ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Keo Phommavong NGHIÊN CƢ́U ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦ A MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nợi - 2016 ĐẠI HỌC Q́C GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Keo Phommavong NGHIÊN CƢ́U ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦ A MỘT SỐ CHỦ NG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO Chuyên ngành: Sinh ho ̣c thƣc̣ nghiêm ̣ Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầ u tiên, em xin bày tỏ lòng biế t ơn chân thành và sâu sắ c nhấ t tới Thầy giáo PGS.TS Nguyễn Quang Huy Thầ y đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n tố t nhấ t , giúp em có thêm nhiều kỹ và kiến thức quý báu trình thực hiê ̣n đề tài luâ ̣n văn Em xin chân thành cảm ơn toàn thể Thầ y, Cô khoa Sinh ho ̣c , Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐHQGHN đã giảng da ̣y , truyề n đa ̣t cho em những kiế n thức bổ ích suố t hai năm ho ̣c qua Em xin chân thành cảm ơn tới TS Lê Hồng Điệp, Bộ môn Sinh lý thực vâ ̣t và Hóa sinh , Khoa Sinh ho ̣c thầy , cô, anh chi ̣và ba ̣n bè Khoa, Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã giúp đỡ em quá trin ̀ h thực hiê ̣n luâ ̣n văn này Cuố i cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và ba ̣n bè đã ở bên đô ̣ng viên, tạo động lực giúp em trưởng thành suố t thời gian ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu khoa ho ̣c Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2016 Học viên Keo Phommavong DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Chấ t kháng sinh đươ ̣c phát hiê ̣n [8, 38] 16 Bảng 2.1 Các địa điểm lấy mẫu đất 25 Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật kiểm định 26 Bảng 3.1 Sự phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n 36 Bảng 3.2 Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được .37 Bảng 3.3 Số lươ ̣ng sự phân bố của xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu 39 Bảng 3.4 Họat tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 41 Bảng 3.5 HTKS của xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu 42 Bảng 3.6 Khả hoạt tính của chủng XK với nhóm vi khuẩn 43 Bảng 3.7 HTKS của các chủng XK môi trường tha ̣ch .44 Bảng 3.8 HTKS của dich ̣ lên men của chủng XK môi trường dich ̣ thể 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả kháng VSVKĐ của chủng .49 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả kháng VSVKĐ của chủng 52 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH với khả kháng VSVKĐ của chủng .53 Bảng 3.12 Hoạt tính enzyme của chủng xạ khuẩn 55 Bảng 3.13 Hoạt tính enzyme ở nhiệt độ khác của chủng L 56 DANH MỤC CÁC HÌ NH VẼ , ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n [71] .6 Hình 1.2 Khuẩ n ty xạ khuẩn [73] .7 Hình 1.3 Bào tử xạ khuẩn [70] Hình 1.4 Hình thái vi khuẩ n S aureus [72] .9 Hình 1.5 Hình thái vi khuẩ n E coli [72] 11 Hình 1.6 Hình thái vi khuẩ n B subtilis [72] 12 Hình 1.7 Hình thái vi khuẩ n B cereus [73] .14 Hình 1.8 Mô ̣t số thuố c kháng sinh du ̣ng y ho ̣c nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [73] 20 Hình 1.9 Mô ̣t số kháng sinh du ̣ng bảo vê ̣ thực vâ ̣t nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [74] 21 Hình 1.10 Mô ̣t số thuố c kháng sinh du ̣ng chăn nuôi nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [75] 21 Hình 1.11 Mô ̣t số thuố c k háng sinh dụng bảo vệ thực phẩm nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n [75] 21 Hình 2.1 Hình mẫu đất thu thâ ̣p ta ̣i Lào 25 Hình 3.1 Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n mo ̣c điã môi trường SCA và GI 38 Hình 3.2 Khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu 40 Hình 3.3 Mô ̣t số chủng xa ̣ khuẩ n thuầ n khiế t 40 Hình 3.4 HTKS của chủng XK môi trường tha ̣ch 45 Hình 3.5 HTKS chủng XK môi trường dich ̣ thể .47 Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kin ́ h hiể n vi của chủng L4 .47 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kí nh hiể n vi của chủng C3 .48 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kính hiể n vi của chủng T9 .49 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả kháng VSVKĐ của chủng C3 50 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả kháng VSVKĐ của chủng L4 51 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả kháng VSVKĐ của chủng T9 51 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả kháng VSVKĐ của chủng XK53 Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH với khả kháng VSVKĐ của chủng 54 Hình 3.14 Hoạt tính enzyme của chủng XK 55 Hình 3.15 Hoạt tính chịu nhiệt enzyme của chủng L 56 Hình 3.16 Vị trí phân loại của chủng T9 dựa vào trình tự gen rARN 16S với loài có quan hệ họ hàng gần 58 NHƢ̃ NG CHƢ̃ VIẾT TẮT Chƣ̃ viế t tắ t: Chƣ̃ viế t đầ y đủ CFU Colony Forming Unit GI Môi trường Gause I SCA Starch Casein Agar LB Môi trường Luria Betarni CMC Carboxyl Methyl Cellulose VSVKĐ Vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ HTKS Hoạt tính kháng sinh MT Môi trường MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Mục tiêu nghiên cứu .2 Nô ̣i dung nghiên cứu CHƢƠNG 1-TỔNG QUAN TÀ I LIỆU Giới thiê ̣u về xa ̣ khuẩ n 1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn tự nhiên .3 1.2 Đặc điểm sinh học-hình thái của xạ khuẩn .4 1.2.1 Cấ u ta ̣o tế bào của xa ̣ khuẩ n 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 1.2.3 Khuẩ n la ̣c của xa ̣ khuẩ n .6 1.2.4 Khuẩ n ty của xa ̣ khuẩ n 1.2.5 Sự hình thành bào tử của xa ̣ khuẩ n 1.3 Sơ lươ ̣c về vi khuẩ n kiểm định 1.3.1 Vi khuẩ n Staphylococcus aureus .9 1.3.2 Vi khuẩ n Escherichia coli 10 1.3.3 Vi khuẩ n Bacillus subtilis 12 1.3.4 Vi khuẩ n Bacillus cereus 13 1.4 Đa ̣i cương về chấ t kháng sinh 14 1.4.1 Chấ t kháng sinh .14 1.4.2 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 15 1.4.3 Sự hình thành chấ t kháng sinh ở xa ̣ khuẩ n 16 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh .18 1.5.1 Điề u kiê ̣n nuôi cấ y 18 1.5.2 Thành phần muôi trường nuôi cấy 18 1.6 Sự ứng du ̣ng chấ t kháng sinh từ xa ̣ khuẩ n .19 1.6.1 Ứng dụng y học 19 1.6.2 Ứng dụng bảo vệ thực vật 20 1.6.3 Ứng dụng chăn nuôi .21 1.6.4 Ứng dụng bảo vệ thực phẩm 22 1.7 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 22 1.7.1 Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n theo phương pháp truyền thố ng 22 1.7.2 Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩ n theo phương pháp hiê ̣n đa ̣i 23 1.8 Khả sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật 23 1.8.1 Ứu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme .23 1.8.2 Mô ̣t số enzyme có nguồ n gố c từ xa ̣ khuẩ n 24 CHƢƠNG 2-NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U .25 Vâ ̣t liê ̣u nghiên cứu .25 2.1 Mẫu đấ t .25 2.2 Vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ 26 2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26 2.3.1 Hóa chất 26 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 26 2.4 Các môi trường dùng nghiên cứu .27 2.4.1 Môi trường phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n 27 2.4.2 Môi trường xác đinh ̣ hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh .28 2.4.3 Môi trường kiể m tra khả sinh enzyme ngoa ̣i bào 28 2.5 Các phương pháp sử dụng nghiên cứu 28 2.5.1 Phương pháp lấ y mẫu đấ t 28 2.5.2 Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n 29 2.5.2.1 Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩ n theo Vinogradski .29 2.5.3 Phương pháp thuầ n khiế t và bảo quản giố ng 30 2.5.4 Phương pháp quan sát hin ̀ h thái ̣ sơ ̣i xa ̣ khuẩ n 30 2.5.5 Phương pháp lên men xa ̣ khuẩ n .30 2.5.6 Phương pháp xác đinh ̣ hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh 30 2.5.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 30 2.5.6.2 Phương pháp đu ̣c lỗ .31 2.5.7 Phương pháp xác đinh ̣ khả tiế t enzyme ngoa ̣i bào 32 2.5.8 Phương pháp xác đinh ̣ khả chiụ nhiê ̣t của enzyme 33 2.5.9 Phương pháp tố i ưu mô ̣t số điề u kiê ̣n ảnh hưởng tới sự sinh tổ ng hơ ̣p 34 chấ t kháng vi sinh vâ ̣t gâ ̣y bê ̣nh của các chủng xa ̣ khuẩ n 34 2.5.10 Phương pháp đinh ̣ danh các chủng xa ̣ khuẩ n 34 2.5.11 Phương pháp xử lý số liê ̣u 35 CHƢƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 Kế t quả phân lâ ̣p và tuyể n cho ̣n các chủng xa ̣ khuẩ n từ mẫu đấ t 36 3.1 Phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n 36 3.2 Phân bố của khuẩ n la ̣c xa ̣ khuẩ n theo nhóm màu 39 3.3 Kế t qủa nghiên cứu các chủng tuyể n cho ̣n .41 3.3.1 Hoạt tính kháng sinh của chủng xa khuẩn .41 3.3.2 Hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định .43 3.3.3 Tuyể n cho ̣n các chủng xa ̣ khuẩ n có hoa ̣t tin ́ h kháng sinh .44 3.4 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng xạ khuẩn 47 3.4.1 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng L4 47 3.4.2 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng C3 48 3.4.3 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng T9 48 3.5 Ảnh hưởng yếu tố của môi trường với chủng xạ khuẩn 49 3.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 49 3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 52 3.5.3 Ảnh hưởng của pH 53 3.6 Khả tiết enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn .55 3.6.1 Khả hoạt tính enzyme của chủng xạ khuẩn 55 3.6.2 Khả chịu nhiệt của enzyme chủng L4 .56 3.7 Kế t quả đinh ̣ danh loa ̣i của chủng xa ̣ khuẩ n .57 3.7.1 Chủng T9 57 Kế t quả chung của ảnh hưởng nồ ng đô ̣ NaCl đố i với các chủng xạ khuẩn cho thấ y , môi trường nuôi cấ y ở các nồ ng đô ̣ NaCl , có ảnh hưởng làm thay đổ i tới khả sinh trưởng kháng khuẩ n 3.5.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ Trong thí nghiê ̣m về ảnh hưởng của nhiê ̣t đô ̣ đố i với sự tố i ưu sinh trưởng của xạ khuẩn, ở nhiệt độ của thí nghiệm bao gồm 25°C, 30°C và 37°C Kế t quả thí nghiê ̣m của ảnh hưởng nhiê ̣t đô ̣ với các chủng xạ khuẩn cho thấ y thể hiê ̣n ở bảng 3.10 và hình 3.12 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiê ̣t đô ̣ với khả kháng VSVKĐ của chủng Chủng xạ khuẩ n C3 L4 T9 Nhiêṭ đô ̣ Hoạt tính kháng VSVKĐ (D-d, mm) (°C) E coli (-) S aureus (+) B cereus (+) B subtilis (+) 25 - 16,5±0,3 13,5±0,5 15,8±0,3 30 - 18,4±0,2 37 - 15,5±0,5 13,5±0,5 16,5±0,5 25 - - - - 30 - 10,7±0,3 15,5±0,5 9,5±0,2 37 - - - - 25 - - - 13,5±0,5 30 - 8,5±0,5 10,5±0,2 16,5±0,3 37 - 15,5±0,2 14,5±0,5 10,7±0,3 13,6±0,2 Chú thích: (-): không có hoa ̣t tính Kế t quả bảng 3.10, cho thấ y ở nhiê ̣t đô ̣ không có ảnh hưởng nhiề u tới khả ức chế với sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định , có mô ̣t chủng E.coli có ức chế với sư sinh trường của cả chủng xạ khuẩn làm không có hoạt tính kháng E.coli Nhiê ̣t đô ̣ thích hơ ̣p để tiế n hành nuôi cấ y và thí nghiê ̣m tiế p theo của chủng xạ khuẩn là 30°C và 37°C Đặc biệt, nhiê ̣t đô ̣ thić h hơ ̣p là 30°C mà có hoa ̣t tin ́ h 52 mạnh và hoàn toàn thích hợp với chủng xạ khuẩn với nhiệt độ điề u kiê ̣n của môi trường thí nghiê ̣m A B C Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả kháng VSVKĐ của chủng A: S aureus, B: B cereus và C: B subtilis 3.5.3 Ảnh hƣởng pH chủng xạ khuẩn ký hiệu C 3, L4 và T9 đươ ̣c nuôi môi trường lỏng GI thới gian 5-7 ngày với mức pH khác pH 3, 5, và Ảnh hưởng của thí nghiê ̣m pH là để xác đinh ̣ pH tố i ưu cho khả tiế t chấ t ức ch ế vi sinh vâ ̣t kiể m đinh, ̣ kế t quả ảnh hưởng của pH thể hiê ̣n ở bảng 3.11 và hình 3.13 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH với khả kháng VSVKĐ của chủng Chủng xạ khuẩn C3 L4 pH Hoạt tính kháng VSVKĐ (D-d, mm) E coli (-) S aureus (+) B cereus (+) B subtilis (+) - - - - - 15,5±0,5 - 15,7±0,3 - 9,7±0,2 - 10,8±0,4 - 9,5±0,3 - 9,6±0,2 - - - - - - - - - 16,5±0,5 16,5±0,5 8,5±0,5 - 16,5±0,1 15,5±0,5 11,5±0,2 53 T9 - - - - - - 11,5±0,1 - - 16,5±0,5 10,5±0,5 17,5±0,5 - - - - Chú thích: (-): không có hoa ̣t tin ́ h A C B D Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH với khả kháng VSVKĐ của chủng A, B: B subtilis; C: S aureus và D: B cereus Đối với kết quả cho thấ y , cả chủng xạ khuẩn C3, L4 và T9 có pH tố i ưu cho sinh trường là pH Trong đó , đă ̣c biế t nhấ t là chủng T có hoạt tính kháng VSVKĐ mạnh chủng khác Với pH 3môi trường axit, cả chủng không có khả ức chế vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ Trong cả chủng xạ khuẩn không có chủng nào có hoạt tính kháng E coli 54 3.6 Khả tiế t enzyme ngoa ̣i bào của chủng xạ khuẩn 3.6.1 Khả hoạt tính enzyme chủng xạ khuẩn chủng xạ khuẩn được nuôi lắc môi trường dịch thể Gause I và thu dịch enzyme thô môi trường để sử du ̣ng làm tiế n hành thí nghiê ̣m để kiể m tra hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán đĩa thạch đục lỗ Kế t quả đươ ̣c trình bày ở bảng 3.12 và hình 3.14 Bảng 3.12 Hoạt tính enzyme của chủng xạ khuẩn Hoạt tính enzyme (D-d,mm) Amylase Protease Cellulose 10,5±0,5 16,5±0,1 9,8±0,5 13,7±0,2 14,5±0,5 15,5±0,2 (-): không có hoa ̣t tính Ký hiêụ chủng XK C3 L4 T9 Chú thích: Amylase Protease Cellulose C3 L4 L4 C3 L4 T9 C3 T9 T9 Hình 3.14 Hoạt tính enzyme của chủng XK Kết quả b ảng 3.12 và hình 3.14, cho thấ y chủng xạ khuẩn đều vẫn giữ đươ ̣c hoa ̣t tiń h enzyme môi trường dịch thể Khả phân giải chấ t của chủng xạ khuẩn tương đối ổn định Chủng C có hoạt tính mạnh nhất với protease, tiế p theo là chủng T9 chủng L4 có hoạt tính với chấ t a mylase, protease và cellulose cũng khá ma ̣nh Chủng T9 không có hoạt tính với amylase và cellulose Căn cứ kế t quả trên, chúng lựa chọn chủng L4 để tiếp tục thí nghiệm 55 3.6.2 Khả chịu nhiệt enzyme chủng L4 Để xác đinh ̣ khả bề n nhiê ̣ t của enzyme từ chủng L 4, chúng đã tiến hành lên men môi trường GI, 7-10 ngày ly tâm thu dich ̣ enzyme Tiế n hành xử lý dịch enzyme thô ở nhiệt độ khác 40°C, 50°C, 60°C, 70°C và 80°C các khoảng thời gian 15, 30 và 60 phút Sau đó để nguô ̣i và xác đinh ̣ hoa ̣t tính enzyme bằ ng phương pháp khuế c h tán điã tha ̣ch đu ̣c lỗ Kế t quả đươ ̣c trin ̀ h bày ở bảng 3.13 và hình 3.15 Bảng 3.13 Hoạt tính enzyme ở nhiệt độ khác của chủng L Thời gian xƣ̉ lý (phút) 15 30 60 Hoạt tính enzyme (D-d, mm) Enzyme 40°C 50°C 60°C 70°C 80°C Amylase Protease Cellulose Amylase Protease Cellulose Amylase Protease Cellulose 11,5±0,1 11,5±0,5 11,6±0,3 11,5±0,1 10,5±0,5 11,5±0,1 10,5±0,1 9,5±0,5 8,5±0,1 9,5±0,1 11,6±0,2 9,5±0,5 10,5±0,5 8,5±0,5 8,5±0,1 8,5±0,5 8,5±0,1 8,5±0,5 - - Chú thích: (-): không có hoa ̣t tin ́ h 40°c 50°c 60°c 40°c 50°c 60°c 70°c 80°c 70°c 80°c 60′ 60′ - 30′ 30′ 15′ 15′ Protease Cellulose Hình 3.15 Hoạt tính chịu nhiệt enzyme của chủng L 56 Kế t quả bảng 3.17 cho thấ y , hoạt tính enzyme của chủng L tương đố i bề n vững với nhiê ̣t đô ̣ , hoạt tính có sự thay đối tăng dần thời gian xử lý ở mô ̣t mức đô ̣ Khả phân giải nguồ n chấ t amylase , protease và cellulase thì có s ự khác Đối với amylase, chủng L4 không có khả phân giải chất , enzyme protease và cellulo se thời gian 15 phút tăng xử lý nhiê ̣t đô ̣ , hoạt tính enzyme tăng dầ n và giảm ở nhiệt độ 50°C và 60°C, hoạt tính mạnh so với đối chứng (-) Riêng với enzyme cellulose bắ t đàu xử lý ở nhiê ̣t đô ̣ 40°C thời gian 15, 30 và 60 phút hoạt tính enzyme đã tăng liên tu ̣c so với đố i chứng Hai enzyme protease và cellulose là những enz yme có khả chiụ nhiê ̣t cao, nhiê ̣t đô ̣ thić h hơ ̣p cho sự hoa ̣t đô ̣ng của enzyme này ở nhiệt độ 40°C Đây là đă ̣c điể m thuâ ̣n lơ ̣i cho viê ̣c ứng du ̣ng xử lý môi trường 3.7 Kế t quả đinh ̣ danh loa ̣i của chủng xạ khuẩn Theo phương pháp sinh học phân tử , chúng tiến hành giải trình tự gen 16S rRNA của chủng xa ̣ khuẩ n tuyể n cho ̣n ta ̣i Viê ̣n Vi sinh vâ ̣t ho ̣c và Công nghê ̣ sinh ho ̣c, ĐHQGHN để đinh ̣ danh, đồ ng thời xây dựng phát sinh chủ ng loa ̣i của chủng xạ khuẩn Đối với kết quả được so sánh với trình tự của loại đã được công bố Database DDBJ/EMBL/GenBank sử du ̣ng phầ n mề m BLAST và xây dựng phát sinh chủng loa ̣i bằ ng phầ n mề m ClustalX 1.83 3.7.1 Chủng T9 Trình tự gen 16S ARNr của chủng T9 CCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACG ACGCGTTCCCGCATGGGATACGTGTGGAAAGTTCCGGCGGTGCAGGATG AGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGA CACGGCCCAGATTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT GGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCG GGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGTGAGTGACGGTACCTGC 57 AGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAG GGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGC TTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACTCCGGGTCTGCATTC GATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTA GCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGA TCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAAC AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTG TGGGCGACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGG GGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAA GAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAGATGGGTGC CCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGT TGCCAGCGGGTTATGCCGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTC GGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGG CTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGTGAGG TGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAAC TCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAA AGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCTTGTGGAGGGAGCCGT CGAAGGTGGGACTGGC 0.01 Streptomyces geldanamycininus_NR 043722 Streptomyces antimycoticus_AY999831 Streptomyces sporoclivatus_AJ781369 Streptomyces melanosporofaciens_AJ391837 Streptomyces mordarskii_EF408735 76 62 Streptomyces castelarensis_AY508511 71 Streptomyces hygroscopicus subsp enhygrus _DQ442510 Streptomyces yatensis_AF336800 Streptomyces rhizosphaericus_AJ391834 99 Streptomyces griseiniger_AJ391818 77 Streptomyces cangkringensis_AJ391831 62 Streptomyces asiaticus_AJ391830 596 Streptomyces samsunensis_EU077190 100 Streptomyces malaysiensis_AF117304 T9 Kitasatosporia setalba_U93332 59 71 66 71 58 Hình 3.16 Vị trí phân loại của chủng T9 dựa vào trình tự gen 16S ARNr với loài có quan hệ họ hàng gần Kế t quả giải trình tự gen 16S ARNr của chủng T9, cho biế t chủng T9 thuô ̣c chi Streptomyces Trình tự gen 16S ARNr của chủng T9 tương đồng 99,8 % (1331/1333 bp) với đoạn 16S của Streptomyces malaysiensis (AF117304); tương đồng 99,2 % (1323/1333 bp) với đoạn 16S ARNr của Streptomyces samsunensis (EU077190) 59 KẾT LUẬN Đã phân lâ ̣p đươ ̣c 34 chủng xạ khuẩn từ mẫu đấ t ở Lào Có 14 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh với vi sinh vâ ̣t kiể m đinh ̣ Đã xác đinh ̣ đă ̣c điể m hin ̀ h thái , đặc điểm sinh lý và sinh hóa chủng xạ khuẩ n ký hiệu C3, L4 và T9 cho thấy chúng phát triển tối ưu môi trường trường không có NaCl, pH và nhiệt độ 30°C Đã phân loại chủng xạ khuẩn T9 cho thấy chủng tương đồng 99,8% (1331/1333 bp) với đoạn 16S ARNr của Streptomyces malaysiensis (AF117304) KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu thử hoa ̣t tính kháng sinh của các chủng xa ̣ khuẩ n với các nấ m - Nghiên cứu phân tích cấu trúc chất hoạt tính sinh học từ chủng T9 60 Tài liệu tham khảo Tiế ng Viêṭ Ngô Điǹ h Biń h (2005), Vi sinh vật học công nghiê ̣p, Trung tâm Khoa ho ̣c Tự nhiên và Công nghê ̣ Quố c gia, Hà Nội, trang 34-45 Ngô Điǹ h Quang Biń h (2005), Vi sinh vật học công nghiê ̣ , Viê ̣n sinh thái và Tài nguyên sinh vâ ̣t , Trung tâm Khoa ho ̣c tự nhiên và Công nghê ̣ Quố c gia , Hà Nội, trang 53-61 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghê ̣ lên men các chấ t kháng sinh , NXB khoa học và kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Văn Cách , Lê Văn Nhương (2009), Cơ sở công nghê ̣ sinh học , tập 4công nghê ̣ vi sinh vật , NXB Giáo du ̣c Tô Minh Châu (2002), Giáo trình thực tập vi sinh vật học , Đa ̣i ho ̣c Nông Lâm , TP.HCM Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Thị Kim Cúc, Lê Tiến, Trịnh Ngọc Hoàng (2007) Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất thái nguyên, tạp chí Khoa học và Công nghê ̣ số 3(43) trang 90-94 Vi Thi ̣Đoan Chiń h (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimousus R 77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằ ng kỹ thuật dung hợp tế bào trầ n , Luâ ̣n án Tiế n si ̃ Sinh ho ̣c , Viê ̣n công nghê ̣ sinh ho ̣c, Hà Nội Vi Thi ̣Đoan Chính (2009), Tuyể n chọn và nghiên cứu xạ khuẩn có khả đố i kháng với một số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện , Báo cáo tổng kết đề tài khoa học và công nghệ cấp Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty (2009), Vi sinh vật học, NXB Giáo du ̣c 10 Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đin ̀ h Quyế n , Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học , NXB Giáo dục, Hà Nội 11 Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Kim Nư Thảo (2006), Các nhóm vi khuẩn chủ yếu , Vietsciences, Hà Nội 12 Nguyễn Lân Dũng , Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tâ ̣p III, NXB Khoa ho ̣c và kỹ thuâ ̣t, Hà Nội 61 13 Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đình Quyế n , Phạm Văn Ty (1977), Vi sinh vật học tâ ̣p II, Nhà xuất bán Đái học và Trung học chuyên nghiệp , Hà Nội 14 Nguyễn Thành Đa ̣t (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật , tập 1, NXB Đa ̣i ho ̣c S phạm Hà Nội 15 Nguyễn Thành Đa ̣t , K.A Vinogradva V.A Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử xạ khuẩn sinh chromomycin , Act.A buraviensis, microbiologia, TXL, III, N5, NXB Academia cccp 16 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chấ t khá ng sinhchố ng nấ m gây bê ̣nh thực vật ở Viê ̣t Nam , Luâ ̣n á n Tiế n si ̃ Sinh ho ̣c , Trường Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.3-20 17 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chấ t kháng sinh chố ng nấ m phân lập từ đấ t Quáng Nam -Đá Nẵng , Luâ ̣n án tiế n si ̃ sinh ho ̣c , Đa ̣i ho ̣c Sư pha ̣m , trang Hà Nội, tr 56-69 18 Lê Mai Hương (1993), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chấ t kháng sinh phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận , Luâ ̣n văn phó tiế n si ̃ sinh ho ̣c , Đa ̣i ho ̣c Tổ ng hơ ̣p Hà Nô ̣i, trang 83-95 19 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chấ t kháng sinh chố ng nấ m gây bê ̣nh đạo ôn và thố i cổ rễ phân lập ở Việt Nam , Luâ ̣n án Phó tiến sĩ sinh học,Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c, trang 68-73 20 Phan Quố c Kinh (2004), "Vài nét về tình hình sản xuất hóa dược thế giới ", Tạp chí công nghiệp hóa chất, số 4, trang 37-46 21 Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y ho ̣c, Hà Nội 22 Lê Văn Ta ̣o (1997), Bê ̣nh Escherichia coli gây những thành tựu mới về nghiên cứu phòng chố ng bê ̣nh ở vật nuôi , tài liệu giảng dạy sau đại học cho bác sĩ thú y và kỹ sư chăn nuôi, Viên thú y quố c gia, Hà Nội, trang 207-213 23 Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấ n , Vi Thi ̣Đoan Chính, Ngô Đình Bính (2009), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh sinh kháng vi khuẩn Xanthomonasoryzae gây bê ̣nh bạc lá lúa, Báo cáo khoa học Hội nghị CNSH toàn guốc, trang 71-80 24 Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học, NXB Giáo du ̣c 25 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trầ n Thi ̣Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiê ̣p, Hà Nội, tr 81-89 62 26 Cao Thanh Chính Trung (2000), Khảo sát sự hiện diện E coli, Staphylococcus aureus, Salmonella môi trường chăn nuôi gà công nghiê ̣p Luâ ̣n án tiế n si ̃ khoa chăn nuôi, Trường đa ̣i ho ̣c nông lâm TP.HCM, tr 75-86 27 Vũ Thị Thứ (1996), Nghiên cứu đặc điể m sinh học và khả ứng dụng của một số chủng vi khuẩn thuộc chỉ Bacilllus subtilis , Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh ho ̣c, Viên sinh ho ̣c nhiê ̣t đới, trang 78-86 28 Trầ n Thi ̣Cẩ m Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường , NXB Đa ̣i ho ̣c Quố c gia Hà Nô ̣i Tiế ng Anh 29 Ashutosh K (2008), "Pharmaceutical Microbiology", New Age International Ltd, pp 89-101 30 Adhikari T B (1993), "Identification of biovars and races of Pseudomonas solanacearum and source of resistance in tomato in Nepal", Plant disease, Vol 77, pp 905-907 31 Agrios, G N (1997), Plant Pathology, 4th Edition, Academic Press, San Diego, USA 32 Bibb (2005), "Regulation of secondary metabolism in Streptomyces", Curr Opin Mivrobiol, 8, pp 208-215 33 Bremer, P J., Fletcher G C., and Osbome, C (2004), Staphylococcus aureus, New Zealand Institute for Crop and Food Research, pp 570-672 34 Bhattacharya D., Nagpure A., Gupta R k (2007), "Bacterial chitinases: properties and potential", Critical Reviews in Biotechnology, 27(1), pp 21-28 35 Clarridge J E (2004), "Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases", Clinical Microbiology Reviews, Vol 17(4), pp 840–862 36 Demain A L and Sanchez S (2009), "Microbial drug discovery: 80 years of progress", The Journal of Antibiotics, pp 5-16 37 Emelda E J et al (2012), "Antimicrobial Activity of Antibiotic Producing Streptomyces macrosporu"s, IOSR Journal of Pharmacy and Biological Science, ISSN: 2278-3008, pp 20-23 38 Fred C Tenover (2006), "Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria", Amer.J Med, 119, pp 3-10 63 39 Geschva, A Shurk and W Romer (1917), "Phosphate inhibition of secondary metabolism in Streptomyces and its reversal by cyclic", AMP, Arch, Microbiol, 121, pp 91-96 40 Hopwood D.A and Mj Merrich (1997), "Genetics of antibiotic production", J Bacteriol, pp, 596-636 41 Horikoshi K (1999), "Alkaliphiles: some application of their products for biotechnology", Microbiology and Molecular biology, 63(4), pp 735-750 42 Jemimah N S V., Srinivasan M., Devi C S (2011), "Novel anticancer compounds from marine actinomycetes", J Pharma Ress., 4(4), pp 1285-1287 43 J.H.Auh, H.Y.Chae, Y.R.Kim, K.H.Shim, S.H.Yoo, K.H.Park (2006), "Modification of rice starch by selective degradation of amylose using alkalophilic bacillus cyclomaltodextrinase", J Agric, Food Chem, pp 324-337 44 Jang H D and Chang k S (2005), "Thermostable cellulose from Streptomyces sp scale-up production in a 50-1 fermenter", Biotechnology Letters, 27 (4), pp 239-242 45 Jeya K.R., K Kiruthika and M Veerapagu (2013), "Isolation of antibiotic producing Streptomyces sp from soil of Perambalur district and a study on the antibacterial activity against clinical pathogens, International Journal of PharmTech Research, Vol.5, pp 1207-1211 46 John Mann (2011), "Natural products as immunosuppressive agents", Natural Product Reports, Vol 18, pp 417-430 47 Kasana R.C., Salwan R., Dhar H., Dutt S and Gulati A (2008), "A Rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s Iodine", Curr Microbiol, pp 503-507 48 Kenneth Todar (2005), Todar’s Online Textbook of Bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology (Staphylococcus), Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology 49 Kar S and Ray R C (2008), "Statistical optimization of α-amylase production by Streptomyces erumpens MTCC 7317 cells in calcium alginate beads using response methodology", Polish Journal of Microbiology, 51 (1), pp 49-57 50 Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V and Clark, D.P (2009), In Brock biology of microorganism 20th edition, Pearson, Benjamin Cummings, Pearson 64 Education, Inc 51 MA Elberson, F Malekzadeh, M.T.Yazdi, N Kameranpour, M.R NooriDaloii, M.H Matte, M Shahamat, R.R Cowell, K.R.Sower (2000), "Cellulomonas persica sp nov and cellulomonas iranensis sp nov., mesophilic cellulos- degrading bacteria isolated from forest soils", J Syst Evol Microbiol, 50, pp 993 52 Mary K Sandel and John L McKillip (2002), "Virulence and recovery of Staphylococcus aureus to the food industry using improvement on traditional approaches", Food control, 15, pp 5-10 53 Mitra P (2005), "An extracellular protease with depilation activity from Streptomyces nogalator", J Scientific Journal of Scientific and Industrial Res., 1(2), pp 105-116 54 Mihu M.R., J P R and D.Nosanchuk (2014), "The impact of antifungals on toll-like receptors", Frontiers in microbiology, pp 4-5 55 Mason et al (2001), "Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a Case of mistaken identity", Applied and Environmental Microbiology, Vol 67 (10), pp 4512-4519 56 Nordmann p., Dortet L and Poirel L (2012), "Carbapenem resistance in Enterobacteriace: here in the storm", Trends in Molecular Medicine, 18 (5), pp 263-272 57 Oldfield C., N T Wood, S C Gilbert, F D Murray and F R Faure (1998), "Desulphurisation of benzothiophene and dibenzothiophene by Actinomycete organisms belonging to the genus Rhodococcus, and related taxa", Antonie van Leeuwenhoek, Vol 74(1-3), pp 119-132 58 Pasti M B., A L Pometto, M P Nuti and D L Crawford (1990), "Ligninsolubilizing ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gut", Applied and Environmental Microbiology, Vol 56 (7), pp 2213-2218 59 R Gupta, O.K Beg, P Lorenz (2002), "Bacterial alkaline protease: molecular approaches and industrial application", Appl, Biotechnol, 59 (1), 15-20 60 Rathan R K and Ambili M (2011), "Cellulose enzyme production by Streptomyces sp using fruit waste as substrate", Australian J, Basic, Appl, Scien, (12), pp 1114-1118 65 61 Robert E (1985), "Vincristine, dactinomycin, and cyclophosphamide in the treatment of malignant germ cell tumors of the ovary", A gynecologic oncology group study, Cancer, Vol 56 (2), pp 243-248 62 Stuart H (2006), "Essential microbiology", John Wiley & Sons Ltd, pp 191-370 63 Saga T., Yamaguchi K (2008), "History of antimicrobial agents and resistant bacteria", J Japan Med Assoc, 137, pp 513-517 64 Scott E M., John J I., Harvey, J., Gilmour, A., Sita R T., Reginald Bennett and Bergdoll, M.S (2000), "Staphylococcus Encyclopedia of Food Microbiology", Academic Press, San Diego - San Francisco - New Yolk – Boston – London – Sydney – Tokyo, pp 2062-2083 65 Shirling E B., D Gottlieb Methods for Characterization of Streptomyces species Vol 16 No International Journal of Systematic Bacteriology 66 Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes Classification, Identification and descriptions of genera and species, Vol 2, The Williams and Wilkins Co.,Baltimore, USA 67 William S.T and Davies F.L (1965), "Use of antibiotics for selective isolation and enumeration of actinomycetes in soil", J Gen, Microbiol, 38, pp 251-261 68 Yang C H and W H Liu (2004), "Purification and properties of a maltotrioseproducing alpha-amylase from Thermobifida fusa", Enzyme and Microbial Technology, 35, pp 254-260 69 Zhang JF, Liu JJ, Lu MQ, Cai CJ, Yang Y, Li H, Xu C, Chen GH (2007), "Rapamycin in hibits cell growth by induction of apoptosis on hepatocellular carcinoma cells in vitro", Transp Immunol, 17 (3): 162-170 Trang Web 70 https://voer.edu.vn 71 http://muou.sc.mahidol.ac.th/research_wp_strep.html 72 http://www.denniskunkel.com 73 http://www.actizapharmaceutical.com 74 http://www.planetnatural.com 75 http://www.ecvv.com 66 ... ̣c của mô ̣t số chủng xạ khuẩn phân lâ ̣p từ đấ t ở Lào Mục tiêu nghiên cƣ́u  Phân lâ ̣p, tuyể n cho ̣n và nghiên cứu số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn từ đất ở Lào. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Keo Phommavong NGHIÊN CƢ́U ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦ A MỘT SỐ CHỦ NG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO Chuyên... xạ khuẩn tự nhiên .3 1.2 Đặc điểm sinh học- hình thái của xạ khuẩn .4 1.2.1 Cấ u ta ̣o tế bào của xa ̣ khuẩ n 1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn