BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ PHƯƠNG MAI ÁP DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH VÀ SAU SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS TS Đặng Thị Thu BS Ngô Diễm Ngọc Hà Nội - 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Giáo sư Tiến sỹ Đặng Thị Thu Thạc sỹ Bác sỹ Ngô Diễm Ngọc, người thầy tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, động viên thời gian học tập nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, cán bộ, nhân viên Viện Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội dành cho động viên hỗ trợ vô quý báu trình học tập làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám đốc Bệnh viện Nhi trung ương, Khoa Nội Tiết- Chuyển hoá- Di truyền phòng ban chức Bệnh viện Nhi trung ương cổ vũ tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới đồng nghiệp khoa Di truyền Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn bệnh nhi gia đình bệnh nhi, người góp phần lớn cho thành công đề tài Cuối cùng, vô biết ơn chăm sóc, động viên cha mẹ, chồng con, quan tâm giúp đỡ tình cảm quý báu người thân, bạn bè dành cho Nguyễn Thị Phương Mai LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Những số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Nguyễn Thị Phương Mai DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ACTH Adrenocorticotropic hormone CRH Corticotropin- releasing hormone DNA Desoxyribonucleic acid DNAts DNA tổng số DHEA Dehydroepiandrosteron DOC Deoxycorticosteron FSH Follicule stimulating hormone GC Glucocorticoid MC Mineralocorticoid MM Mất muối NHĐT Nam hoá đơn NST Nhiễm sắc thể NTCHDT Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền PCR Polymerase chain reaction TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh TT Thượng thận 11β-OH 11β- hydroxylase 17-OHP 17- hydroxycorticosteroid 21-OH 21- hydrozyprogesteron 8bpEx3 base pairs exon MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Lịch sử nghiên cứu .3 1.1.1 Thế giới 1.1.2 Việt Nam .4 1.2 Tuyến TT hormone vỏ TT .6 1.2.1 Bào thai học 1.2.2 Cấu tạo tuyến TT 1.2.3 Cấu tạo vỏ thượng thận 1.2.4 Cơ chế tác dụng hormone vỏ TT 1.2.5 Tác dụng hormone vỏ TT .8 1.2.5.1 Tác dụng cortisol .8 1.2.5.2 Tác dụng aldosteron .8 1.2.3.3 Tác dụng hormone sinh dục nam androgen 1.3 Các enzym tham gia vào tổng hợp corticoid .10 1.4 Hội chứng TSTTBS 11 1.4.1 TSTTBS thiếu hụt enzym 21 hydroxylase 12 1.4.1.1 Sinh bệnh học .12 1.4.1.2 Biểu lâm sàng 12 1.4.2 TSTTBS thiếu enzym khác 13 1.4.2.1 TSTTBS thiếu enzym cholesteron desmolase 13 1.4.2.2 TSTTBS thiếu enzym 17α- hydroxylase (17- OH) .14 1.4.2.3 TSTTBS thiếu hụt enzym 3β- hydroxysteroid dehydrogenase .14 1.4.2.4 TSTTBS thiếu hụt enzym 11β- hydroxylase 14 1.4.2.5 TSTTBS thiếu hụt enzym 18- dehydrogenase 14 1.5 Cơ sở di truyền TSTTBS thiếu hụt 21- OH .15 1.6 Những tiến chẩn đoán 16 1.7 Chẩn đoán điều trị trước sinh 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.2 Hoá chất sử dụng 19 2.3 Trang thiết bị 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.1.1 Quy trình tách chiết DNA 20 2.4.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi 20 2.4.1.2 Tách chiết DNA tổng số từ dòng tế bào dịch ối sau nuôi cấy 20 2.4.1.3 Xác định nồng độ DNA tổng số 21 2.4.2 Phương pháp PCR sàng lọc đột biến thường gặp gen CYP21A2 21 2.4.2.1 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến PRO 30 LEU (Exon 1) 22 2.4.2.2 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến nucleotide (Exon 3) .22 2.4.2.3 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến ILE172ASP (Exon 4) 23 2.4.2.4 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm exon (Exon Cluster) 24 2.4.2.5 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L (Exon 7) 24 2.4.3 Phương pháp điện di Agarose 25 2.4.4 Phương pháp Multiplex Ligation- dependent probe amplification 26 2.4.5 Phương pháp giải trình tự gen 28 2.4.5.1 Phản ứng PCR khuếch đại gen CYP21A2: 28 2.4.5.2 Tinh sản phẩm PCR .30 2.4.5.3 PCR mồi đơn 30 2.4.5.4 Kết tủa cồn 32 2.4.5.5 Phân tích trình tự gen 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .33 3.1 Lựa chọn phương pháp SHPT phát đột biến gen CYP21A2 .33 3.1.1 Phương pháp PCR sàng lọc đột biến điểm .33 3.1.1.1 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L (Exon 1) .34 3.1.1.2 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến nucleotide 35 3.1.1.3 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N (Exon 4) .36 3.1.1.4 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm exon .37 3.1.1.5 Phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L .39 3.1.3 Phương pháp Multiplex Ligation- dependent Probes amplification 40 3.1.4 Phương pháp giải trình tự gen 44 3.2 Chẩn đoán sau sinh trước sinh cho bệnh TSTTBS .46 3.2.1 Nghiên cứu quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS 46 3.2.2 Nghiên cứu quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS 50 3.2.2.1 Gia đình 50 3.2.2.2 Gia đình 51 KẾT LUẬN .54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tên enzym tên gen tương ứng .10 Bảng 3.1 Độ lớn vị trí probes phản ứng MLPA 40 Bảng 3.2 Thứ tự peak sau phân tích phần mềm Coffalyser .42 Bảng 3.3 Tỷ lệ tín hiệu với dạng đột biến 43 Bảng 3.4 Đột biến tìm thấy gia đình TSTTBS 47 Bảng 3.5 Tỷ lệ kiểu đột biến gen CYP21A2 .48 Bảng 3.6 So sánh tỷ lệ đột biến với nghiên cứu giới .49 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vị trí tuyến TT cấu tạo vỏ TT Hình 1.2 Cơ chế tác dụng hormone vỏ TT Hình 1.3 Sinh tổng hợp hormone vỏ thượng thận 11 Hình 1.4 Vị trí gen CYP21A2 nhiễm sắc thể số 15 Hình 1.5 Các đột biến thường gặp có liên quan đến kiểu hình 16 Hình 2.1 Trình tự mẫu dò MLPA 26 Hình 2.2 Sơ đồ vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 .27 Hình 2.3 Lai đầu dò 27 Hình 2.4 Ghép nối đầu dò 27 Hình 2.5 Khuếch đại 28 Hình 2.6 Phương pháp giải trình tự gen CYP21A2 28 Hình 3.1 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến P30L 34 Hình 3.2 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến nucleotide 35 Hình 3.3 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến I172N 36 Hình 3.4 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến cụm Exon 38 Hình 3.5 Điện di đồ phản ứng PCR sàng lọc đột biến V281L .39 Hình 3.6 Kết MLPA mẫu không mang đột biến .42 Hình 3.7 Điện đồ sản phẩm PCR agarose 1% 44 Hình 3.8 Điện đồ sản phẩm PCR agarose 1% 45 Hình 3.9 Quy trình chẩn đoán sau sinh bệnh TSTTBS 49 Hình 3.10 Kết MLPA sàng lọc đột biến thường gặp thai nhi 51 Hình 3.11 Trình tự vùng promotor gen giả CYP21A2 .51 Hình 3.12 Kết MLPA sàng lọc đột biến thường gặp thai nhi 52 Hình 3.13 Thai nhi Dị hợp tử đột biến P30L, dị hợp với đột biến Intron 2G 52 Hình 3.14 Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS 53 MỞ ĐẦU Bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) bệnh di truyền lặn NST thường (26) Cơ chế bệnh sinh rối loạn tổng hợp hormone vỏ thượng thận thiếu hụt enzym tổng hợp corticosteroid (4), (8), (9), (24) Bệnh TSTTBS bệnh di truyền chữa khỏi với dấu hiệu suy thượng thận cấp dẫn đến tử vong thể muối hay trẻ có biểu nam tính hoá trẻ gái, giả dậy sớm trẻ trai… gây ảnh hưởng nặng nề đến phát triển chiều cao, sinh dục, sinh sản tâm lý (5), (27), (29) Trẻ mắc bệnh phụ thuộc vào điều trị bổ sung hydrocortisol suốt đời, ảnh hưởng lớn đến trình phát triển tâm lý thể chất, phải chịu nhiều biến chứng bệnh thuốc trình điều trị (3), (6), (7), (12) Việc phòng bệnh tốt chẩn đoán trước sinh cho gia đình có tiền sử sinh mắc TSTTBS (4) Vì vậy, muốn chẩn đoán trước sinh cho thai nhi việc xác định kiểu gen đột biến di truyền gia đình Chẩn đoán xác định bệnh TSTTBS phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định kiểu đột biến gen CYP21A2 gia đình người bệnh, từ giúp xác định kiểu đột biến gen CYP21A2 thai nhi Hiện nay, Khoa Nội tiết- Chuyển hoá- Di truyền, Bệnh viện Nhi trung ương quản lý khoảng 500 gia đình có đầu mắc bệnh TSTTBS, tiếp nhận khoảng 30 trường hợp mắc năm Hầu hết gia đình độ tuổi sinh đẻ, dó nhu cầu tiếp tục sinh khoẻ mạnh họ lớn Khoa Di truyền Sinh học Phân Tử - Bệnh Viện Nhi TƯ, từ đầu năm 2009, đơn vị nghiên cứu triển khai kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán trước sau sinh bệnh TSTTBS biến thường gặp trẻ mắc TSTTBS thể muối Kiểu gen phù hợp với kiểu đột biến tìm thấy bố mẹ MLPA sàng lọc đột biến thường gặp: Hình 3.10 Kết MLPA sàng lọc đột biến thường gặp thai nhi Kết MLPA cho thấy thai nhi trẻ gái, có đột biến đồng hợp tử đột biến đoạn 30Kb (Exon hybrid) Kết giải trình tự gen: Kết giải trình tự gen cho thấy gen CYP21A2 thai nhi mang đột biến đồng hợp P30L (Exon 1), Intron 2G (Intron 2), Mất đoạn 8bp (Exon 3), đột biến I172N (Exon 4) Hình 3.11 Trình tự vùng promotor gen giả CYP21A2 Vùng Promotor có đột biến đồng hợp vị trí -113, -120, -123 Vùng Promotor trình tự promotor gen giả CYP21A1P Như vậy, thai nhi mang đột biến đồng hợp đoạn 30Kb (Exon hybrid) Kết phù hợp với kết MLPA 3.2.2.2 Gia đình Gia đình thứ hai có gái chẩn đoán mắc bệnh TSTTBS lúc tháng tuổi điều trị BV Nhi TƯ Xét nghiệm giải trình tự gen phát thấy bố 51 dị hợp tử đột biến đoạn 30Kb mẹ mang đột biến dị hợp tử Intron 2’g’ Con gái đầu phát thấy mang hai đột biến Đây kiểu đột biến kết hợp thường gặp bệnh nhân TSTTBS thể muối () Kiểu đột biến phù hợp với kiểu hình lâm sàng bệnh nhân Sau tiến hành xét nghiệm cho thấy thai nhi gia đình thứ hai trẻ trai có kiểu gen dị hợp tử đột biến đoạn 30Kb người bình thường mang gen đột biến Kết phù hợp với kiểu gen tìm thấy gia đình MLPA sàng lọc đột biến thường gặp: 2.5 c c c c c c c c c c c c c c c c c c c 06-032.2 CREBL1 06-032.2 TNXBexon 01 06-032.2 TNXBexon 15 06-032.2 TNXBexon 32 06-032.1 CYP21A2 exon 08 06-032.1 CYP21A2 exon 06 06-032.1 CYP21A2 exon 04 06-032.1 CYP21A2 exon 03 06-032.1CYP21A2 exon 01 06-032.1 C4B 06-032.1 CYP21A2 exon 10 06-032.1 CYP21A1Pexon 02 0.5 06-032.1 C4A 06-032.1 CYP21A1Pexon 01 1.5 Hình 3.12 Kết MLPA sàng lọc đột biến thường gặp thai nhi Kết MLPA cho thấy thai nhi gia đình có dị hợp đột biến đoạn 30Kb (Exon hybrid) thai nhi trẻ trai Kết giải trình tự gen: Intron 2G P30L Hình 3.13 Thai nhi Dị hợp tử đột biến P30L, dị hợp với đột biến Intron 2G Giải trình tự gen cho thai nhi phát thấy thai nhi có dị hợp đột biến đoạn 30Kb, mang đột biến giống bố Như kết luận thai nhi trẻ 52 trai, mang đột biến dị hợp đoạn 30Kb - người bình thường mang gen đột biến Kết phù hợp với kết MLPA Tại Việt Nam, chưa có sở sản khoa lấy mẫu gai rau để tiến hành xét nghiệm thời gian thai sớm (11 tuần) Vì vậy, người mẹ biết mang thai phải tư vấn để điều trị thuốc sớm tốt có kết xét nghiệm phân tử Quá trình chọc hút nước ối tiến hành tuần thai thứ 16 đến 18 Quy trình chọc hút dịch ối đơn giản, dễ tiến hành, an toàn cho bà mẹ thai nhi Các gia đình muốn chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS phải tiến hành chẩn đoán kiểu đột biến trước người mẹ mang thai Bà mẹ tư vấn di truyền thời điểm mang thai điều trị thuốc thời gian mang thai, sau tiến hành chẩn đoán trước sinh với quy trình sau: Hình 3.14 Quy trình chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS Lần Bệnh viện Nhi Trung ương, quy trình chẩn đoán sau sinh trước sinh áp dụng để chẩn đoán sớm bệnh TSTTBS, đảm bảo độ xác, độ đặc hiệu cao, giảm chi phí lại cho người bệnh Việc chẩn đoán trước sinh sớm bệnh TSTTBS sở cho trình điều trị trước sinh, làm giảm tỷ lệ bất thường phận sinh dục cho thai nhi nữ, giảm tỷ lệ phẫu thuật cho thai nữ sau sinh 53 KẾT LUẬN Sau tiến hành nghiên cứu, đưa số kết luận sau: Với kỹ thuật PCR sàng lọc đột biến thường gặp, kỹ thuật giải trình tự gen, kỹ thuật MLPA, lựa chọn kỹ thuật MLPA giải trình tự gen để phát đột biến đoạn lớn, đột biến điểm gen CYP21A2 chẩn đoán trước sinh sau sinh bệnh TSTTBS Đây kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao Đã ứng dụng kỹ thuật MLPA giải trình tự gen chẩn đoán sau sinh 10 gia đình có tiền sử đầu mắc bệnh TSTTBS chẩn đoán trước sinh cho 02 thai nhi cho kết xác có độ đặc hiệu cao Bước đầu đưa quy trình chẩn đoán bệnh TSTTBS kỹ thuật sinh học phân tử trên: ƒ Quy trình chẩn đoán sau sinh: 2ml máu ngoại vi → Tách, tinh DNAts → Phản ứng MLPA → Giải trình tự gen → Kết kiểu gen đột biến gen CYP21A2 ƒ Quy trình chẩn đoán trước sinh: 15ml dịch ối → Nuôi cấy dòng tế bào dịch ối → Tách, tinh DNAts → Phản ứng MLPA → Giải trình tự gen → Kết kiểu gen CYP21A2 54 KIẾN NGHỊ Tiếp tục chẩn đoán trước sinh bệnh TSTTBS với số lượng mẫu nhiều để đưa khuyến cáo kịp thời cho bà mẹ mang thai ngăn ngừa điều trị bệnh 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzym tác dụng sinh học, NXB Y học, 32- 34 Nguyễn Thị Ngọc Dao, Nguyễn Thị Hoàn cs (2003) “Những đột biến gen gây thiếu hụt steroid 21 hydroxylase bệnh nhi có hội chứng cường thượng thận bẩm sinh thể muối, nước”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 23: Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thị Thương Lan (2006), “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát số đột biến gen CYP21A2 gây bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21- hydroxylase”, Tạp chí Nhi khoa, 14: 184187 Võ Kim Huệ (1997), “Tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21 hydroxylase thể nam hoá đơn trẻ em Việt Nam”, Kỷ yếu công trình NCKH viện BVSKTE, 139- 144 Nguyễn Thy Khê (1998), Nội tiết học đại cương Nhà xuất Y học, 303355 Thái Thiên Nam, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thị Thương Lan (2002), “Phát đột biến gen CYP21A2 TSTTBS thiếu enzym 21-OH trẻ gia đình trẻ bị bệnh viện Nhi”, Tạp chí Nhi khoa, 10: 501- 503 Nguyễn Nguyệt Nga, Nguyễn Thu Nhạn (1980), “Hội chứng sinh dục thượng thận”, Kỷ yếu công trình Nhi Khoa Viện BVSKTE, 147- 152 Nguyễn Thu Nhạn cs (1991), “Bệnh rối loạn nội tiết- chuyển hoá di truyền viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em (1981- 1990)”, Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học 10 năm (1981- 1990), 66- 75 Lê Đức Trình (2003), Hormone nội tiết học NXB Y học, 121-143 Tài liệu tiếng Anh 10 Barbaro M, Baldazzi L, Balsamo A, Lajic S, Robins T, et al (2006) “Functional studies of two novel and two rare mutations in the 21-hydroxylase gen”, J Mol Med, 84: 521–528 11 Baumgartner-Parzer SM, Nowotny P, Heinze G, Waldhausl W, Vierhapper H (2005), “Carrier frequency of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in a middle European population”, J Clin Endocrinol Metab, 90: 775–778 12 Brosnan PG, Brosnan CA, Kemp SF, Domek DB, Jelley DH, et al (1999) “Effect of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia”, Arch Pediatr Adolesc Med, 153: 1272–1278 13 Chung BC, Hu MC, Guzov VM, Wu DA (2000), “Structure and expression of the CYP21A2 (P450c21, steroid 21-hydroxylase) gen with respect to its deficiency”, Endocr, 21:343–352 14 Deneux C, Tardy V, Dib A, Mornet E, Billaud L, et al (2001), “Phenotypegenotype correlation in 56 women with nonclassical congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency”, J Clin Endocrinol Metab, 86: 207–213 15 Friaes A, Rego AT, Aragues JM, Moura LF, Mirante A, et al (2006), “CYP21A2 mutations in Portuguese patients with congenital adrenal hyperplasia: identification of two novel mutations and characterization of four different partial gen conversions”, Mol Gent Metab, 88: 58–65 16 Grischuk Y, Rubtsov P, Riepe FG, Grotzinger J, Beljelarskaia S, et al (2006), “Four novel missense mutations in the CYP21A2 gen detected in Russian patients suffering from the classical form of congenital adrenal hyperplasia: identification, functional characterization, and structural analysis”, J Clin Endocrinol Metab, 91: 4976–4980 17 Haglund-Stengler B, Martin Ritzen E, Gustafsson J, Luthman H (1991), “Haplotypes of the steroid 21-hydroxylase gen region encoding mild steroid 21hydroxylase deficiency”, Proc Natl Acad Sci USA, 88: 8352–8356 18 Koyama S et al (2002), “Gentic analysis of Japanese patients with 21hydroxylase deficiency: Identification of a patient with a new mutation of a homozygous deletion of adenine at codon 246 and patients without demonstrable mutations within the structural gen for CYP21”, J Clin Endocrinol Metab, 87: 2668-2673 19 Krone N, Braun A, Roscher AA, Knorr D, Schwarz HP (2000), “Predicting phenotype in steroid 21-hydroxylase deficiency? Comprehensive genotyping in 155 unrelated, well defined patients from southern Germany”, J Clin Endocrinol Metab, 85: 1059–1065 20 New MI (2006), “Extensive clinical experience: nonclassical 21-hydroxylase deficiency”, J Clin Endocrinol Metab, 91: 4205–4214 21 New MI (2008), “Steroid 21-hydroxylase deficiency (congenital adrenal hyperplasia)”, Am J Med, 98(suppl 1A):2S–8S 22 Oriola J, Plensa I, Machuca I, Pavia C, Rivera-Fillat F (1997), “Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gen”, Clin Chem, 43:557-561 23 Pang S, Pollack MS, Loo M, Green O, Nussbaum R, Clayton G, Dupont B, New MI (1895), “Pitfalls of prenatal diagnosis of 21-hydroxylase deficiency congenital adrenal hyperplasia”, J Clin Endocrinol Metab, 61:89–97 24 Robins T, Bellanne-Chantelot C, Barbaro M, Cabrol S, Wedell A, et al (2007), “Characterization of novel missense mutations in CYP21A2 causing congenital adrenal hyperplasia”, J Mol Med, 85: 247–255 25 Rumsby G, Avey CJ, Conway GS, Honour JW (1998), “Genotype-phenotype analysis in late onset 21-hydroxylase deficiency in comparison to the classical forms”, Clin Endocrinol (Oxf) 48: 707–711 26 Speiser PW, White PC (2003), “Congenital adrenal hyperplasia”, N Engl J Med, 349: 776–788 27 Steigert M, Schoenle EJ, Biason-Lauber A, Torresani T (2002), “High reliability of neonatal screening for congenital adrenal hyperplasia in Switzerland”, J Clin Endocrinol Metab, 87: 4106–4110 28 Strachan T, Sinnott PJ, Smeaton I, Dyer PA, Harris R (1987), “Prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia”, Lancet, 2: 1272–1273 29 Wedell A (1998), “Molecular gentics of congenital andrenal hyperplasia (21hydroxylase deficiency): implication for diagnosis, prognosis and treatment”, Acta Pediatr., 87; 159-164 30 Wilson RC, New MI (1995), “Steroid 21- hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype”, J Clin Endocrinol Metab, 80: 2322-2329 31 White PC, New MI, Dupont B (1986), “Structure of human steroid 21hydroxylase gens”, Proc Natl Acad Sci USA, 83: 5111–5115 32 White PC, Speiser PW (2000), “Congenital adrenal hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency”, Endocr Rev, 21: 245–291 33 White PC, Tusie-Luna MT, New MI, Speiser PW (2004), “Mutations in steroid 21-hydroxylase (CYP21A2)”, Hum Mutat, 3: 373–378 34 White PC, Vitek A, Dupont B, New MI (1988), “Characterization of frequent deletions causing steroid 21-hydroxylase deficiency”, Proc Natl Acad Sci USA, 85: 4436–4440 Website: 35 http://www.aurorabaycare.com 36 http://www.autismpedia.org 37 http://www.mrc-holland.com 38 http://www.schoolworkhelper.net PHỤ LỤC Quy trình phản ứng Multiplex Ligation- Probes Amplification (MLPA) Biến tính lai đầu dò: - Lấy 5µl DNA (50- 200ng DNA) cho vào ống PCR 0.2ml - Ủ mẫu theo chu trình 98°C phút, sau đợi mẫu giảm nhiệt độ xuống 25°C - Thêm 1.5 µl dung dịch SALSA probemix 1.5µl dung dịch MLPA buffer vào tube trộn - Ủ mẫu theo chu trình 95°C phút 60°C 16 Phản ứng ghép nối: − Giảm nhiệt độ mẫu xuống 54°C Trong nhiệt độ mẫu 54°C, thêm 32µl dung dịch Ligase-65 trộn − Ủ mẫu theo chu trình: 54°C 15 phút 98°C phút − Pha dung dịch Ligation: Pha 3µl dung dịch Ligase-65 buffer A, 3µl dung dịch Ligase-65 buffer B, 25µl nước dH2O, 1µl dung dịch Ligase-65 (brown cap) trộn Phản ứng PCR: − Trộn hỗn hợp mới: 4µl dung dịch SALSA PCR buffer + 26 µl water + 10 µl sản phẩm phản ứng ghép nối − Pha hỗn hợp dung dịch Polymerase: µl dung dịch SALSA PCR-primers + µl dung dịch SALSA Enzym Dilution buffer + 5.5 µl dH2O+ 0.5µl SALSA Polymerase − Đặt mẫu vào máy gia nhiệt nhiệt độ 60°C, thêm 10µl hỗn hợp Polymerase vào tube, sau trộn thực phản ứng PCR − Chu trình nhiệt: 95°C 30 giây 60°C 30 giây 72°C 60 giây 72°C 20 phút 35 chu kỳ Chuyển mẫu vào rack 96 giếng dùng cho máy 3130 Gentic Analyser − Đặt tên mẫu, phương pháp phân tích chạy máy Phân tích kết MLPA phần mềm Coffalyser v.9.0 PHỤ LỤC Trình tự gen CYP21A2 mẫu đối chứng so sánh với trình tự gen CYP21A2 chuẩn ngân hàng gen Query Sbjct 1561 Query 61 Sbjct 1621 Query 121 Sbjct 1681 Query 181 Sbjct 1738 Query 241 Sbjct 1798 Query 301 Sbjct 1858 Query 361 Sbjct 1918 Query 421 Sbjct 1978 Query 481 Sbjct 2038 Query 541 Sbjct 2098 Query 601 Sbjct 2158 Query 661 Sbjct 2218 Query 721 Sbjct 2277 Query 781 Sbjct 2337 TGGGAGGGTACCTGAAGGTGGGGTCAAGGGAGGCCCCAAAACAGTCTACACAGCAGGAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGGAGGGTACCTGAAGGTGGGGTCAAGGGAGGCCCCAAAACAGTCTACACAGCAGGAGG 60 GATGGCTGGGGCTCTTGAGCTATAAGTGGCACCTCAGGGCCCTGACGGGCGTCTCGCCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATGGCTGGGGCTCTTGAGCTATAAGTGGCACCTCAGGGCCCTGACGGGCGTCTCGCCAT 120 1620 1680 GCTGCTCCTGGGCCCCCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTGGCTGGCGCCCGCCTGGCTGTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGCTCCTGGGCCCCCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTGGCTGGCGCCCGCCTGCTGTGGAA 180 CTGGTGGAAGCTCCGGAGCCTCCACCTCCCGCCTCTTGCCCCGGGCTTCTTGCACTTGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGGTGGAAGCTCCGGAGCCTCCACCTCCCGCCTCTTGCCCCGGGCTTCTTGCACTTGCT 240 1737 1797 GCAGCCCGACCTCCCAATCTATCTGCTTGGCCTGACTCAGAAATTCGGGCCCATCTACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCAGCCCGACCTCCCAATCTATCTGCTTGGCCTGACTCAGAAATTCGGGCCCATCTACAG 300 GCTCCACCTTGGGCTGCAAGGTGAGAGGCTGATCTCGCTCTGGCCCTCACCATAGGAGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTCCACCTTGGGCTGCAAGGTGAGAGGCTGATCTCGCTCTGGCCCTCACCATAGGAGGG 360 GGCGGAGGTGACGGAGAGGGTCCTCTCTCCGCTGACGCTGCTTTGGCTGTCTCCCAGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGGAGGTGACGGAGAGGGTCCTCTCTCCGCTGACGCTGCTTTGGCTGTCTCCCAGATG 420 TGGTGGTGCTGAACTCCAAGAGGACCATTGAGGAAGCCATGGTCAAAAAGTGGGCAGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGTGGTGCTGAACTCCAAGAGGACCATTGAGGAAGCCATGGTCAAAAAGTGGGCAGACT 480 TTGCTGGCAGACCTGAGCCACTTACCTGTAAGGGCTGGGGGCATTTTTTCTTTCTTAAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGCTGGCAGACCTGAGCCACTTACCTGTAAGGGCTGGGGGCATTTTTTCTTTCTTAAAC 540 AAATTTTTTTTTAAGAGATGGGTTCTTGCTATGCTGCCCAGGCTGGTCTTAAATTCCTAG ||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| AAATTTTTTTTTAAGAGATGGGTTCTTGCTATGTTGCCCAGGCTGGTCTTAAATTCCTAG 1857 1917 1977 2037 2097 600 2157 TCTCAAATGATCCTCCCACCTCAGCCTCAAGTGTGAGCCACCTTTGGGGCATCCCCAATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTCAAATGATCCTCCCACCTCAGCCTCAAGTGTGAGCCACCTTTGGGGCATCCCCAATC 660 CAGGTCCCTGGAAGCTCTTGGGGGGGCATATCTGGTGGGGAGAAAGCAGGGGTTGGGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGGTCCCTGGAAGCTCTTGGGGGGGCATATCTGGTGGGGAGAAAGCAGGGGTTGGGGAG 720 2217 2276 GCCGAAGAAGGTCAGGCCCTCAGCTGCCTTCATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCGAAGAAGGTCAGGCCCTCAGCTGCCTTCATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTC 780 CTCCTGCAGACAAGCTGGTGTCTAAGAACTACCCGGACCTGTCCTTGGGAGACTACTCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCTGCAGACAAGCTGGTGTCTAAGAACTACCCGGACCTGTCCTTGGGAGACTACTCCC 840 2336 2396 Query 841 Sbjct 2397 Query 901 Sbjct 2457 Query 961 Sbjct 2517 Query 1021 Sbjct 2576 Query 1081 Sbjct 2636 Query 1141 Sbjct 2696 Query 1201 Sbjct 2756 Query 1261 Sbjct 2816 Query 1321 Sbjct 2876 Query 1381 Sbjct 2936 Query 1441 Sbjct 2996 Query 1501 Sbjct 3056 Query 1561 Sbjct 3116 Query 1621 Sbjct 3176 Query 1681 Sbjct 3236 Query 1741 Sbjct 3296 TGCTCTGGAAAGCCCACAAGAAGCTCACCCGCTCAGCCCTGCTGCTGGGCATCCGTGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCTCTGGAAAGCCCACAAGAAGCTCACCCGCTCAGCCCTGCTGCTGGGCATCCGTGACT 900 CCATGGAGCCAGTGGTGGAGCAGCTGACCCAGGAGTTCTGTGAGGTAAGGCTGGGCTCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCATGGAGCCAGTGGTGGAGCAGCTGACCCAGGAGTTCTGTGAGGTAAGGCTGGGCTCCT 960 GAGGCCACCTCGGGTCAGCCTCGCCTCTCACAGTAGCCCCCGCCCTGCCCGCTGCACAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGGCCACCTCGGGTCAGCCTCGCCTCTCACAGTAGCCCCCGCCCTGCCCGCTGCACAGC 1020 GGCCTGCTGAACTCACACTGTTTCTCCACAGCGCATGAGAGCCCAGCCCGGCACCCCTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCTGCTGAACTCACACTGTTTCTCCACAGCGCATGAGAGCCCAGCCCGGCACCCCTGT 1080 GGCCATTGAGGAGGAATTCTCTCTCCTCACCTGCAGCATCATCTGTTACCTCACCTTCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCCATTGAGGAGGAATTCTCTCTCCTCACCTGCAGCATCATCTGTTACCTCACCTTCGG 1140 AGACAAGATCAAGGTGCCTCACAGCCCCTCAGGCCCACCCCCAGCCCCTCCCTGAGCCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACAAGATCAAGGTGCCTCACAGCCCCTCAGGCCCACCCCCAGCCCCTCCCTGAGCCTC 1200 TCCTTGTCCTGAACTGAAAGTACTCCCTCCTTTTCTGGCAGGACGACAACTTAATGCCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCTTGTCCTGAACTGAAAGTACTCCCTCCTTTTCTGGCAGGACGACAACTTAATGCCTG 1260 CCTATTACAAATGTATCCAGGAGGTGTTAAAAACCTGGAGCCACTGGTCCATCCAAATTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTATTACAAATGTATCCAGGAGGTGTTAAAAACCTGGAGCCACTGGTCCATCCAAATTG 1320 TGGACGTGATTCCCTTTCTCAGGGTGAGGACCTGGAGCCTAGACACCCCTGGGTTGTAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGACGTGATTCCCTTTCTCAGGGTGAGGACCTGGAGCCTAGACACCCCTGGGTTGTAGG 1380 GGAGAGGCTGGGGTGGAGGGAGAGGCTCCTTCCCACAGCTGCATTCTCATGCTTCCTGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAGAGGCTGGGGTGGAGGGAGAGGCTCCTTCCCACAGCTGCATTCTCATGCTTCCTGCC 1440 GCAGTTCTTCCCCAATCCAGGTCTCCGGAGGCTGAAGCAGGCCATAGAGAAGAGGGATCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCAGTTCTTCCCCAATCCAGGTCTCCGGAGGCTGAAGCAGGCCATAGAGAAGAGGGATCA 1500 CATCGTGGAGATGCAGCTGAGGCAGCACAAGGTGGGGACTGTACGTGGACGGCCTCCCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATCGTGGAGATGCAGCTGAGGCAGCACAAGGTGGGGACTGTACGTGGACGGCCTCCCCT 1560 CGGCCCACAGCCAGTGATGCTACCGGCCTCAGCATTGCTATGAGGCGGGTTCTTTTGCAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCCCACAGCCAGTGATGCTACCGGCCTCAGCATTGCTATGAGGCGGGTTCTTTTGCAT 1620 ACCCCAGTTATGGGCCTGTTGCCACTCTGTACTCCTCTCCCCAGGCCAGCCGCTCAGCCN ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCCCAGTTATGGGCCTGTTGCCACTCTGTACTCCTCTCCCCAGGCCAGCCGCTCAGCCC 1680 GCTCCTTTCACCCTCTGCAGGAGAGCCTCGTGGCAGGCCAGTGGAGGGACATGATGGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTCCTTTCACCCTCTGCAGGAGAGCCTCGTGGCAGGCCAGTGGAGGGACATGATGGACT 1740 ACATGCTCCAAGGGGTGGCGCAGCCGAGCATGGAAGAGGGCTCTGGACAGCTCCTGGAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACATGCTCCAAGGGGTGGCGCAGCCGAGCATGGAAGAGGGCTCTGGACAGCTCCTGGAAG 1800 2456 2516 2575 2635 2695 2755 2815 2875 2935 2995 3055 3115 3175 3235 3295 3355 Query 1801 Sbjct 3356 Query 1861 Sbjct 3416 Query 1921 Sbjct 3476 Query 1981 Sbjct 3536 Query 2041 Sbjct 3596 Query 2101 Sbjct 3656 Query 2161 Sbjct 3716 Query 2221 Sbjct 3776 Query 2281 Sbjct 3836 Query 2341 Sbjct 3896 Query 2401 Sbjct 3956 Query 2461 Sbjct 4016 Query 2521 Sbjct 4075 Query 2581 Sbjct 4135 Query 2640 Sbjct 4194 Query 2700 Sbjct 4254 GGCACGTGCACATGGCTGCAGTGGACCTCCTGATCGGTGGCACTGAGACCACAGCAAACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCACGTGCACATGGCTGCAGTGGACCTCCTGATCGGTGGCACTGAGACCACAGCAAACA 1860 CCCTCTCCTGGGCCGTGGTTTTTTTGCTTCACCACCCTGAGGTGCGTCCTGGGGACAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTCTCCTGGGCCGTGGTTTTTTTGCTTCACCACCCTGAGGTGCGTCCTGGGGACAAGC 1920 3415 3475 AAAAGGCTCCTTCCCAGCAACCTGGCCAGGGCGGTGGGCACCCTCACTCAGCTCTGAGCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAAGGCTCCTTCCCAGCAACCTGGCCAGGGCGGTGGGCACCCTCACTCAGCTCTGAGCA 1980 CTGTGCGGCTGGGGCTGTGCTTGCCTCACCGGCACTCAGGCTCACTGGGTTGCTGAGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGTGCGGCTGGGGCTGTGCTTGCCTCACCGGCACTCAGGCTCACTGGGTTGCTGAGGGA 2040 GCGGCTGGAGGCTGGGCAGCTGTGGGCTGCTGGGGCAGGACTCCACCCGATCATTCCCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGCTGGAGGCTGGGCAGCTGTGGGCTGCTGGGGCAGGACTCCACCCGATCATTCCCCA 2100 GATTCAGCAGCGACTGCAGGAGGAGCTAGACCACGAACTGGGCCCTGGTGCCTCCAGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATTCAGCAGCGACTGCAGGAGGAGCTAGACCACGAACTGGGCCCTGGTGCCTCCAGCTC 2160 CCGGGTCCCCTACAAGGACCGTGCACGGCTGCCCTTGCTCAATGCCACCATCGCCGAGGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGGGTCCCCTACAAGGACCGTGCACGGCTGCCCTTGCTCAATGCCACCATCGCCGAGGT 2220 GCTGCGCCTGCGGCCCGTTGTGCCCTTAGCCTTGCCCCACCGCACCACACGGCCCAGCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCTGCGCCTGCGGCCCGTTGTGCCCTTAGCCTTGCCCCACCGCACCACACGGCCCAGCAG 2280 GTGACTCCCGAGGGTTGGGGATGAGTGAGGAAAGCCCGAGCCCAGGGAGGTCCTGGCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGACTCCCGAGGGTTGGGGATGAGTGAGGAAAGCCCGAGCCCAGGGAGGTCCTGGCCAG 2340 CCTCTAACTCCAGCCCCCTTCAGCATCTCCGGCTACGACATCCCTGAGGGCACAGTCATC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCTCTAACTCCAGCCCCCTTCAGCATCTCCGGCTACGACATCCCTGAGGGCACAGTCATC 2400 ATTCCGAACCTCCAAGGCGCCCACCTGGATGAGACGGTCTGGGAGAGGCCACATGAGTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTCCGAACCTCCAAGGCGCCCACCTGGATGAGACGGTCTGGGAGAGGCCACATGAGTTC 2460 TGGCCTGGTATGTGGGGGGCCGGGGGCCTGCCGTCAAAATGTGGTGGAGGCTGGTCCCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGGCCTGGTATGTGGGGGGCCGGGGGCCTGCCGTCAAAATGTGGTGGAGGCTGGTCCCCG 2520 CTGCCGCTGAACGCCTCCCCACCCACCTGTCCACCCGCCCGCAGATCGCTTCCTGGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTGCCGCTGAACGCCTCCCCACCCACCTGTCCACCCGCCCGCAGATCGCTTCCTGGAGCC 3535 3595 3655 3715 3775 3835 3895 3955 4015 4074 2580 4134 AGGCAAGAACTCCAGAGCTCTGGCCTTCGGCTGCGGTGCCCGCGGTGTGCCTGGGCGAGC 2639 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGGCAAGAACTCCAGAGCTCTGGCCTTCGGCTGCGGTGCCCGCGGTGTGCCTGGGCGAGC 4193 CGCTGGCGCGCCTGGACCTCTTCGTGGTGCTGACCCGACTGCTGCAGGCCTTCACGCTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCTGGCGCGCCTGGACCTCTTCGTGGTGCTGACCCGACTGCTGCAGGCCTTCACGCTGC 2699 TGCCCTCCGGGGACGCCCTGCCCTCCCTGCAGCCCCTGCCCCACTGCAGTGTCATCCTCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCCCTCCGGGGACGCCCTGCCCTCCCTGCAGCCCCTGCCCCACTGCAGTGTCATCCTCA 2759 4253 4313 Query 2760 Sbjct 4314 Query 2820 Sbjct 4374 AGATGCAGCCTTTCCAAGTGCGGCTGCAGCCCCGGGGGATGGGGGCCCACAGCCCGAGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGATGCAGCCTTTCCAAGTGCGGCTGCAGCCCCGGGGGATGGGGGCCCACAGCCCAGGCC AGAACCAGTGAT |||||||||||| AGAACCAGTGAT 2831 4385 2819 4373 ... Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh Mục tiêu nghiên cứu: Lựa chọn kỹ thuật sinh học phân tử để nhận biết đột biến gen CYP21A2 Chẩn đoán trước sau sinh. .. mạnh họ lớn Khoa Di truyền Sinh học Phân Tử - Bệnh Viện Nhi TƯ, từ đầu năm 2009, đơn vị nghiên cứu triển khai kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ chẩn đoán trước sau sinh bệnh TSTTBS Dựa sở đó, tiến... sinh học nhanh, nhạy xác, phân tích gen từ lượng DNA nhỏ Đặc biệt chẩn đoán trước sinh, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán có độ xác cao, tránh tình trạng nhiễm máu mẹ dẫn đến kết chấn đoán