Header Page of 114 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-2014 Footer Page of 114 Header Page of 114 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh-2014 Footer Page of 114 Header Page of 114 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu riêng Kết trình bày luận văn trung thực Việc tham khảo nghiên cứu tác giả khác trích dẫn rõ ràng TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương Footer Page of 114 Header Page of 114 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn bảo vệ luận văn, em xin gửi đến Cô, PGS.TS Nguyễn Thúy Hương lời cảm ơn sâu sắc Em xin cảm ơn Cô Con cảm ơn Mẹ cho chỗ dựa vững để vượt qua khó khăn Em xin cảm ơn chị hai, anh rể cháu ủng hộ em tinh thần vật chất để em có ngày hôm Em cảm ơn chị hai bên em Em cảm ơn Cô Minh Tâm giúp đỡ em trình làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP HCM tạo điều kiện thuận lợi cho em trình em tiến hành thực nghiệm Em xin cảm ơn Thầy, Cô tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực nghiệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP HCM Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến người bạn bên Xin chân thành cảm ơn TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương Footer Page of 114 Header Page of 114 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Quá trình lên men 1.1.3 Các hình thức lên men 1.2 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái vị trí phân loại 12 1.2.2 Đặc điểm sinh lý 13 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 13 1.2.4 Đặc điểm di truyền 14 1.3 Amino acid L-lysine 16 1.3.1 Đặc điểm 16 1.3.2 Vai trò ứng dụng 17 1.3.3 Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn 19 1.3.4 Bản chất trình sinh tổng hợp L-lysine vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 20 1.3.5 Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum 23 1.4 Những nghiên cứu nước liên quan đến hướng đề tài 26 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu 29 Footer Page of 114 Header Page of 114 2.2 Bố trí thí nghiệm 33 2.2.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học giống 33 2.2.2 Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33 2.2.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 35 2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 36 2.3.1 Phương pháp vi sinh 36 2.3.2 Phương pháp hóa sinh 38 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 39 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học giống 40 3.2 Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm 42 3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50 3.3.1 Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung chất 50 3.3.2 Khảo sát ngưỡng ức chế chất 53 3.3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC Footer Page of 114 Header Page of 114 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích .29 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 30 Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng đề tài 31 Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc .34 Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu 34 Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 .40 Bảng 3.2 Kết thí nghiệm sàng lọc 42 Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát 43 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm khởi đầu 44 Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu 45 Bảng 3.6 Kết thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD 46 Bảng 3.7 Khả sử dụng đường Corynebacterium glutamicum 52 Bảng 3.8 So sánh lên men batch fed-batch 61 Footer Page of 114 Header Page of 114 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng môi trường phức hợp (b) Tế bào quan sát kính hiển vi điện tử quét 12 Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 15 Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα lysCβ cấu tạo bốn chuỗi poplypeptide giống hệt 16 Hình 1.4 Cấu trúc không gian cấu tạo phân tử lysine 17 Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine vi khuẩn 20 Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine Corynebacterium glutamicum 21 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b) 41 Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể ảnh hưởng (NH4)2SO4 dịch bắp lên lượng L-lysine 48 Hình 3.3 Đồ thị tối ưu 49 Hình 3.4 Khả sinh trưởng, sinh L-lysine lượng đường sót lên men batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50 Hình 3.5 Khả hình thành sinh khối, L-lysine lượng đường sót nuôi cấy Corynebacterium glutamicum nồng độ glucose khác 54 Hình 3.6 Khả sinh trưởng, sinh L-lysine lượng đường sót trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 57 Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine lên men batch fed-batch 58 Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả sinh trưởng Corynebacterium glutamicum lên men batch fed-batch 59 Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót lên men batch fed-batch 60 Footer Page of 114 Header Page of 114 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Amino acid cần thiết cho sinh trưởng, phát triển người động vật, đặc biệt amino acid không thay Sự thiếu hụt amino acid nói chung amino acid không thay nói riêng dẫn đến tình trạng bệnh lý L-lysine amino acid thuộc nhóm không thay quan tâm nhiều cả, có nhu cầu cao, lại thường bị thiếu hụt phần ăn Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trình chế biến thức ăn thể tuyệt đối không tổng hợp Do đó, thiếu Llysine phổ biến, đặc biệt trẻ nhỏ Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa… Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine hướng quan tâm Tuy nhiên, Việt Nam, quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm, số lượng nghiên cứu sản xuất L-lysine ít, chủng giống chưa đạt chuẩn, suất thấp [1] Với mục tiêu cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine, chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men kỹ thuật lên men fed-batch Đây lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine” Mục tiêu nghiên cứu Cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum-B-0632 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát số đặc điểm sinh học giống Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine Footer Page of 114 Header Page 10 of 114 Phạm vi nghiên cứu Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine quy mô phòng thí nghiệm Đóng góp luận văn Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thông số tối ưu trình lên men batch bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch Kết tiền đề cho nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm phương pháp lên men fed-batch lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino acid L-lysine Về mặt thực tiễn: cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine Footer Page 10 of 114 Header Page 67 of 114 59 Mật độ tế bào Log CFU/mL 10 9,5 8,5 Fed-batch 7,5 Batch 6,5 5,5 10 20 30 40 50 60 Thời gian (giờ) Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả sinh trưởng chủng lên men batch fed-batch Mật độ tế bào 20 đầu lên men mức tương đương hai hình thức lên men Sau bổ sung thêm glucose từ giai đoạn 20 trở đi, mật độ tế bào lên men fed-batch cao hơn, chứng tỏ chủng tăng sinh mạnh hơn, lượng chất bổ sung sử dụng Cuối trình lên men, mật độ tế bào hình thức lên men batch bắt đầu giảm (thời điểm 40 giờ), đó, hình thức fed-batch, mật độ tế bào tăng, đồ thị biểu diễn xu hướng xuống Footer Page 67 of 114 Header Page 68 of 114 60 Đường sót 70,0 g/L 60,0 50,0 40,0 Fed-batch 30,0 Batch 20,0 10,0 0,0 10 20 30 40 50 60 Thời gian (giờ) Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót lên men batch fed-batch Lượng đường sót canh trường có khác biệt rõ hai hình thức lên men Đối với batch, lượng đường sót giảm tuyến tính theo thời gian Đối với fed-batch, lượng đường sót có tăng giảm không theo đường tuyến tính glucose bổ sung trình lên men Tuy nhiên, lượng đường canh trường từ thời điểm 20 trở trì nồng độ thích hợp nên trình trao đổi chất chủng diễn mạnh, làm tăng khả sinh tổng hợp L-lysine Các công trình nghiên cứu tác giả nước lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine hầu hết thực theo hình thức fed-batch liên tục hệ thống tự động Việc kiểm soát nồng độ oxy hoàn tan pH suốt trình lên men tự động hóa Lượng L-lysine thu nghiên cứu cao, gấp đôi chí gấp lần so với lên men batch Tác giả J Xu M Han (2013) lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum fermentor 7L Dung dịch bổ sung gồm glucose 800g/L (NH4)2SO4 400g/L Lượng L-lysine thu 96,8g/L sau 36 lên men [33] Footer Page 68 of 114 Header Page 69 of 114 61 Tác giả Judith Becker (2011) lên men Corynebacterium glutamicum hệ thống Biostat với bình lên men 5L Dịch fed-batch bao gồm: 200g rỉ đường 800g glucose hòa tan 1,8L nước, hấp vô trùng 1210C 20 phút 200mL (NH4)2SO4 (40%) hấp riêng 0,8 mL dịch vitamine 2mL antifoam bổ sung sau Lượng L-lysine thu 120g/L sau 30 nuôi cấy [8] Tác giả Zhen Chen (2011) tiến hành lên men Corynebacterium glutamicum fermentor 2L Dịch bổ sung bao gồm glucose 50%, NH4Cl 4,5% biotine 0,5mg/L Lên men 30 thu lượng L-lysine 58g/L [10] Tác giả Mikiro Hayashi (2006) lên men fed-batch hai chủng Corynebacterium glutamicum ADL-3 AHD-2 fermentor 5L Sau 30 giờ, lượng L-lysine thu 83g/L 73g/L Nguồn chất chọn để bổ sung suốt trình lên men glucose [17] Từ nghiên cứu cho thấy, lượng L-lysine thu nhận khác tùy chủng giống, tùy môi trường lên men, thành phần nồng độ chất bổ sung Nhưng có điều phủ nhận là, hình thức lên men fed-batch thu lượng L-lysine cao nhiều so với lên men batch Bảng 3.8 So sánh lên men batch fed-batch Hình thức lên Tổng thời gian L-lysine Năng suất men lên men (giờ) (g/L) (g/L/giờ) Fed-batch 48 43 0,9 Batch 48 34 0,7 Từ số liệu cho thấy, lên men fed-batch cho sản lượng cao hẳn lên men batch thời gian nuôi cấy Tuy nhiên, lên men fed-batch dạng liên tục cần có hệ thống lên men thiết bị hỗ trợ kiểm soát môi trường suốt trình vận hành Đây thiết bị đắt tiền, người vận hành cần có kiến thức định để điều khiển hệ thống Đây nguyên nhân khiến hình thức lên men batch sử dụng rộng rãi công nghiệp lên men sản xuất amino acid Footer Page 69 of 114 Header Page 70 of 114 62 Tóm lại, sau lên men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum-B-0632, bắt đầu bổ sung glucose thời điểm 20 giờ, nồng độ glucose bổ sung 25%, thu lượng L-lysine cao 21% so với dạng batch sau 48 Kết khả quan cho phép làm sở cho nghiên cứu với quy mô lớn nguồn chất tốn để tiết kiệm chi phí nâng cao suất Footer Page 70 of 114 Header Page 71 of 114 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A Kết luận Qua thí nghiệm khảo sát, đề tài có kết luận sau: - Chủng nghiên cứu thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+), có khả đồng hóa nhiều nguồn carbon nitơ khác - Bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm, xác định môi trường tối ưu lên men theo mẻ (batch) chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 thu nhận L-lysine: (NH4)2SO4 15,8579g/L, dịch bắp 29,2893mL/L, glucose 50g/L, KH2PO4 1g/L, hỗn hợp muối khoáng 5mL/L, biotine 20µg/L, thiamine 150µg/L, tween 20 5mL/L Lượng giống bổ sung 7%, điều kiện nuôi cấy nhiệt độ phòng, pH 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút Kết quả, sau 48 lên men, sản lượng L-lysine thu môi trường đạt 34g/L Tuy nhiên, nên thu nhận L-lysine thời điểm 32 (32g/L) để tiết kiệm chi phí kéo dài thời gian lên men - Chế độ fed-batch: Nguồn chất bổ sung: glucose Thời điểm bổ sung chất: 20 Chu kỳ bổ sung chất: Nồng độ chất bổ sung: 25% - Lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch) chủng Corynebacterium glutamicum -B-0632 môi trường tối ưu, sau 48 giờ, lượng L-lysine đạt 43g/L, tăng 21% so với lên men theo mẻ (batch) Footer Page 71 of 114 Header Page 72 of 114 64 B Kiến nghị Với kết đề tài đạt được, kiến nghị số hướng sau để góp phần hoàn thiện đề tài: • Bố trí thí nghiệm khảo sát ngưỡng ức chế sâu • Tối ưu điều kiện lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine • Tối ưu trình lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum • Định lượng amino acid L-lysine phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) thí nghiệm tối ưu Footer Page 72 of 114 Header Page 73 of 114 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Nguyễn Thùy Châu (2006), Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm axit amin enzim từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp hải sản quy mô bán công nghiệp, Báo cáo tổng kết đề tài KHCN cấp nhà nước Nguyễn Lân Dũng (2012), Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục, Việt Nam Nguyễn Văn Dự; Nguyễn Đăng Bình (2011), Quy hoạch thực nghiệm kỹ thuật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2010), Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu bổ sung chế phẩm L.lysine phần gà đẻ giống Brown Nick, Tạp chí NN& CNTP, 11, p 742-744 Nguyễn Thị Hoa Lý; Lê Đức Ngoan; Lê Khắc Huy (1996), Hiệu bổ sung chế phẩm L-lysine DL-methionine phần gà thịt AE Quảng Nam-Đà Nẵng, Tạp chí NN& CNTP, 4, p 172-174 Trần Thị Minh Tâm; Nguyễn Thúy Hương (2009), Tối ưu trình lên men thu nhận amino acid L-lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 25, p 172-178 Tài liệu tham khảo tiếng Anh Becker Judith, et al (2011), From zero to hero design-based systems metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for l-lysine production, Metabolic engineering, 13, (2), p 159-168 Bott Michael and Eggeling, Lothar (2005), Handbook of Corynebacterium glutamicum, Taylor & Francis Group, United State of America 10 Chen Zhen, et al (2011), Coevolutionary analysis enabled rational deregulation of allosteric enzyme inhibition in Corynebacterium glutamicum for lysine production, Applied and environmental microbiology, 77, (13), p 4352-4360 Footer Page 73 of 114 Header Page 74 of 114 66 11 Cho Young J, et al (1993), Strain of Corynebacterium glutamicum and method for producing L-lysine, Google Patents 12 Faurie Robert (2003), Advances in biochemical engineering/Biotechnology 79, Vol 79, Springer, Berlin 13 Georgi Tobias, Rittmann, Doris, and Wendisch, Volker F (2005), Lysine and glutamate production by Corynebacterium glutamicum on glucose, fructose and sucrose: Roles of malic enzyme and fructose-1, 6-bisphosphatase, Metabolic engineering, 7, (4), p 291-301 14 Gous Rm and Morris, Tr (1985), Evaluation of a diet dilution technique for measuring the response of broiler chickens to increasing concentrations of lysine, British poultry science, 26, (2), p 147-161 15 Hadj Sassi A, et al (1988), Optimisation of L-lysine production by Corynebacterium sp in fed-batch cultures, Biotechnology letters, 10, (8), p 583586 16 Haefner Stefan, et al (2011), Methods for the preparation of lysine by fermentation of Corynebacterium glutamicum, Google Patents 17 Hayashi Mikiro, et al (2006), A leuC mutation leading to increased L-lysine production and rel-independent global expression changes in Corynebacterium glutamicum, Applied microbiology and biotechnology, 72, (4), p 783-789 18 Hickling D, Guenter, W, and Jackson, Me (1990), The effects of dietary methionine and lysine on broiler chicken performance and breast meat yield, Canadian Journal of Animal Science, 70, (2), p 673-678 19 Hsieh Chung-Lung, Hsiung, Kuang-Pin, and Su, Jong-Ching (1995), Determination of lysine with ninhydrin-ferric reagent, Analytical biochemistry, 224, (1), p 187189 20 Kiefer P, Heinzle, E, and Wittmann, C (2002), Influence of glucose, fructose and sucrose as carbon sources on kinetics and stoichiometry of lysine production by Corynebacterium glutamicum, Biotechnology, 28, (6), p 338-343 Footer Page 74 of 114 Journal of Industrial Microbiology and Header Page 75 of 114 67 21 Kiefer Patrick, et al (2004), Comparative metabolic flux analysis of lysineproducing Corynebacterium glutamicum cultured on glucose or fructose, Applied and environmental microbiology, 70, (1), p 229-239 22 Leclercq Bernard (1998), Lysine: Specific effects of lysine on broiler production: comparison with threonine and valine, Poultry Science, 77, (1), p 118-123 23 Lee H-W, Pan, J-G, and Lebeault, J-M (1998), Enhanced L-lysine production in threonine-limited continuous culture of Corynebacterium glutamicum by using gluconate as a secondary carbon source with glucose, Applied microbiology and biotechnology, 49, (1), p 9-15 24 Ohnishi J, et al (2002), A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant, Applied microbiology and biotechnology, 58, (2), p 217-223 25 Ohnishi Junko and Ikeda, Masato (2006), Comparisons of potentials for L-lysine production among different Corynebacterium glutamicum strains, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 70, (4), p 1017-1020 26 Pelechová J, et al (1980), Biosynthesis of L-lysine in Corynebacterium glutamicum on sucrose, ethanol and acetic acid, Folia microbiologica, 25, (4), p 341-346 27 Peters-Wendisch Petra, et al (2012), Biotin protein ligase from Corynebacterium glutamicum: role for growth and L-lysine production, Applied microbiology and biotechnology, 93, (6), p 2493-2502 28 Stanbury Peter F, Whitaker, Allan, and Stephen, J (1994), Principles of Fermentation Technology, Butterworth-Heinemann (Elsevier) 29 Tam Tran Thi Minh and Huong, Nguyen Thuy (2014), Optimization of Corynebacterium glutamicum immobilization process on bacterial cellulose carrier and its application for lysine fermentation, Journal of engineering (IOSRJEN), 4, (07), p 33-38 30 Tam Tran Thi Minh and Huong, Nguyen Thuy (2014), Optimization of Corynebacterium glutamicum Immobilization on Alginate and Investigation into its Storage Conditions, International journal of modern engineering research, p 66-71 Footer Page 75 of 114 Header Page 76 of 114 68 31 Tateno Toshihiro, Fukuda, Hideki, and Kondo, Akihiko (2007), Direct production of L-lysine from raw corn starch by Corynebacterium glutamicum secreting Streptococcus bovis α-amylase using cspB promoter and signal sequence, Applied microbiology and biotechnology, 77, (3), p 533-541 32 Tateno Toshihiro, Fukuda, Hideki, and Kondo, Akihiko (2007), Production of LLysine from starch by Corynebacterium glutamicum displaying α-amylase on its cell surface, Applied microbiology and biotechnology, 74, (6), p 1213-1220 33 Xu Jianzhong, et al (2013), Improvement of L‐lysine production combines with minimization of by‐products synthesis in Corynebacterium glutamicum, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, p 34 Xu Jianzhong, et al (2014), Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum for the l-lysine production by increasing the flux into l-lysine biosynthetic pathway, Amino Acids, p 1-11 35 Xu Jianzhong, et al (2013), Improvement of cell growth and l-lysine production by genetically modified Corynebacterium glutamicum during growth on molasses, Journal of industrial microbiology & biotechnology, 40, (12), p 1423-1432 36 http://biomatics.org/index.php/The_Amino_Acid_Code (19h, 23/7/2014) 37 http://bacmap.wishartlab.com/organisms/485 (21h, 23/7/2014) Footer Page 76 of 114 Header Page 77 of 114 69 PHỤ LỤC Phụ lục Đường chuẩn tương quan OD 560nm lượng đường Phương pháp dựng đường chuẩn đường khử: hòa tan 1g đường glucose 200mL nước cất Pha loãng nồng độ thích hợp Hút 3mL dịch nồng độ pha loãng vào ống nghiệm bổ sung 1mL thuốc thử DNS Đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 1000C phút Để nguội nhiệt độ phòng Đo mật độ quang bước sóng 560nm y = 0,00059x + 0,00002 R² = 0,99499 đường khử 0,0006 g/L 0,0005 0,0004 0,0003 đường khử Linear (đường khử) 0,0002 0,0001 0 DNS Footer Page 77 of 114 0,2 0,4 0,6 0,8 OD Ph ụ lục Ph ản ứn g mà u đư ờng kh Header Page 78 of 114 70 Phụ lục Đường chuẩn tương quan OD 600nm mật độ tế bào 300.000.000 Mật độ tế bào TB/mL 250.000.000 y = 662.567.036,43111x 1.180.605,86170 R² = 0,99998 200.000.000 150.000.000 mật độ tb 100.000.000 Linear (mật độ tb) 50.000.000 -50.000.000 0,1 0,2 0,3 0,4 OD Phụ lục Phương pháp dựng đường chuẩn L-lysine Khối lượng L-lysine tương đương (g/L) Mẫu L-lysine Nước cất bổ sung (mL) Ký hiệu 50 2g 40 A 40 mL A B 30 mL A C 25 mL A D 20 mL A E 15 mL A F 10 mL A G mL A H 0 mL A 10 I Hút 20µL dịch từ mẫu A, B…cho vào ống nghiệm sạch, bổ sung 660µL dung dịch A 370µL dung dịch B Lắc đều, đậy kín miệng ống nghiệm, đun cách thủy 20 phút Sau làm lạnh ống nghiệm vòi nước Bổ sung thêm 4mL dung dịch DMSO 6mL nước cất Lắc đo bước sóng 470nm Footer Page 78 of 114 Header Page 79 of 114 71 Lysine g/L Phụ lục Đường chuẩn tương quan OD 470nm lượng L-lysine 60 y = 3946x - 2,099 R² = 0,918 50 40 duong chuan lysine 30 Linear (duong chuan lysine) 20 10 0 0,005 0,01 0,015 OD Phụ lục Phương pháp chế biến rỉ đường Rỉ đường chế biến theo phương pháp Amin (2007) sau: kg rỉ đường, bổ sung thêm 3mL H2SO4 đậm đặc, cho thêm nước cất đủ 1L Đun hỗn hợp 1000C 30 phút, sau để nguội 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/20 phút, thu phần dịch Sử dụng phương pháp đo quang phổ bước sóng 560nm, xác định lượng đường rỉ đường Phụ lục Phương pháp chế biến dịch bắp Dịch bắp thu nhận sau: 400g bắp khô (tương đương 1500g bắp tươi, độ ẩm trung bình hạt bắp 72,37%), thêm 3L nước cất, đun 1000C đến thể tích dịch 1L, thu phần dịch Xác định lượng đường dịch bắp sử dụng phương pháp đo quang phổ bước sóng 560nm Footer Page 79 of 114 Header Page 80 of 114 72 Phụ Thành phần hỗn hợp muối khoáng môi trường tối ưu MgSO4: 1g FeSO4: 100mg MnSO4: 100mg ZnSO4: 100mg CuSO4: 10mg Hòa tan hỗn hợp 50mL nước cất Phụ lục Thành phần dịch bắp Tổng lượng đường tự 6,8% (w/v) Sodium 0,3-1% Tổng lượng nitrogen: % (w/v) Mg 0,003-0,3% Alanine Fe 0,01-0,3% Arginine 25 Ca 0,01-0,03% Acid glutamic Cr 0,001-0,003% Leucine Vitamine 41-49mg/g Proline Biotine 14,5-21,5mg/g Isoleucine Ca-pantothenate 0,26-0,6mg/g Threonine 3,5 Acid folic 30-40mg/g Valine 3,5 Nicotinamid 3,9-4,7mg/g Phenylalanine 3,5 Methionine Cysteine Phụ lục 10 Tính nồng độ dịch glucose bổ sung thời điểm lên men fedbatch Hình thức lên men: fed-batch gián đoạn, không thay đổi thể tích Thể tích dịch glucose bổ sung thời điểm: mL Thể tích dịch lên men: 250 mL Thời điểm 20 giờ: Nồng độ đường sót: 31,3 g/L, tương đương 7,825g Nồng độ đường tối ưu: 50g/L, tương đương 12,5g Footer Page 80 of 114 Header Page 81 of 114 73 Gọi a lượng glucose có 5mL dịch bổ sung Ta có: a + 7,825 = 12,5 a = 4,675 (g) Vậy, nồng độ dịch glucose bổ sung thời điểm 20 4,675 x 1000 : = 935 g/L, nghĩa 93,5% Tương tự, xác định nồng độ glucose bổ sung cho giai đoạn Thời điểm (giờ) Nồng độ dịch glucose bổ sung (%) 20 93,5 24 122,5 28 150,5 32 166 36 174 40 175 44 186,5 48 195,5 Tuy nhiên, từ thời điểm 20 giờ, khả sử dụng đường chủng giảm nên cần giảm nồng độ dịch glucose bổ sung Footer Page 81 of 114 ... thu t lên men fed-batch Đây lý tiến hành đề tài: Nghiên cứu trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine Mục tiêu nghiên cứu Cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine từ... trường lên men kỹ thu t lên men fed-batch để nâng cao suất thu nhận L-lysine 1.3.5 Kỹ thu t lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum 1.3.5.1 Thiết kế môi trường lên men. .. hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33 2.2.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine