứng phụ thấp nhƣ tỷ lệ sốt 390C thấp Đặc biệt chƣa ghi nhận phản ứng phụ hệ thần kinh tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao so với chủng khác Nhật Bản nghiên cứu sản xuất vắc xin sởi từ chủng Edmonston kỹ thuật đơn dòng tế bào thận cừu tế bào phôi gà nhiệt độ 33 0C tạo chủng AIK-C Kết cho thấy virus phát triển tốt nhiệt độ 330C phát triển yếu không phát triển nhiệt độ 39 – 400C, chứng tỏ nhạy cảm với nhiệt virus sởi Từ chủng AIK-C, vắc xin sởi đƣợc sản xuất đƣa vào sử dụng rộng rãi Nhật Bản Đến năm 1963 vắc xin sống giảm độc lực đƣợc cấp phép lƣu LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 3.4 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng nuôi cấy viru hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm III Kết phân tích cho thấy, với việc sử dụng nồng độ NaHCO3 2% bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(+) (tƣơng đƣơng với pH môi trƣờng 7.75) tăng dần nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(-) từ 2.5% đến 3.5% (tƣơng ứng pH từ 7.68 đến 7.95) Hiệu giá lô vắc xbán thành phẩm sởi có xu hƣớng tăng dần đạt hiệu giá cao Cụ thể hiệu giá tăng từ 6.18 đến 6.35 lg PFU/5ml Hiệu giá phân nhóm III.3 có hiệu giá 6.18 lg PFU/5ml thấp hiệu giá phân nhóm III.1 III.2 (hiệu giá nhóm III.1 6.32 lg PFU/5ml hiệu giá nhóm III.2 6.35 lg PFU/5ml) Khi so sánh giá trị trung bình nhóm III.1, III.2 với nhóm III.3 phƣơng pháp T-test kết cho thấy khác biệt nhóm có ý nghĩa thông kê với mức ý nghĩa với p< 0.05 3.5 Kết nghiên cứu nhóm IV Nhóm IV (bổ sung NaHCO3 2.5% vào môi trƣờng M199/PR(+) giai đoạn gây nhiễm thay môi trƣờng lần 1) đƣợc chia làm phân nhóm IV.1, IV.2 IV.3 (tƣơng ứng với nhóm đƣợc bổ sung NaHCO3 3%, 3.5% 4% vào môi trƣờng M199/PR(-) giai đoạn thay môi trƣờng lần 2) Ở nhóm IV.2 (nhóm đối chứng) bổ sung NaHCO3 2.5% vào môi trƣờng M199/PR(+) giai đoạn gây nhiễm thay môi trƣờng lần bổ sung NaHCO3 3.5% vào môi trƣờng M199/PR(-) giai đoạn 44 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI thay môi trƣờng lần Đây nồng độ NaHCO3 mà Polyvac sử dụng để sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm Kết thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.5 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm IV Thông số đánh giá Nhóm IV (NaHCO3 2.5%) Nhóm IV.1 (NaHCO3 %) MBM 0214 MBM 0314 Giá trị trung bình M199/PR(+) pH 7.91 7.95 7.93 7.93 M199/PR(-) pH 7.82 7.82 7.80 7.81 Bán thành phẩm Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) 6.19 6.19 6.20 6.19 M199/PR(-) pH 7.94 7.95 7.96 7.95 pH 7.21 7.31 7.17 7.23 Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) 6.21 6.23 6.20 6.21 M199/PR(-) pH 7.98 7.98 7.98 7.98 Bán thành phẩm Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) 6.12 6.12 6.13 6.12 Nhóm IV.2 (NaHCO3 3.5 %) Bán thành phẩm Nhóm IV.3 (NaHCO3 4%) MBM 0114 Hình 3.5 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm IV 45 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Kết bảng 3.5 hình 3.5 cho thấy, với việc sử dụng nồng độ NaHCO3 2.5% bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(+) (tƣơng đƣơng với pH môi trƣờng 7.93) tăng dần nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(-) từ 3% đến 4% (tƣơng ứng pH từ 7.81 đến 7.98) Hiệu giá trung bình lô vắc xin bán thành phẩm sởi phân nhóm IV.1, IV.2, IV.3 đạt cao Đặc biệt hiệu giá nhóm IV.2 (nhóm đối chứng) đạt hiệu giá cao 6.21 lg PFU/0.5 ml Nhóm IV.1, IV.3 có hiệu giá thấp 6.19 6.12 lg PFU/5ml Khi so sánh giá trị trung bình nhóm phƣơng pháp T-test kết cho thấy khác biệt nhóm có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0.05 3.6 Kết nghiên cứu nhóm V Tƣơng tự nhƣ nhóm nghiên cứu trên, nhóm V bổ sung nồng độ NaHCO3 vào môi trƣờng M199/PR(+) vào môi trƣờng M199/PR(-) phân nhóm nhƣ bảng 3.6 Kết thu đƣợc nhóm V đƣợc thể bảng 3.6 hình 3.6 Bảng 3.6 Kết pH môi trƣờng nuôi cấy virus hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm V Nhóm V (NaHCO3 3%) Nhóm V.1 (NaHCO3 4%) Nhóm V.3 MBM MBM MBM đánh giá 0114 0214 0314 Giá trị trung bình M199/PR(+) pH 7.98 8.01 8.01 8.00 M199/PR(-) pH 7.97 7.94 7.94 7.95 6.09 6.06 6.10 6.08 7.98 7.98 7.98 7.98 5.98 5.98 5.95 5.97 8.00 8.01 8.00 8.00 5.65 5.68 5.72 (NaHCO3 3.5%) Bán thành phẩm Nhóm V.2 Thông số M199/PR(-) Bán thành phẩm M199/PR(-) (NaHCO3 4.5%) Bán thành phẩm Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) pH Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) pH Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) 46 5.68 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 3.6 Đồ thị thể giá trị pH môi trƣờng hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm nhóm V Kết bảng hình 3.6 cho thấy, với việc sử dụng nồng độ NaHCO3 3% bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(+) (tƣơng đƣơng với pH môi trƣờng 8.00) tăng dần nồng độ NaHCO3 bổ sung vào môi trƣờng M199/PR(-) từ 3.5% đến 4.5% ( tƣơng đƣơng với pH từ 7.95 đến 8.00) Hiệu giá lô vắc xin sởi bán thành phẩm phân nhóm V.1, V.2 V.3 có xu hƣớng giảm dần từ 6.08 lg PFU/5ml xuống 5.68 lg PFU/5ml Khi so sánh giá trị trung bình nhóm phƣơng pháp Ttest kết cho thấy khác biệt nhóm có ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa p < 0.05 3.7 Đánh giá mối liên hệ pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V Bảng 3.7: Kết pH môi trƣờng hiệu giá tƣơng ứng lô vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V Kết kiểm tra giá trị trung bình (Lô MBM 0114 ÷ MBM 0314) Nhóm nghiên cứu Nhóm I (NaHCO3 1%) pH M199/PR(+) Nhóm I.1 (NaHCO3 1.5%) Nhóm I.2 (NaHCO3 2%) Nhóm I.3 (NaHCO3 2.5%) 47 7.00 pH M199/PR(-) Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) 7.40 5.78 7.55 7.68 5.83 5.89 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nhóm II.1 (NaHCO3 2%) Nhóm II Nhóm II2 (NaHCO3 2.5%) (NaHCO3 1.5%) Nhóm I.3 (NaHCO3 3%) 7.55 6.07 7.68 7.81 6.13 6.15 7.68 6.32 7.81 6.35 Nhóm III.3 (NaHCO3 3.5%) 7.95 6.17 Nhóm IV.1 (NaHCO3 %) 7.81 6.19 7.95 7.98 6.21 6.12 7.95 6.08 7.98 8.00 5.97 5.68 7.50 Nhóm III.1 (NaHCO3 2.5%) Nhóm III (NaHCO3 2%) Nhóm III.2 (NaHCO3 3%) Nhóm IV Nhóm IV.2 (NaHCO3 3.5 %) (NaHCO3 2.5%) Nhóm IV.3 (NaHCO3 %) Nhóm V (NaHCO3 3%) 7.75 7.93 Nhóm V.1 (NaHCO3 3.5%) Nhóm V.2 (NaHCO3 4%) Nhóm V.3 (NaHCO3 4.5%) 8.00 Hình 3.7 Mối liên hệ pH môi trƣờng với hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V Qua bảng 3.7 hình 3.7 cho thấy với pH môi trƣờng M199/PR(+) 7.75 pH môi trƣờng M199/PR(-) 7.68 7.81 cho kết hiệu giá nhóm III.1 III.2 đạt cao 6.32 lgPFU/0,5ml 6.35 lgPFU/0,5ml Tuy nhiên sử dụng phƣơng pháp T-test để so sánh giá trị trung bình nhóm, kết cho thấy khác biệt hiệu giá nhóm ý nghĩa thống kê với p > 0.05 Cũng từ hình 3.2 cho thấy, nhóm IV.2 nhóm mà Polyvac sử 48 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI dụng (nhóm đối chứng) với pH môi trƣờng M199/PR(+) 7.93 pH môi trƣờng M199/PR(-) 7.95 cho kết hiệu giá cao 6.21 lgPFU/0,5ml Khi so sánh giá trị trung bình nhóm có hiệu giá cao nhóm III.1 nhóm III.2 với nhóm đối chứng IV.2 phƣơng pháp T-test kết cho thấy hiệu giá nhóm III.1 nhóm III.2 cao nhóm IV.2 khác biệt nhóm có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 Nhƣ vậy, kết luận nhóm có giá trị hiệu giá cao III.1, III.2 , tƣơng ứng với nồng độ NaHCO3 bổ sung thêm vào môi trƣờng M199/PR(+) 2% (pH 7.75) thêm vào M199/PR(-) từ 2.5% đến 3% (pH 7.68 7.81) Nồng độ NaHCO3 nhóm IV.2 (nhóm đối chứng) nằm giới hạn pH cận nhƣng đạt tiêu chuẩn pH từ 7.00 – 8.00 cho kết hiệu giá cao Tuy nhiên hiệu giá nhóm IV.2 (nhóm đối chứng) thấp hiệu giá nhóm III.1 nhóm III.2 khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 Do để sản xuất đƣợc vắc xin sởi bán thành phẩm đạt hiệu giá cao cần xem xét giảm nồng độ NaHCO3 xuống cho phù hợp 3.8 Kiểm định chất lƣợng lô vắc xin sởi bán thành phẩm Kết kiểm định chất lƣợng nhóm nghiên cứu lô vắc xin sởi bán thành phẩm (MBM 0114, MBM 0214 MBM 0314) đạt chất lƣợng theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới quy định Bảng 3.8 Kết kiểm định chất lƣợng lô vắc xin sởi bán thành phẩm từ nhóm I đến nhóm V TT Thử nghiệm Tiêu chuẩn chấp Kết thuận Quan sát tế bào đối Không quan sát thấy Không quan sát thấy chứng CPE CPE Không quan sát thấy Không quan sát thấy Thử nghiệm hấp phụ virus ngoại lai gây virus ngoại lai gây hấp hồng cầu hấp phụ hồng cầu phụ hồng cầu chuột chuột lang lang Kiểm tra tác nhân Không quan sát thấy Không quan sát thấy ngoại lai TB FL CPE CPE 49 Đánh giá Đạt Đạt Đạt LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Kiểm tra tác nhân Không quan sát thấy Không quan sát thấy ngoại lai TB Vero CPE CPE Kiểm tra tác nhân Không quan sát thấy Không quan sát thấy ngoại lai TB CEC CPE CPE Kiểm tra tác nhân Không quan sát thấy Không quan sát thấy ngoại lai trứng gà focus virus Pox focus virus Pox (yolk sac) màng phôi gà màng phôi gà Kiểm tra tác nhân Không phát Không phát thấy ngoại lai túi niệu thấy virus gây ngƣng virus gây ngƣng kết trứng gà (Allantoic) kết hồng cầu gà hồng cầu gà pH 6.50 ÷ 8.50 pH từ 6.71 ÷ 7.45 Không có phát Thử vô trùng triển vi khuẩn nấm 10 11 12 13 Hiệu giá (lg PFU/0.5ml) Thử nghiệm phát Mycoplasma Quy trình xác nhận loại bỏ tế bào Thử nghiệm BSA tồn dƣ Kiểm tra tác nhân 14 ngoại lai tế bào thận gà Không có phát triển vi khuẩn nấm Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Hiệu giá ≥ 5.6 (lg PFU/0.5ml) từ 5.68 ÷ 6.35 Đạt (lg PFU/0.5ml) Không có phát triển Mycoplasma Không tế bào < 50ng/liều Không có phát triển Mycoplasma Không tế bào BSA tồn dƣ từ 5.90 ÷ 6.03 ng/liều Không quan sát thấy Không quan sát thấy CPE CPE Đạt Đạt Đạt Đạt 3.9 So sánh kết hiệu giá vắc xin sởi BTP sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 Polyvac với hiệu giá lô nghiên cứu Từ năm 2009 ÷ 2012 Polyvac sản xuất đƣợc 37 lô vắc xin sởi bán thành phẩm đạt chất lƣợng theo tiêu chuẩn đánh giá Tổ chức Y tế giới quy định 50 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 3.8: Hiệu giá vắc xin sởi bán thành phẩm sản xuất từ năm 2009 ÷ 2012 Qua hình 3.8 cho thấy, Hiệu giá 37 lô vắc xin sởi bán thành phẩm giao động từ: 5.96 ÷ 6.25 lg PFU/0.5 ml (hiệu giá trung bình 6.15 lg PFU/0.5 ml) nằm tiêu chuẩn đánh giá: ≥ 5.6 lg PFU/0.5 ml Với kết này, 37 lô vắc xin sởi BTP đƣợc cấp chứng phân tích CoA đạt chất lƣợng đƣợc phép đƣa vào sử dụng cho sản xuất vắc xin sởi thành phẩm Từ kết hiệu giá lô bán thành phẩm sản xuất thƣờng qui, tiến hành so sánh với kết hiệu giá lô nghiên cứu để đánh giá hiệu qủa sản xuất vắc xin sởi thành phẩm nhƣ kết thể bảng dƣới 51 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 3.9 Kết qủa tính toán hiệu suất sản xuất vắc xin sởi thành phẩm từ hiệu giá lô BTP nghiên cứu sản xuất thƣờng quy Hiệu giá trung bình (lg PFU/0.5ml) Hiệu giá MFB (lý thuyết) TT Chênh lệch Hệ số pha Số liều vắc xin Nhóm Kết hiệu giá Nhóm nghiên cứu (III.1) 6.32 0.92 8.3 1.138.790 Nhóm nghiên cứu (III.2) 6.35 0.95 8.9 1.221.370 Nhóm đối chứng (IV.2) 6.21 0.81 6.4 878.316 Sản xuất thƣờng quy 6.15 0.75 5.6 768.000 5.4 Qua bảng 3.9 cho thấy, với hiệu giá nhóm nghiên cứu III.1 III.2 (6.32 6.35 lg PFU/0.5ml) sản xuất đƣợc số liều vắc xin sởi thành phẩm tƣơng ứng 1.138.790 1.221.370 liều So sách nhóm nghiên cứu III.2, nhóm có hiệu giá cao với nhóm đối chứng IV.2 nhóm thƣờng quy cho thấy nhóm III.2 có số liều vắc xin thu đƣợc cao nhóm đối chứng 343.054 liều vắc xin nhóm sản xuất thƣờng quy 453.370 liều vắc xin (số liệu cao tƣơng đƣơng với lô sản xuất vắc xin sởi thành phẩm) Điều cho thấy áp dụng kết nghiên cứu vào sản xuất thƣờng quy hiệu suất sản xuất tăng lên khoảng 30%, đồng nghĩa với việc rút ngắn đƣợc số lô sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm, tiết kiệm thời gian, chi phí sản xuất nhân công 52 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI KẾT LUẬN Đã xác định đƣợc khoảng pH tối ƣu môi trƣờng M199/PR(+) từ 7.74 ÷ 7.76 (ứng với nồng độ NaHCO3 2%) khoảng pH tối ƣu môi trƣờng M199/PR(-) từ 7.68 ÷ 7.81 (ứng với nồng độ NaHCO3 2.5% ÷ 3%) Áp dụng khoảng pH tối ƣu cho môi trƣờng M199/PR(+) M199/PR(-) tìm đƣợc trên, xác định đƣợc nhóm có hiệu giá trung bình cao nhất, hiệu giá đạt đƣợc khoảng 6.32÷ 6.35 lg PFU/0.5ml cao so với lô vắc xin đối chứng 6.21 lg PFU/0.5ml Hiệu suất sản xuất tăng lên khoảng 30% Việc điều chỉnh pH môi trƣờng nuôi cấy virus (M199/PR(+) M199/PR(-) giới hạn cho phép không làm ảnh hƣởng tới chất lƣợng vắc xin sởi bán thành phẩm Tất nhóm nghiên cứu lô vắc xin sởi bán thành phẩm đạt chất lƣợng nằm tiêu chuẩn 14 thử nghiệm theo quy định tổ chức y tế giới 53 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI KIẾN NGHỊ Để nâng cao hiệu sản xuất vắc xin sởi bán thành phẩm việc nghiên cứu tìm pH tối ƣu môi trƣờng nuôi cấy virus phù hợp với điều kiện sản xuất Polyvac quan trọng Kết nghiên cứu cho thấy, với khoảng pH tối ƣu môi trƣờng M199/PR(+) từ 7.74 ÷ 7.76 (tƣơng ứng với nồng độ NaHCO3 2%) khoảng pH tối ƣu môi trƣờng M199/PR(-) từ 7.68 ÷ 7.81 (tƣơng ứng với nồng độ NaHCO3 2.5% ÷ 3%) cho kết hiệu giá vắc xin đạt cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm nghiên cứu dải pH khác Với kết nghiên cứu, đề xuất sử dụng nồng độ NaHCO3 nhƣ để đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy virus sởi sản xuất thƣờng quy Polyvac, xem xét thực quản lý thay đổi qui trình sản xuất, tiến hành thực thẩm định quy trình sản xuất lô vắc xin sởi bán thành phẩm liên tiếp Ứng dụng kết nghiên cứu vào sản xuất thƣờng quy nhằm nâng cao hiệu suất sản xuất, tiết kiệm thời gian công sức lao động, dẫn đến giảm chi phí sản xuất 54 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Đình Bảng, Nguyễn Thị Kim Hƣơng (2003), Vắc xin chế phẩm miễn dịch phòng điều trị, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 193 – 194 Phan Trọng Lân, Nguyễn Vũ Thƣợng, Hồ Vĩnh Thắng, Phan Công Hùng (2014), Đặc điểm dịch tễ học bệnh sởi khu vực phía nam, Tạp chí Y học dự phòng, trang 20 – 28 Nguyễn Ngọc Quỳnh, Đặng Thị Kim Hạnh, Ngô Khánh Hoàng (2015), Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh sởi Hà Nội, Tạp chí Y học dự phòng, trang 45 – 52 Học viện quân y (1999), Bệnh học truyền nhiễm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 171 – 174 Hoàng Đức Hạnh, Trần Ngọc Hà, Đặng Đức Nhu, (2015), Mối liên quan bệnh sởi số yếu tố thời tiết Hà Nội giai đoạn 2008 - 2013 Nguyễn Xuân Phách (2000), Thống kê y học, Nhà xuất Y học, TP Hồ Chí Minh Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng (2004), “Công tác phòng chống bệnh sởi nƣớc ta”, Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng, Hà Nội Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng (2005), “Việt Nam phấn đấu loại trừ bệnh sởi vào năm 2010”, Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng, Hà Nội Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng (2008), “Bệnh sởi phát triển trở lại”, Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng, Hà Nội TIẾNG ANH 10 Athmanundh D, Felicity C.T, Fernandez de Castro et al (2000), “Response to different measles vaccine strains given by aerosol and subcutaneous routes to schoolchildren: a randomised trial”, The Lancet, Volume 355, pp: 798 – 803 55 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 11 Bass J.W, Halstead S.B, Fischer G.W (1976), “Booster vaccination with further live attenuated measles vaccine”, The Journal of the American Medical Association, Volume 235, No 1, pp: 127 – 129 12 Black Fl (1959), “Growth and stability of measles virus” Virology ;7(2):184– 192 13 Cesário L.M, May-Lill G., Carlito B et al (2008), “Protective efficacy of standard Edmonston-Zagreb measles vaccination in infants aged 4.5 months: interim analysis of a randomised clinical trial”, British Medical Journal, Volume 337, pp: 661 14 Griffin D.E (2001), “Measles virus”, Fields Virology, pp 1401 – 1441 15 Griffin, D.E and M.B.A Oldstone (2008), “Measles: History and Basic Biology”, Springer, Berlin Heidelberg, ISBN-10: 3540705228, pp 200 16 Hayley A.G, Ann M.A, Jill Galinus; et al (1998), “Deficiency of the humoral immune response to measles vaccine in infants immunized at age months”, The Journal of the American Medical Association, Volume 280, pp: 527 – 532 17 Kathel Kerr (2003), “Good response rate for MMRV vaccine”, The Lancet Infectious Diseases, Volume 3, Issue 12, pp: 748 18 Kim E Mulholland, (2006), “Measles in The United States, 2006”, The New England Journal of Medicine, Volume 355, No 5, pp: 440 – 443 19 Komase K, Nakayama T, Iijima M et al (2006), “The phosphoprotein of attenuated measles AIK-C vaccine strain contributes to its temperaturesensitive phenotype”, Vaccine, Volume 24, pp: 826-834 20 Markino S (1983), “Development and characteristic of live AIK-C measles virus vaccine: a brief report”, Rev Infect Dis., Volume 5, pp: 504-505 21 Markino S, Sasaki K, Nakamura N et al (1974), “Studies on modification of the live AIK measles vaccine”, Kitasato Arch Exp Med, Volume 47, pp: 13-21 22 Martin E.W (2001), “The fourth disease, 1900-2000”, The Lancet, Volume 357, pp: 299 – 301 56 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 23 Parker A.A, Wayne M.S, Gustavo H.D et al (2006), “Implications of a 2005 Measles Outbreak in Indiana for Sustained Elimination of Measles in the United States”, The New England Journal of Medicine, Volume 355, No 5, pp: 447 – 455 24 Richard K.P, Karl J.E, Ami S.L et al (2004), “A target site for template-based design of measles virus entry inhibitors”, PNAS Journal, Volume 101, pp: 5628 – 5633 25 Robin B, Simon M, Anne T et al (2002), “First years of measles elimination in southern Africa: 1996–2000”, The Lancet, Volume 359, pp: 1564 – 1568 26 Tsai HY, Huang LM, Shih YT et al (1999), “Immunogenicity and safety of standard-titer AIK measles vaccine in nine-month -old infants”, Viaral Immunol, Volume 12, pp: 343-348 27 Weiss, K., D Salzig, M.D Mühlebach, K Cichutek, R Pörtner and P Czermak (2012) “Key parameters of meales virus production of oncolytic virotherapy”, American Journal of Biochemistry and Biotechnology , (2), 8198 28 WHO (1997), Surveillance of adverse events following immunization, Geneva, Switzerland 29 WHO (2000), Supplementary information on vaccine safety, Geneva, Switzerland 30 WHO (2002), “Joint statement on strategies to reduce measles mortality worldwide”, Weekly Epidemiology, Rec 77, pp: 224 – 228 31 WHO (2006), “Progress in reducing global measles deaths: 1999-2004”, Weekly Epidemiology, Rec 81, pp: 91 – 94 32 Balin A.K., Goodman B.P., Rasmussen H., Cristofalo V.J (1975), The effect of oxygen tension on the growth and metabolism of WI-38 Cells J Cell Physiol 89: 235-250 57 LÊ TUẤN ANH 2013B ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 33 Billie Ruth Birt, B.A., FrancisT Forrester, Ph.D (1981), Basic laboratory techniques in cell culture, U.S department of Health and Human services: 2132, 96-97 34 De Ridder L., Mareel M (1978) Morphology and 125I concentration of embryonic chick thyroids cultured in an atmosphere of oxygen Cell Biol Int Rep 2: 2192-2194 35 Eagle H (1955) The specific amino acid requirements of mammalian cells in tissue culture J Biol Chem 214:839 36 Freshney R I., John Wiley & Sons Inc (1993): Culture of animal cells , New York A manual of basic techniques, 3rd Edition 58 ... tài nghiên cứu: Nghiên cứu tìm pH tối ưu môi trường nuôi cấy virus sử dụng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành ph m Polyvac” Đề tài nghiên cứu nhằm giải mục tiêu sau: Xác định pH tối ƣu môi trƣờng... cho sản xuất vắc xin sởi bán thành ph m .27 Bảng 2.3: Các loại môi trƣờng dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành ph m .27 Bảng 2.4: Thiết bị dùng cho sản xuất vắc xin sởi bán thành ph m ... NaHCO3 để điều chỉnh pH môi trƣờng nồng độ NaHCO3 khác o Thực sản xuất lô vắc xin sởi bán thành ph m để nghiên cứu tìm dải pH tối ƣu quy trình sản xuất vắc xin sởi bán thành ph m o Thực lấy mẫu