BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - LÊ THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm HÀ NỘI, 9/2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - LÊ THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS HỒ PHÚ HÀ HÀ NỘI, 9/2016 Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .5 LỜI CAM ĐOAN .6 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ .7 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC BẢNG BIỂU 10 DANH MỤC HÌNH ẢNH 11 LỜI MỞ ĐẦU 12 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 1.1 Giới thiệu probiotic 15 1.1.1 Lịch Sử định nghĩa probiotic .15 1.1.1.1 Lịch sử probiotic 15 1.1.1.2 Định nghĩa probiotic .16 1.1.2 Vai trò chế hoạt động probiotic 16 1.1.2.1 Vai trò probiotic vật chủ 16 1.1.2.2 Cơ chế hoạt động probiotic 17 1.1.3 Ứng dụng probiotic 21 1.1.3.1 Ứng dụng y học 21 1.1.3.2 Ứng dụng trồng trọt 22 1.1.3.3 Ứng dụng bảo vệ môi trƣờng 22 1.1.3.4 Ứng dụng cải thiện chất lƣợng nƣớc 23 1.1.3.5 Ứng dụng nuôi trồng thủy sản 23 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm 1.1.3.6 Ứng dụng chăn nuôi gia súc gia cầm 25 1.2 Các vi sinh vật probiotic 26 1.2.1 Vi khuẩn Bacillus .26 1.2.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus .26 1.2.1.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi vi khuẩn Bacillus 27 1.2.1.3 Vai trò vi khuẩn Bacillus lợn 28 1.2.2 Vi khuẩn Lactobacillus 29 1.2.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Lactobacillus 29 1.2.2.2 Một số vi khuẩn Lactobacillus 29 1.2.2.3 Vai trò vi khuẩn Lactobacillus lợn 32 1.2.3 Nấm men Saccharomyces boulardii 32 1.2.3.1 Đặc điểm Saccharomyces boulardii 32 1.2.3.2 Một số đặc điểm probiotic có lợi nấm men Saccharomyces boulardii 33 1.2.3.3 Vai trò nấm men Saccharomyces boulardii lợn .34 1.3 Giới thiệu vi sinh vật gây bệnh 34 1.3.1 Samonella 34 1.3.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Salmonella 34 1.3.1.2 Đặc điểm gây bệnh Salmonella lợn .35 1.3.2 Staphylococcus aureus .35 1.3.2.1 Đặc điểm vi khuẩn Staphylococcus aureus .35 1.3.2.2 Đặc điểm gây bệnh Staphylococcus aureus lợn 36 1.3.3 Escherichia coli 36 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm 1.3.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli 36 1.3.3.2 Đặc điểm gây bệnh Escherichia coli lợn .37 1.4 Một số nghiên cứu đánh giá in vivo hiệu sử dụng hỗn hợp probiotic động vật thử nghiệm nƣớc nƣớc 37 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Vật Liệu 40 2.1.1 Chủng vi sinh vật 40 2.1.2 Hóa chất – môi trƣờng 41 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật 42 2.2.1.1 Phƣơng pháp bảo quản môi trƣờng thạch nghiêng .42 2.2.1.2 Phƣơng pháp bảo quản dung dịch glycerol 10% 43 2.2.2 Phƣơng pháp quan sát hình thái xác định mật độ tế bào 43 2.2.2.1 Phƣơng pháp quan sát hình thái tế bào 43 2.2.2.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào pha loãng đếm khuẩn lạc đĩa thạch .43 2.2.3 Phƣơng pháp xác định khả sinh axit 44 2.2.4 Phƣơng pháp xác định khả sinh enzymes 45 2.2.5 Phƣơng pháp xác định khả kháng khuẩn Probiotic 45 2.2.6 Xác định khả sống sót chủng vi sinh vật probiotic điều kiện đƣờng ruột 47 2.2.7 Phƣơng pháp xác định khả phối hợp chủng vi sinh vật probiotic lựa chọn 47 2.2.9 Phƣơng pháp tính toán xử lý số liệu 48 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Đặc điểm, khả sinh enzyme axit vi sinh vật nghiên cứu 49 3.1.1 Đặc điểm vi sinh vật nghiên cứu .49 3.1.2 Khả sinh enzyme chủng vi khuẩn Bacillus .51 3.1.3 Khả sinh axit chủng vi khuẩn Lactobacillus 52 3.2 Khả kháng số vi sinh vật gây bệnh kiểm định chủng vi sinh vật probiotic nghiên cứu 55 3.3 Khả sống sót chủng vi sinh vật probiotic điều kiện đƣờng ruột 59 3.3.1 Khả sống sót chủng vi khuẩn Lactobacillus điều kiện đƣờng ruột 59 3.3.2 Khả sống sót chủng vi khuẩn Bacillus điều kiện đƣờng ruột 61 3.3.3 Khả sống sót S boulardii PLCP điều kiện đƣờng ruột 63 3.4 Khả phối hợp chủng L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP 64 3.4.1 Khả ức chế dịch nuôi cấy vi sinh vật probiotic lựa chọn 65 3.4.2 Khả ức chế lẫn ức chế vi sinh vật gây bệnh hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn môi trƣờng lỏng 66 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .70 KẾT LUẬN 70 HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH …………………………………………………77 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa học thạc sĩ mình, trƣớc hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Hồ Phú Hà – Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội tin tƣởng giao đề tài, tận tình bảo, hƣớng dẫn em suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong thời gian học tập nghiên cứu trƣờng em đƣợc dạy dỗ, giúp đỡ tận tình thầy cô Viện Công Nghệ Sinh Học Công Nghệ Thực Phẩm nhƣ thầy cô trƣờng Nhân dịp em xin đƣợc bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy cô Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm, ủng hộ tạo điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn Hà Nôi, Tháng năm 2016 Học Viên Lê Thị Hồng Vân Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, luận văn kết nghiên cứu làm việc tôi, nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực, rõ ràng Nếu có vấn đề xảy xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nôi, Tháng năm 2016 Tác giả luận văn Lê Thị Hồng Vân Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Đề tài: “Nghiên cứu lựa chọn vi sinh vật probiotic tiềm ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi” Tác giả luận văn: Lê Thị Hồng Vân Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Khóa: 2015B PGS.TS Hồ Phú Hà Từ khóa (Keyword): thức ăn chăn nuôi, enzyme tiêu hóa, hoạt tính kháng khuẩn, điều kiện tiêu hóa giả lập Nội dung tóm tắt: Probiotic đƣợc đánh giá cao dần đƣợc sử dụng phổ biến chăn nuôi Việt Nam Probiotic có vai trò cải thiện sức khỏe động vật, tăng cƣờng hệ miễn dịch, tăng trọng lƣợng, giảm tỉ lệ chết non ngăn chặn tác nhân gây bệnh, tránh lạm dụng kháng sinh ngành chăn nuôi Nghiên cứu nhằm đánh giá lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm hƣớng tới ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi 16 chủng vi sinh vật probiotic bao gồm 11 chủng Lactobacillus, bốn chủng Bacillus chủng nấm men Saccharomyces boulardii PLCP đƣợc nghiên cứu khả sinh axit theo phƣơng pháp chuẩn độ Therner (0T), khả sinh enzyme tiêu hóa đƣợc xác định theo phƣơng pháp chấm điểm, hoạt tính kháng khuẩn đƣợc xác định theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch khả tồn chủng vi sinh vật điều kiện đƣờng ruột đƣợc xác định theo phƣơng pháp cho vi sinh vật probiotic tiếp xúc với môi trƣờng dịch dày ruột non giả lập định lƣợng khả sống sót phƣơng theo phƣơng pháp pha loãng liên tiếp trang đếm đĩa thạch Kết thu đƣợc 11 chủng Lactobacillus có khả sinh axit (cao khoảng từ 18.05 – 19.04g/l) Bốn chủng Bacillus có khả sinh enzyme protease, chủng Bacillus sp D7 có khả sinh loại enzyme tiêu hóa (protease, amylase, cellulase) với đƣờng kính vùng thủy phân từ 15.5 - 18.5mm Hoạt tính kháng khuẩn 9/16 chủng vi sinh vật probiotic thử nghiệm tích cực Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm chống lại Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus Escherichia coli Khả sống sót vi sinh vật probiotic thử nghiệm điều kiện tiêu hóa giả lập tƣơng đối cao (trung bình đạt 80%) Ba chủng vi sinh vật probiotic tiềm năng: L acidophilus VAST, S boulardii PLCP Bacillus sp D7 đƣợc lựa chọn phối hợp dạng lỏng đảm bảo đƣợc khả sống sót ức chế vi sinh vật gây bệnh kiểm định, điều chứng minh tiềm lớn cho chế phẩm sinh học động vật sở để thực nghiên cứu sâu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm 3.3.3 Khả sống sót S boulardii PLCP điều kiện đƣờng ruột Khả sống sót S boulardii PLCP đƣợc xác định theo phƣơng pháp nhƣ mục 2.2.6 Kết thể hình 3.4 Mật độ tế bào S boulardii (CFU/ml) vi khuẩn ban đầu phút Dạ dày 90 phút - 180 phút - phút - 90 phút - 180 phút Dạ dày Dạ dày Ruột non Ruột non Ruột non Hình 3.4: Khả sống sót S boulardii PLCP điều kiện đƣờng ruột Mật độ tế bào S boulardii PLCP trƣớc tiếp xúc với điều kiện tiêu hóa giả lập dao động khoảng 107 – 108 CFU/ml Theo hình 3.4 tiếp xúc với dịch dày giả lập thấy tỷ lệ sống sót S boulardii PLCP tƣơng đối cao 7,14 log CFU/ml mật độ tế bào giảm 0,04 log CFU/ml Điều chứng tỏ chủng nấm men S boulardii PLCP có khả sống sót điều kiện môi trƣờng axit tƣơng đối cao Khi tiếp xúc với dịch ruột non giả lập, thấy khả sống sót S boulardii PLCP giảm với tỷ lệ sống sót 6,82 log CFU/ml mật độ tế bào giảm 0,35 log CFU/ml Trong nghiên cứu Theodoros Kelesidis cộng năm 2012 [37] tiến hành số thử nghiệm lâm sàng kết hợp với nghiên cứu thực nghiệm vai trò S boulardii chứng minh S boulardii tác nhân sinh học có khả điều trị nhằm ngăn chặn và/hoặc điều trị số bệnh đƣờng tiêu hóa Ngoài hoạt động phòng ngừa và/hoặc điệu trị tiêu chảy đƣợc nghiên cứu rộng rãi Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 63 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm đƣợc chứng minh Salmon cộng năm 2009, nghiên cứu kết luận S boulardii có hiệu việc ngăn ngừa bệnh tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy [54] Trong nghiên cứu Trần Quốc Việt cộng năm 2009 [10], môi trƣờng axit pH S boulardii có khả sinh trƣởng tốt, mật độ tế bào đạt 107 CFU/ml Trong điều kiện môi trƣờng chứa muối mật nồng độ 0,2 – 3% cho thấy khả sinh trƣởng S boulardii không bị ảnh hƣởng nhiều Trong kết nghiên cứu chúng tôi, S boulardii PLCP sau tiếp xúc với dịch dày dịch ruột non giả lập khả sốt sót cao đạt 95% gần nhƣ không bị ảnh hƣởng nhiều 3.4 Khả phối hợp chủng L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP Mỗi vi sinh vật probiotic có đặc tính probiotic có lợi khác nhau, nghiên cứu nhằm lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic có nhiều đặc tính probiotic có lợi Nhóm vi khuẩn Lactobacillus đƣợc xác định đặc tính probiotic có lợi là: khả sinh axit lactic, khả kháng khuẩn khả sống sót điều kiện đƣờng ruột giả lập Kết thu đƣợc L rhamnosus GG, L plantarum NCDN4, L plantarum NC8, L acidophilus VAST and L casei 334 thông qua đặc tính probiotic có lợi tƣơng đối cao Chủng L acidophilus VAST đặc tính có lợi vi khuẩn có khả sản sinh số hoạt chất khác đóng vai trò quan trọng việc ức chế vi sinh vật có hại lựa chọn chủng vi khuẩn để thực nghiên cứu khả phối hợp chủng vi sinh vật probiotic Nhóm vi khuẩn Bacillus đƣợc xác định đặc tính probiotic có lợi là: khả sinh loại enzyme tiêu hóa (protease, amylase, cellulase) khả kháng khuẩn nhƣ khả sống sót điều kiện đƣờng ruột Bốn vi khuẩn Bacillus nghiên cứu khả kháng vi sinh vật kiểm định phƣơng Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 64 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm pháp nghiên cứu nhƣng có khả sống sót điều kiện đƣờng ruột giả lập nhƣ khả sinh enzyme protease tƣơng đối cao thích hợp để lựa chọn Tuy nhiên, Bacillus sp D7 có khả sinh loại enzyme tiêu hóa (protease, amylase, cellulase) nên đƣợc chọn để thực nghiên cứu khả phối hợp chủng vi sinh vật probiotic Nấm men S boulardi PLCP đƣợc xác định đặc tính probiotic có lợi là: khả kháng khuẩn, khả sống sót điều kiện đƣờng ruột S boulardii PLCP khả ức chế vi sinh vật gây bệnh đƣờng ruột phƣơng pháp nghiên cứu (mục 3.3), nhƣng có khả sốt sót cao điều kiện tiêu hóa kết hợp với báo cáo trƣớc vai trò nhƣ tác dụng sinh học S boulardii [37, 54] lựa chọn chủng nấm men S boulardii PLCP để thực nghiên cứu khả phối hợp chủng vi sinh vật probiotic Khả phối hợp chủng L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP đƣợc tiến hành dựa trên: khả ức chế dịch nuôi cấy vi sinh vật probiotic lựa chọn khả ức chế lẫn ức chế vi sinh vật gây bệnh kiểm định hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn môi trƣờng lỏng 3.4.1 Khả ức chế dịch nuôi cấy vi sinh vật probiotic lựa chọn Các chủng vi sinh vật đƣợc hoạt hóa 24 môi trƣờng MRS lỏng (đối với L acidophilus VAST), NB (đối với Bacillus sp D7) Hansen (đối với S boulardii PLCP) Sau 24 hoạt hóa đem ly tâm tách sinh khối thu dịch (supernatant), kiểm chứng môi trƣờng NB vô trùng Khả ức chế dịch nuôi cấy vi sinh vật probiotic lựa chọn đƣợc xác định theo phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch (mục 2.2.5) Kết thu đƣợc thể bảng 3.6 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 65 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Bảng 3.6: Khả ức chế dịch nuôi cấy vi sinh vật probiotic lựa chọn Đƣờng kính vòng ức chế (mm) Vi sinh vật probiotic L acidophilus VAST L acidophilus VAST - Bacillus sp D7 25 S boulardii PLCP Bacillus sp D7 - S boulardii PLCP 0 - Theo bảng 3.6 cho thấy dịch vi khuẩn Bacillus sp D7 khả ức chế sinh trƣởng phát triển L acidophilus VAST S boulardii PLCP Nhƣ vậy, chất đƣợc sản sinh vi khuẩn Bacillus sp D7 sau 24 nuôi cấy khả ức chế L acidophilus VAST S boulardii PLCP Dịch nuôi cấy thu đƣợc nấm men S boulardii PLCP khả ức chế sinh trƣởng phát triển L acidophilus VAST Bacillus sp D7 Nhƣ vậy, chất đƣợc sản sinh S boulardii PLCP sau 24 nuôi cấy khả ức chế L acidophilus VAST Bacillus sp D7 Dịch vi khuẩn L acidophilus VAST khả ức chế phát triển nấm men S boulardii PLCP, nhiên lại ức chế tƣơng đối mạnh mẽ đến sinh trƣởng phát triển vi khuẩn Bacillus sp D7 với đƣờng kính vòng ức chế 25mm 3.4.2 Khả ức chế lẫn ức chế vi sinh vật gây bệnh hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn môi trƣờng lỏng Theo kết mục 3.3 cho thấy L acidophilus VAST có khả ức chế S Typhimurium E coli tƣơng đối mạnh mẽ, nhiên Bacillus sp D7 S boulardii PLCP không cho thấy khả ức chế loại vi khuẩn kiểm định Do vậy, tiến hành xác định khả ức chế lẫn ức chế S Typhimurium E coli hỗn hợp vi sinh vật L acidophilus VAST, Bacillus sp D7, S boulardii PLCP môi trƣờng lỏng nhằm đánh giá khả ức chế lẫn ba chủng vi sinh vật probiotic lựa chọn nhƣ khả ức chế S Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 66 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Typhimurium E coli L acidophilus VAST có bị ảnh hƣởng vi khuẩn Bacillus sp D7 nấm men S boulardii PLCP hay chất đƣợc sản sinh từ chúng hay Các chủng vi sinh vật probiotic đƣợc lựa chọn S Typhimurium, E coli đƣợc hoạt hóa 24 môi trƣờng MRS (đối với L acidophilus VAST), NA (đối với Bacillus sp D7, S Typhimurium E coli), Hansen (đối với S boulardii PLCP), sau tiến hành đối kháng trực tiếp Hiệu ức chế S Typhimurium E coli tƣơng tác trực tiếp với L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP đƣợc xác định theo phƣơng pháp mục 2.2.7 Kết thu đƣợc thể hình 3.5 hình 3.6 Mật độ tế bào vi sinh vật (logCFU/ml) 12 10 L acidophilus VAST S boulardii PLCP Lƣợng vsv ban đầu Bacillus sp D7 S Typhimurium Lƣợng vsv sau 24 đối kháng Hình 3.5: Khả ức chế lẫn ức chế S Typhimurium hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn môi trƣờng lỏng Theo hình 3.5 cho thấy L acidophilus VAST có khả ức chế hoàn toàn 105 CFU/ml S Typhimurium sau 24 đối kháng Nhƣ vậy, khả ức chế S Typhimurium không bị thay đổi phối hợp với Bacillus sp D7, S boulardii PLCP chất sản sinh hai vi khuẩn khả làm ảnh hƣởng đến hiệu kháng S Typhimurium L acidophilus VAST Sau 24 đối kháng môi trƣờng lỏng mật độ tế bào Bacillus sp D7 S boulardii PLCP giảm so với lƣợng ban đầu Cụ thể với Bacillus sp D7 mật độ Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 67 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm tế bào giảm trung bình 3,57 log CFU/ml, S boulardii PLCP mật độ tế bào giảm Mật độ tế bào vi sinh vật (logCFU/ml) trung bình 1,23 log CFU/ml 12 10 L acidophilus S boulardii PLCP Bacillus sp D7 E coli VAST Lƣợng vsv ban đầu Lƣợng vsv sau 24 đối kháng Hình 3.6: Khả ức chế lẫn ức chế E coli hỗn hợp vi sinh vật probiotic lựa chọn môi trƣờng lỏng Theo hình 3.9 cho thấy L acidophilus VAST có khả ức chế hoàn toàn 105 CFU/ml E coli sau 24 đối kháng Nhƣ vậy, khả ức chế E coli không bị thay đổi phối hợp với Bacillus sp D7, S boulardii PLCP chất sản sinh hai vi sinh vật khả làm ảnh hƣởng đến hiệu kháng S Typhimurium L acidophilus VAST Sau 24 đối kháng môi trƣờng lỏng mật độ tế bào Bacillus sp D7 S boulardii PLCP giảm so với lƣợng ban đầu Cụ thể Bacillus sp D7 mật độ tế bào giảm trung bình 3,1 log CFU/ml S boulardii PLCP mật độ tế bào giảm trung bình 1,73 log CFU/ml Nhƣ vậy, L acidophilus VAST có khả ức chế hoàn toàn 105 CFU/ml S Typhimurium, E coli sau 24 đối kháng khả ức chế S Typhimurium, E coli không bị thay đổi phối hợp với Bacillus sp D7, S boulardii PLCP nhƣ chất sản sinh hai vi sinh vật không làm ảnh hƣởng đến hiệu kháng S Typhimurium, E coli vi khuẩn L acidophilus VAST Tuy nhiên, sau 24 đối kháng với S Typhimurium E coli mật độ tế bào vi khuẩn Bacillus sp D7 giảm tƣơng đối mạnh mẽ so với lƣợng ban đầu Nguyên nhân L acidophilus VAST sản sinh axit lactic với hàm lƣơng tƣơng đối Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 68 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm cao ức chế phần vi khuẩn Bacillus sp D7, L acidophilus VAST có khả sản sinh số hoạt chất kháng khuẩn khác nguyên nhân ức chế làm giảm khả sống sót Bacillus sp D7 Trong nghiên cứu Abdelkader Mezaini Dutnont [42, 56], sáu loại vi khuẩn Lactobacillus nghiên cứu có khả ức chế vi khuẩn Gram dƣơng có B subtilis Các tác giả rằng, nguyên nhân chủng Lactobacillus có khả ức chế vi khuẩn gram dƣơng vi khuẩn có khả sản sinh axit lactic bacteriocin Đối chiếu với kết nghiên cứu trƣớc khả sống sót vi khuẩn Bacillus sp D7 tƣơng tác trực tiếp với L acidophilus VAST S boulardii PLCP tƣơng đối cao Jois Bisson cộng năm 2010 [18] nghiên cứu tiền lâm sang động vật thử nghiệm với ba công thức khác nhau: công thức chế phẩm sinh học vi khuẩn (L rhamnosus, L acidophilus, Bifidobacterium), nấm men S boulardii hỗn hợp probiotic (L rhamnosus, L acidophilus, Bifidobacterium S boulardii) để làm giảm E coli tiêu chảy chuột Kết thu đƣợc chứng minh với ba công thức thử nghiệm khác làm giảm đáng kể lƣợng E coli gây bệnh chuột Tuy nhiên, động vật sử dụng công thức chế phẩm sinh học vi khuẩn S boulardii cho thấy hiệu thấp sử dụng hỗn hợp chủng vi sinh vật probiotic Do đó, việc kết hợp vi sinh vật probiotic có nhiều đặc tính probiotic có lợi chế phẩm đóng vai trò quan trọng động vật Nhƣ vậy, khả phối hợp chủng vi sinh vật probiotic quan trọng góp phần cải thiện sức khỏe nhƣ chất lƣợng sản phẩm vật nuôi Trong nghiên cứu chúng tôi, phối hợp L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP với tỷ lệ sống sót tƣơng đối cao, điều chứng minh tiềm lớn cho chế phẩm sinh học động vật sở để thực nghiên cứu sâu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 69 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN Các chủng Lactobacillus nghiên cứu có khả sinh axit cao 9/11 chủng có khả sinh axit cao với hàm lƣợng 17,64 – 19,04 (g/l); thể khả kháng S Typhimurium, S aureus, E coli với đƣờng kính vòng kháng khuẩn khoảng 14,25 – 33,50mm Bốn chủng vi khuẩn Bacillus nghiên cứu có khả sinh enzyme protease Chỉ vi khuẩn Bacillus sp D7 có khả sinh ba loại enzyme tiêu hóa (protease, amylase, cellulase), đƣờng kính vòng thủy phân 15,50 – 18,75 mm Khả sống sót điều kiện đƣờng ruột giả lập chủng vi sinh vật probiotic tƣơng đối cao, tỷ lệ sống sót trung bình đạt 80% Ba chủng vi sinh vật probiotic tiềm năng: L acidophilus VAST, Bacillus sp D7 S boulardii PLCP đƣợc lựa chọn phối hợp dạng lỏng đảm bảo đƣợc khả sống sót ức chế vi sinh vật gây bệnh kiểm định HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Các kết thu đƣợc tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi: - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi quy mô phòng thí nghiệm - Đánh giá hiệu in vivo chế phẩm probiotic động vật Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 70 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài Liệu Tiếng Việt: 10 11 12 13 Bạch Quốc Thắng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú Nguyễn Ngọc Thiện (2010), "Khảo sát số đặc tính vi khuẩn Lactobacillus điều kiện in vitro ", Khoa học Công nghệ kỹ thuật thú y, 17(6) Hoàng Quốc Khánh Phạm Thị Lan Thanh (2011), "Phân lập, định danh xác định chủng Lactobacillus có tiềm probiotic từ ngƣời ", Phát triển khoa học công nghệ 14(2), - 10 Khuất Hữu Thanh Bùi Văn Đạt (2010), "Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus để tạo chế phẩm sinh học sử dụng nuôi trồng thủy sản", Tạp chí khoa học công nghệ 48(5), 57 - 63 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng Chi, Lê Lan, Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men 2005: Nhà xuất khoa học kĩ thuật Hà Nội Lƣơng Đức Phẩm, Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm 2000: Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn La Anh (2006), "Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài : Nghiên Cứu Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Xử Lý Môi Trƣờng Nuôi Tôm Công Nghiệp Năng Suất Cao ", Viện Công Nghiệp Thực Phẩm - Bộ Công Nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Giáo trình vi sinh vật học, 1962: Đại học tổng hợp - Hà nội Nguyễn Ngọc Tuân, Vệ Sinh Thịt 2002: Nhà xuất Nông Nghiệp - Chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Diễm Hƣơng Đỗ Thị Bích Thủy (2012), "Xác định khảo sát số tính chất có lợi chủng Lactobacillus fementum DC1 phân lập từ dƣa cải huế ", Tạp chí khoa học - Đại Học Huế 71(2), 177 - 187 Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Duƣơng Văn Hợp Vũ Thành Lâm (2009), "Phân lâp, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi ", Tạp chí Khoa Học Công Nghệ Chăn Nuôi 16(6), - 12 Trung tâm chuẩn đoán cố vấn thú y (2006), "Kết kháng sinh đồ heo ", Công ty cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam Vũ Duy Giảng Probiotic chăn nuôi heo: Cơ chế tác dụng cách sử dụng (http://uv-vietnam.com.vn/NewsDetail.aspx?newsId=1878) 2014 Vũ Thanh Thảo, Nguyễn Minh Thái, Nguyễn Thị Linh Giang, Trần Hữu Tâm Đông, Trần Cát (2014), "Nghiên cứu đặc tính probiotic Bacillus subtilis BS02", Tạp chí Y Học Thực Hành 907(3), 21 - 25 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 71 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Tài Liệu Tiếng Anh: 14 Ali F S, Saad O A O, Salwa A Hussein (2013), "Antimicrobial activity of probiotic bacteria", Egypt Acad J Biolog Sci, 5(2) 21-34 15 Alistair W.G Waugh, Rae Foshaug, Sarah Macfarlane, Jason SG Doyle, Thomas A Churchill, Beate C Sydora Richard N Fedorak (2009), "Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment in an animal model of irritable bowel syndrome", Microbial Ecology in Health and Disease, 21 33 - 37 16 Araya Magdalena, Morelli Lorenzo, Reid Gregor, Sanders Mary Ellen, Stanton Catherine, Pineiro Maya Ben Embarek Peter (2002), "Probiotics in food : Health and nutritional properties and guidelines for evaluation", Food and Agricultural Organization of the United Nations and World Health Organization 17 Balamuralikrishnan Balasubramanian, Tianshui Li In Ho Kim (2016), "Effects of suppplementing growing - finishing pig with Bacillus spp probiotic on growth performance and meat - carcass grade quanlity traits ", Revista Brasileira de Zootecnia 45(3), 93 - 100 18 Bisson, J F., Hidalgo, S., Rozan, P Messaoudi, M (2010), "Preventive effects of different probiotic formulations on travelers' diarrhea model in wistar rats : preventive effects of probiotics on TD", Dig Dis Sci, 55(4), 9119 19 C Stanton, R.P Ross, G Fitzgerald K Collins (2001), "Application of Probiotic Bacteria to Functional Foods", Operational Programme for Industrial Development, 31 4527 - 4840 20 C T Collier, J A Carroll, M A Ballou, J D Starkey J C Sparks (2011), "Oral administration of Saccharomyces cerevisiae boulardii reduces mortality associated with immune and cortisol responses to Escherichia coli endotoxin in pigs ", Journal of animal science and biotechnology, 89 52 - 58 21 Cutting, S M (2011), "Bacillus probiotics", Food Microbiol, 28(2), 214-20 22 Czerucka, D., Piche, T Rampal, P (2007), "Review article: yeast as probiotics – Saccharomyces boulardii", Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 26(6), 767-778 23 Daniel J O'Sullivan Martin J.Kullen (1998), "Tracking of probiotic bifidobacteria in the intestine", International Dairy Journal 8(5 - 6), 513 - 525 24 Daniela Eliza Marin, Tanaru Motiu, Manda (2010), "Effect of Lactobacillus feed supplement in deoxynivalenol intoxicated piglets", Archiva Zootechnica 13(1), 12 - 22 25 De Angelis, M., Siragusa, S., Berloco, M., Caputo, L., Settanni, L., Alfonsi, G., Amerio, M., Grandi, A., Ragni, A Gobbetti, M (2006), "Selection of potential probiotic lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding", Res Microbiol, 157(8), 792-801 26 De Keersmaecker, S C., Verhoeven, T L., Desair, J., Marchal, K., Vanderleyden, J Nagy, I (2006), "Strong antimicrobial activity of Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 72 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella Typhimurium is due to accumulation of lactic acid", FEMS Microbiol Lett, 259(1), 89-96 Desislava Teneva, Zapryana Denkova, Rositsa Denkova, Remzi Cholakov Goranov, Bogdan (2014), "Characteristics of lactic acid bacteria strains isolated from salad dressing", Union of Scientists in Ruse, 53 51 - 54 Duc, Le H., Hong, Huynh A., Barbosa, Teresa M., Henriques, Adriano O Cutting, Simon M (2004), "Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use", Applied and Environmental Microbiology, 70(4), 21612171 Emese Both, Eva Gyorgy, Csaba Zoltan Kibedi Szabo, Eva Tamas, Beata Abraham, Ildiko Miklossy Lanyi Szabolcs "Acid and bile tolerance, adhesion to epithelial cells of probiotic microorganisms" University Politehnica of Bucharest Scientific Bulletin, Series B 2010 FAO/WHO (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotics in food", Available at: www.who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.pdf (accessed 04/09/2013) I Taranu, D.E Marin, A Untea, P Janczyk, M Motiu B Souffrant, R.D (2012), "Effect of dietary natural supplements on immune response and mineral bioavailability in piglets after weaning", Czech J Anim Sci, 57(7), 332 J.H Cho, P.Y Zhao I.H, Kim (2011), "Probiotics as a Dietary Additive for Pigs: A Review", Journal of Animal and Veterinary Advances 10(16), 2127 2134 Jorge Olmos J Paniagua-Michel (2014), "Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds for Aquaculture", Microbial and Biochemical Technology, 6(7), 361 - 365 Jose Luis Balcazar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, David Cunningham, Daniel Vendrell Jose Luis Muzquiz (2006), "The role of probiotics in aquaculture", Veterinary Microbiology, 114(3 - 4), 173–186 Justino, P F., Melo, L F., Nogueira, A F., Morais, C M., Mendes, W O., Franco, A X., Souza, E P., Ribeiro, R A., Souza, M H Soares, P M (2015), "Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice", Cancer Chemother Pharmacol, 75(3), 559-67 K Azizpour , S Bahrambeygi , S Mahmoodpour , A Azizpour , S Mahmoodpour , S Bahrambeygi and K Azizpour (2009), "History and Basic of Probiotics", Journal of Biological Sciences, 4(4), 409 - 426 Kelesidis, Theodoros, Pothoulakis Charalabos (2012), "Efficacy and safety of the probiotic Saccharomyces boulardii for the prevention and therapy of gastrointestinal disorders", Therapeutic Advances in Gastroenterology, 5(2), 111-125 Kingsley C Anukam PhD, MHPM Gregor Reid PhD, MBA, ARM, CCM (2007), "Probiotics: 100 years (1907-2007) after Elie Metchnikoff’s Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 73 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Observation", Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, 466 - 474 M.R.P Briggs S.J Fvnge - Smith (1994), "A nutrient budget of some intensive marine shrimp ponds in Thailand", Institute of Aquaculture, 25(8), 789–811 Mami Anas, Henni Jamal Eddine Kihal Mebrouk (2008), "Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk Against Staphylococcus aureus", World Journal of Dairy & Food Sciences, 3(2), 39-49 Mary Ellen Sanders (2000), "Considerations for Use of Probiotic Bacteria to Modulate Human Health", The Journal of Nutrition, 130 384 – 390 Narbutaite V, Narbad A, Juodeikiene G Dutnont A "Antimicrobial activity of lactic acid bacteria against Bacillus subtilis EC1524 and their sensitivity to fungal enzymes" Osijek 2007 Faculty of Food Technology, University of Josip Juraj Strossmayer Nicolae corcionivoschi, Dan Drinceanu, Lavinia Stef, Ioan Luca, Călin Julean Mingyart, Dr Oana (2010), "Probiotics - Identification and ways of action ", Innovative Romanian Food Biotechnology, 1-11 Prieur, D.; , Mevel, G.; , Nicolas, J.L.; , Plusquellec, A.; Vigneulle, M (1990), "Interactions between bivalve molluscs and bacteria in the marine environment", Oceanography and Marine Biology, 28 277-352 R S S WU (1995), "The Environmental Impact of Marine Fish Culture: Towards a Sustainable Future", Marine Pollution Bulletin,, 31 pp 159-166 Soccol, Carlos Ricardo; , Vandenberghe, Luciana Porto de Souza; , Spier, Michele Rigon; , Medeiros, Adriane Bianchi Pedroni; , Yamaguishi, Caroline Tiemi; , Lindner, Juliano De Dea; , Pandey, Ashok; Thomaz-Soccol, Vanete (2010), "The Potential of Probiotics: A Review", Food Technology & Biotechnology, 48(4), 413 - 434 Son Chu-Ky, Thi-Khanh Bui, Tien-Long Nguyen Phu-Ha Ho (2014), "Acid adaptation to improve viability and X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase activity of the probiotic bacterium Lactobacillus fermentum HA6 exposed to simulated gastrointestinal tract conditions", International Journal of Food Science and Technology, 49 565–570 Suiryanrayna, M V Ramana, J V (2015), "A review of the effects of dietary organic acids fed to swine", J Anim Sci Biotechnol, 45 Teruo Higa (2002), "The Technology of effective microorganisms - Concept and philosophy", Royal agricultural college ,Cirencester, UK Ulrich sonnenborn Jurgen schulze (2009), "The non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917 – features of a versatile probiotic", Microbial Ecology in Health and Disease, 21 122–158 Van Winsen, René L., Urlings, Bert A P., Lipman, Len J A., Snijders, Jos M A., Keuzenkamp, David, Verheijden, Jos H M van Knapen, Frans (2001), Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 74 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm "Effect of Fermented Feed on the Microbial Population of the Gastrointestinal Tracts of Pigs", Applied and Environmental Microbiology, 67(7), 3071-3076 Yang, F., Hou, C., Zeng, X Qiao, S (2015), "The use of lactic Acid bacteria as a probiotic in Swine diets", Pathogens, 4(1), 34-45 Yang, J J., Niu, C C Guo, X H (2015), "Mixed culture models for predicting intestinal microbial interactions between Escherichia coli and Lactobacillus in the presence of probiotic Bacillus subtilis", Benef Microbes, 6(6), 871-7 Zanello, G., Meurens, F., Berri, M Salmon, H (2009), "Saccharomyces boulardii effects on gastrointestinal diseases", Curr Issues Mol Biol, 11(1), 47-58 Barbosa, Teresa M., Serra, Cláudia R., La Ragione, Roberto M., Woodward, Martin J Henriques, Adriano O (2005), "Screening for Bacillus Isolates in the Broiler Gastrointestinal Tract", Applied and Environmental Microbiology, 71(2), 968-978 Mezaini, Abdelkader, Chihib, Nour-Eddine, Dilmi Bouras, Abdelkader, Nedjar-Arroume, Naima Hornez, Jean Pierre (2009), "Antibacterial Activity of Some Lactic Acid Bacteria Isolated from an Algerian Dairy Product", Journal of Environmental and Public Health, 2009 678495 Porter, C B., Krom, M D., Robbins, M G., Brickell, L Davidson, A (1987), "Ammonia excretion and total N budget for gilthead seabream (Sparus aurata) and its effect on water quality conditions", Aquaculture, 66(3), 287297 Schillinger, U., Geisen, R Holzapfel, W H (1996), "Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods", Trends in Food Science & Technology, 7(5), 158-164 Slover, Christine M Danziger, Larry (2008), "Lactobacillus: a Review", Clinical Microbiology Newsletter, 30(4), 23-27 Upadhaya, S D., Kim, S C., Valientes, R A Kim, I H (2015), "The Effect of Bacillus-based Feed Additive on Growth Performance, Nutrient Digestibility, Fecal Gas Emission, and Pen Cleanup Characteristics of Growing-finishing Pigs", Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 28(7), 999-1005 Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 75 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm PHỤ LỤC: MỘT SỐ HÌNH ẢNH Hình 3.8: Khả kháng S aureus chủng vi sinh vật probiotic Hình 3.9: Khả kháng S Typhimurium chủng vi sinh vật probiotic Hình 3.10: Khả kháng E coli chủng vi sinh vật probiotic Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 76 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh Học Và CN Thực Phẩm Bacillus sp D7 MYP S boulardii PLCP SDA - C Hình 3.11: Bacillus sp D7 S boulardii PLCP môi trƣờng chọn lọc L acidophilus VAST E coli Endo PCA – BCP S Typhimurium XLT4 Hình 3.12: L acidophilus VAST, E coli S Typhimurium môi trƣờng chọn lọc Lê Thị Hồng Vân – Lớp 15BCNTP.KH Page 77 Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học ... bệnh, tránh lạm dụng kháng sinh ngành chăn nuôi Nghiên cứu nhằm đánh giá lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm hƣớng tới ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi 16 chủng vi sinh vật probiotic bao... đƣợc sản xuất thƣờng dạng đơn chủng có nghiên cứu tƣơng tác chủng dạng lỏng Do chọn đề tài: Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic tiềm ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi nhằm lựa chọn. .. BÁCH KHOA HÀ NỘI - - LÊ THỊ HỒNG VÂN NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN VI SINH VẬT PROBIOTIC TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Thực