MỞ ĐẦU Hàng nghìn năm phát triển loài người thời đại Hóa học tổng hợp với sản phẩm thuốc hương liệu nhân tạo người phải dựa vào sản phẩm từ thiên nhiên, chủ yếu từ thực vật Ngày nay, Hóa học hợp chất thiên nhiên nhiên tìm ứng dụng sản phẩm dược từ loại thực phẩm chức năng, loại thuốc thay thế, bổ sung dự phòng, chất màu hương liệu công nghiệp thực phẩm, chất thơm tinh tế cho sản phẩm nước hoa hương liệu có giá trị cao Dù cótính an toàn có nguồn gốc thiên nhiên, khoa học cần giải nhiều vấn đề phức tạp chế tác dụng thực hợp chất thiên nhiên, cách thức chúng tương tác hiệp đồng với tác dụng lên hệ sinh học, đường chuyển hóa chúng qua đưa vào hệ sinh vật sống … bổ sung thêm cho chất nhiều tính chất phù hợp cho sản phẩm ứng dụng tăng cường tác dụng sinh học.Các nghiên cứu thực thành công sở kiến thức khoa học toàn diện thành phần hóa học chất có thực vật dùng làm thuốc, thực phẩm hương liệu Đái tháo đường bệnh mãn tính nội tiết mức glucose cao máu Chất peptid hocmon insulin thể chuyển hóa đường, tinh bột thực phẩm khác thành lượng, chất không tạo thành sử dụng hợp lý dẫn đến bệnh đái tháo đường dạng I II.Ở dạng I thể tạo thành insulin, dạng II kết từ kháng insulin Điều trị bệnh tiểu đường dạng II thường sử dụng thuốc insulin, sulphonyl urea, biguanide, metformin, acarbose, thiazolidinedion, ví dụ acarbose thuốc ức chế enzym thủy phân cacbohydrat α-glucosidase, qua làm chậm giảm hấp thu tiêu hóa cacbohydrat Các tài liệu dược lý học dân tộc cho thấy giới có khoảng 800 thuốc ghi nhận có tác dụng điều trị đái tháo đường dạng II,con số kiểm chứng qua thử nghiệm sinh học không nhiều, hoạt chất thuộc nhóm flavonoid, terpenoid-steroid, alkaloid, cacbohydrat, amino acid phát qua số mô hình thử nghiệm in vitro in vivo.Y học dân gian Việt Nam ghi nhận vài thuốc tác dụng lên bệnh đái tháo đường dạng II Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ Cucurbitaceae, Ổi (Psidium guajava L.), Chuối hột (Musra barjoo Sieb.) thuộc họ Musaceae, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre), Xoài (Mangifera indica L.) thuộc họ Anacardiaceae, Quế (Cinnamomum cassia Bl.) thuộc họ Lauraceae, Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.)Merr & Perry)thuộc họ Sim (Myrtaceae).Vối lớn mọc nhiều vùng nông thôn miền Bắc, có nụ dùng để sắc nước uống Một vài nghiên cứu sàng lọc hoạt tính hạ đường huyết máu cao chiết từ nụ Vối qua tác dụng ức chế enzym -glucosidase công bố năm gần cho thấy sở khoa học ghi chép dân gian Tuy nhiên cần có thêm chứng cớ khoa học liên kết tác dụng với chất thành phần có hỗn hợp phức tạp cao chiết từ nụ Vối Nếu phát hoạt chất ảnh hưởng đến bệnh đái tháo đường sử dụng hợp lý thuốc đưa ra, dựa phân tích cẩn thận định tính định lượng hoạt chất liều lượng thuốc chứa lượng đủ hoạt chất sử dụng Các nghiên cứu hóa học Vối Việt Nam thực thiếu hệ thống chưa tương quan thành phần hóa học với việc điều trị bệnh đái tháo đường, đó, khuôn khổ luận văn thạc sĩ nghiên cứu thực với mục tiêu góp phần hệ thống hóa thành phần hóa học có Vối liên hệ chúng với tác dụng chữa bệnh đái tháo đường Vối Các nội dung nghiên cứu luận văn là: 1) Thực qui trình chiết etanol etanol-nước để điều chế cao chiết có tác dụng ức chế enzym -glucosidase từ Vối 2) Phân tách sắc ký phân tích điều chế để phân lập hợp chất thành phần có phần chiết etanol etanol-nước từ Vối 3) Xác định cấu trúc hợp chất phân lập phương pháp phổ đại MS NMR 4) Liên hệ hợp chất phân lập với tác dụng lên bệnh đái tháo đường Vối CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ SIM–MYRTACEAE [8] Họ Sim-Myrtaceae phân bố vùng rừng nhiệt đới Á nhiệt đới, chủ yếu châu Mỹ châu Úc.Họ Sim họ lớn gồm 90 chi 3000 loài, thuộc họ Sim có đặc điểm thực vật sau: Cây gỗ lớn, nhỡ bụi Lá đơn, mép có khía răng, thường mọc đối có tuyến mỡ Hoa mọc thành cụm nách hay đầu cành, có hình xim hình chùm Hoa lưỡng tính Đài hình ống dính hoàn toàn vào bầu hay dính Lá đài gồm 4-5 cánh xếp lợp vào nhau, có ống dài nguyên Lá chúng thuộc loại thường xanh, mọc so le hay mọc đối, đơn thông thường có mép nhẵn (không khía cưa) Hoa thường có cánh hoa, vài chi cánh hoa nhỏ hay Nhị hoa thường dễ thấy, có màu sáng nhiều lượng.Nhị xếp thành hay nhiều dãy rời hoàn toàn dính gốc thành ống ngăn: bao phấn đính lưng hay gốc Đĩa mật hay có hình vành khăn, che kín phía gốc vòi Bầu hoàn toàn hạ hay hạ phần, có 4-5 nhiều hơn; vòi đơn kéo dài, đầu tròn, chia 3-4 thùy; bầu noãn xếp thành hai hay nhiều dãy Quả nang thịt, có sợi thường bọc kín ống đài.Trong thường có hạt, hạt có nội nhũ, phôi thẳng hay cong, nạc với hai mầm không xa Các thuộc họ Sim thường mọc xen lẫn với gỗ khác thành đai rừng nhiệt đới, mọc loại 1.1.1 ChiCleistocalyx [5, 11] Chi Cleistocalyx chi tương đối lớn họ Sim Ngoài đặc điểm chung họ Sim: thường gỗ nhỡ, mọc đối, có cuống; phiến có gân bên xếp hình lông chim.Cụm hoa nách ngọn, dạng chùy Hoa lưỡng tính, đài có đài dính từ nụ rơi toàn thành vòng phần lại đài bầu, loài thuộc chi Cleistocalyx có đặc điểm thực vật riêng: nạc, chín không nở Vòi lông, ô vách ngang chia thành ô nhỏ, ống đài nguyên hay rách bất định, đài nguyên thành mũ, mập có hạt.Cụm hoa xim hay chuỳ Sau số đại diện thuộc chi Cleistocalyx thường thấy Việt Nam 1.1.1.1 Cleistocalyx circumcissa (Trâm ô) Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc cao 15m, nhánh mảnh, có phiến xoan thon, dài 4-7cm, chót có mũ, có đốm gân phụ, mảnh, nụ cao 13mm, rộng 3mm, phần đài cánh hoa làm thành lớp rụng sớm với nhị, noãn gồm buồng, mập Hình 1: Cleistocalyx circumcissa Phân bố: rừng Biên Hoà 1.1.1.2 Cleistocalyx nigrans (Trâm đen) Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh vàng đỏ Lá có phiến bầu dục, màu nâu đen mặt lúc khô, gân phụ cách 2-3mm, cuống dài 1cm Chùm tụ tán cao 6cm nhánh, hoa trắng, nụ dài 5mm, hoa cánh rụng lượt, tiểu nhị nhiều Quả mập tròn, lúc khô đen, to 1cm, hạt Hình 2: Cleistocalyx nigrans Phân bố: rừng Bình Dương, Thủ Đức 1.1.1.3 Cleistocalys nervosum(Trâm nắp vối) Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc trung, nhánh non dẹp, không lông Lá có phiến bầu dục thon, dài 12-13cm, có đốm nâu, gân phụ vào 10 cặp, gân cách bìa 3-5mm Phát hoa nách rụng, cao 5-8cm, đài hình đĩa đứng, nắp cao; hoa có cánh, cao 3mm, có nhiều tiểu nhụy Phì tròn hay dài, to 7-14mm, đỏ đỏ đen chói, nạc ngọt, hạt Hình 3: Cleistocalys nervosum Phân bố: rừng Bắc Trung Nam 1.1.1.4 Cleistocalyx rehnervinus(Vối gân mạng) Đặc điểm thực vật: Cây đại mộc nhỏ, nhánh tròn xám, to 2-3mm Lá có phiến bầu dục đến trái xoan, to 9-14x5,5-7cm chót rộng, đáy tròn gân phụ mịn, cách 4-8mm, gân cách bìa 2-3mm Phát hoa Hoa không cọng, cao 7mm, đài rụng thành chóp, tiểu nhụy nhiều Trái tròn, to 1,5mm, lùm bụi Hình 4: Cleistocalyx rehnervinus Phân bố: tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam 1.1.1.5 Cleistocalyx consperipuactatus (Vối nước) Đặc điểm thực vật: Cây gỗ thường xanh, cao 20-25m Vỏ dày 6-8mm, màu xám trắng hay nâu đen nhạt Cành non màu nâu xám, hình vuông, lúc già hình cột tròn Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục dạng trứng ngược dài 6-12cm, rộng 2,5-5,5cm, đầu tròn tù Hoa mọc cụm, sinh đầu cành.Hoa lưỡng tính, đài đính thành thể dạng mũ, lúc nở hoa rụng dạng vòng.Nhiều nhị, rời nhau, lúc chồi hoa cong vào Quả mọng hình cầu hay hình trứng, lúc chín có màu nâu tím Một năm có mùa hoa nở vào tháng tháng Hình 5: Cleistocalyx consperipuactatus Phân bố: Thanh Hoá, Nghệ Tĩnh, Bình Trị Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, GiaLai-KonTum 1.1.2 Một số nghiên cứu dược lý chi Cleistocalyx Năm 2012, Charoensin S.và cộng đánh giá tác dụng chống đột biến dịch chiết nước Cleistocalyx nervosumvar panialainvitrovà mô hình động vật thực nghiệm [16] Cleistocalyx nervosum var paniala, tìm thấy miền Bắc Thái Lan, có ăn chứa lượng lớn hợp chất phenolic có tác dụng chống oxi hóa Dịch chiết nước trái chín đánh giá an toàn tác dụng gây độc gen độc tính Dịch chiếtC nervosum không gây đột biến vi khuẩn Salmonella typhimurium chủng TA98 TA100 có kích hoạt trao đổi chất,có tác dụng chống gây đột biến trung bìnhvới độc tố aflatoxin B1 Phân tích phổ ESI-MS cho thấy dịch chiết có lượng lớn anthocyanin, bao gồm cyanidin-3,5diglucosid,cyanidin-3-glucosid cyanidin-5-glucosid C nervosum nồng độ 5.000 mg/kg thể trọng không gây độc tính cấp tính chuột Một thử nghiệm thực để phát hiệnảnh hưởng cáccleistogenlàm đứt gãy nhiễm sắc thể Các dịch chiết liều 1.000 mg/kg không gây hình thành vi nhân gan chuột Các nghiên cứu cung cấp liệu cho thấy an toàn hiệu lực chống gây đột biếncủa dịch chiết nước trái C nervosum Năm 2014, Taya S cộng nghiên cứu ảnh hưởng Cleistocalyxnervosum (CE) diethylnitrosamine (DEN) phenobarbital (PB) gây stress oxy hóa giai đoạn đầu ung thư gan chuột Chuột đực Wistar chia thành nhóm, với nhóm làđối chứng âm nhóm nhóm tích cực tiêm DEN tuần lần PB nước uống tuần Hai tuần trước bắt đầu điều trị DEN PB, nhóm cho ăn với liều 500 1000 mg/kg CEStrong tuần Kết số ổ GST-P, tổn thương tiền ung thư gan tăng đáng kể chuột gây ung thư, giảm chuột điều trị 1000 mg/kg CE CE gây giảm malondialdehyde huyết gan chuột điều trị với DEN PB Hơn nữa, CE tăng đáng kể peroxidase, hoạt tính glutathione catalase gan chuột Như nghiên cứu Cleistocalyx nervosum (CE) điều chỉnh trạng thái chống oxy hóa ngăn ngừa ung thư[40] Năm 2015, Manosroi J vàcộng nghiên cứu hoạt tính chống lão hóa in vitro chất chiết từ Cleistocalyxnervosum var paniala[31].Lá chiết nước, metanol, chloroform cách chiết siêu âm chiết nóng.Các dịch chiết xác định tổng phenolic flavonoid Các dịch chiếtở 0,001-10 mg/mlđược thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính ức chế tyrosinase sử dụng phương pháp so màu Khả gây độc dịch chiết 0,0001-1 mg/ml xác định với nguyên bào sợi da người Ngoài ra, dịch chiết 0,001, 0,01 0,1 mg/ml độc tính.Dịch chiết lạnh metanol già cho tổng sốliều phenolic cao 511,44±18,23 mg GAE/mg hàm lượng flavonoid 262,96±2,98 mg QE/mg Dịch chiết cũngquét gốc tự do, ức chế peroxid hóa lipid, ức chế tyrosinase với giá trị SC50, IPC50 IC50là 0,02±0,004, 0,23±0,13 0,02±0,006 mg/ml Dịch chiết 0,1 mg/ml ức chế MMP-2 cao 91,14±1,67%.Dịch chiết lạnh metanol từ già tiếp tục phát triển thành tác nhân chống lão hóa Năm 2016, Poontawee W cộng nghiên cứu tác dụng bảo vệ Cleistocalyx nervosum var paniala cadmium Cadmiumgây độc thận vấn đề sức khỏe môi trường nghiêm trọng cuối kết thúc với bệnh thận giai đoạn cuối [36] Cơ chế sinh hóa kim loại nặng độc hại có liên quan đến stress oxi hóa Nghiên cứu khảo sát xem liệu Cleistocalyx nervosum var paniala(CNFE) bảo vệ chống lại hư hại oxi hóa thậngây cadmium Phân tích ban đầu cho thấy khả chống oxy hóa caocủa dịch chiết nồng độ polyphenol, đặc biệt catechin Tác dụng với thận dịch chiết đượcnghiên cứu chuột xử lývới tá dượcCNFE, cadmium (2 mg/kg), cadmium cộng CNFE (0,5, 1,2 g/kg) bốn tuần Sự hư hại thận oxi hóathận phát triển sau tiếp xúc với cadmium lưu giữ nitơ urê máu creatinin, giảm lọc cầu thận, tổn thương cấu trúc thận, với nitric oxide malondialdehyde tăng, chất chống oxi hóathiol, superoxide dismutase, catalase giảm mô thận Sự gây độc thận cadmium giảm chuột bổ sung CNFE, đặc biệt liều 2g/kg Có thể kết luận CNFE bảo vệ chống lại gây độc thận cadmium, chủ yếu qua tác dụng chống oxi hóa Các kết cho thấy vai trò chất chống oxi hóa thiên nhiên việc chống lại bệnh khác gây phá vỡ cân nội môi oxi hóa khử 1.2 CÂY VỐI (CLEISTOCALYX OPERCULATUSROXB MERR ET PERRY) 1.2.1.Đặc điểm thực vật [7] Cây Vối có tên khoa học Cleistocalyx operculatus Roxb Merr et Perry, thuộc họ Sim (Myrtaceae), loại thân mộc cỡ vừa, cao tới 12-15 m Vỏ màu nâu đen, nứt dọc Cành tròn hay có hình cạnh, nhẵn.Lá có cuống dài 8-20 cm, hình trái xoan ngược hay bầu dục, hình trứng rộng 5-10 cm, giảm nhọn gốc, có mũi nhọn ngắn, hai mặt màu nhạt có đốm màu nâu, phiến dày, dai, cứng, già có chấm đen mặt Hai mặt có đốm màu nâu, cuống ngắn tầm 1-1,5 cm Hoa nhỏ gần cuống, màu trắng lục, họp thành cụm 3-5 hoa nách Nụ hoa dài, cánh, nhiều nhị Cụm hoa hình tháp, trải kẽ rụng Cây hoa tháng 5-7 Quả hình cầu hay hình trứng, nhăn nheo, đường kính 7-12 mm, nháp, có dịch, chín màu tím Toàn lá, cành non nụ vối có mùi thơm đặc biệt dễ chịu câyVối [1,8] Hình 6:Lá Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb Merr et Perry) 1.2.1.1 Phân bố Cây Vối trồng mọc hoang khắp tỉnh nước ta trồng nhiều vùng quê miền Bắc, chủ yếu để lấy ủ nấu nước uống Có loại vối thường gặp vối nếp (lá nhỏ bàn tay có màu vàng xanh) vối tẻ (lá to bàn tay, hình thoi màu xanh thẫm) Vối thấy nước nhiệt đới thuộc Châu Á tỉnh Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, Vân Nam Trung Quốc; Bangladesh, Ấn Độ, Myanma, Campuchia, Lào, Thái Lan, Việt Nam, đảo Java, Kalimantan, Sumatra Indonesia, Malaysia, Philippines lãnh thổ Bắc Úc Úc[4,8] 1.2.1.2.Công dụng dân gian[4] Vối trồng để lấy gỗ dùng xây dựng, làm công cụ, vỏ có chất dùng để nhuộm đen Quả vối ăn được.Lá vối tươi đem thái nhỏ, rửa nhựa cho vào thùng ủ đen lấy rửa sạch, phơi khô dùng để nấu làm nước uống thông dụng nông thôn Việt Nam Theo Viện nghiên cứu Đông y: vối tươi hay sắc khô nụ vối vối có tác dụng kháng sinh đối nhiều loại vi khuẩn Gram (+), Gram (-), Streptococus (hemolytic staman), vi trùng bạch hầu, Staphyllococcus, Pneumcoccus, phế cầu, Salmonella, Bacillus subtilis, không gây độc hại thể Chính mà vối tươi hay khô sắc đặc coi loại thuốc sát khuẩn dùng trị liệu bệnh da ghẻ lở, mụn nhọt lấy vối tươi nấu lấy nước đặc để gội đầu chữa chốc lở hiệu nghiệm Nụ vối, vối chữa số bệnh đường ruột, viêm họng đạt kết tốt, dùng dạng thuốc sắc, thuốc cao hay viên dạng muối natri Nụ vối có khả hạn chế tăng đường huyết sau ăn hỗ trợ ổn định đường huyết, hỗ trợ giảm lipid máu, phòng ngừa biến chứng đái tháo đường điều trị lâu dài mà sử dụng nước nụ vối uống thường xuyên Nước vối loại có công hiệu giải khát ngày hè nóng nực, làm mát lợi tiểu nên có công đào thải độc chất thể qua đường tiết niệu nụ vối hãm lấy nước uống hàng ngày làng quê Việt Nam Người ta uống nước sắc vối để chữa bệnh tiêu chảy tắm nước sắc vối Nước sắc vối ủ có tác dụng lợi mật điều giải thích nhân dân ta thường uống nước sắc vối để chữa bệnh đầy bụng, khó tiêu Một số thuốc chữa bệnh từ Vối: - Trị đau bụng ngoài, phân sống: Lá vối cái, vỏ ổi g, núm chuối tiêu 10g Cùng thái nhỏ phơi khô sắc với 400 ml nước, 100 ml chia lần uống ngày, dùng liền 2-3 ngày - Chữa đầy bụng, không tiêu: Vỏ thân vối 6-12 g, sắc kỹ lấy nước đặc uống lần/ngày dùng nụ vối 10-15 g, sắc lấy nước đặc uống lần ngày - Chữa lở ngứa, chốc đầu: Lá vối vừa đủ nấu kỹ lấy nước để tắm, rửa nơi lở ngứa gội đầu - Viêm gan, vàng da: Dùng rễ vối 200 g sắc uống ngày - Chữa viêm đại tràng mạn tính, đau bụng âm ỉ, thường xuyên phân sống: 200g vối tươi, vò nát, dùng lít nước sôi, ngâm uống thay nước 10 Phổ 13 C-NMR DEPT CO8 có mặt nhóm cacbonyl liên hợp α,β không no δC 177,4 (s); cacbon sp2 có cacbon liên kết với oxy δC 165,6 (s), 162,5 (s), 160,5 (s), 158,3 (s), 148,1 (s), 137,1 (s), 123,7 (s) 104,6 (s); nhóm methin vòng thơm δC 130,7 (2d), 116,3 (2d), 99,3 (d) 94,5 (d) Các kiện phổ NMR cho thấy cấu trúc CO8là kaempferol phù hợp với phổ tài liệu tham khảo đo dung môi [38] Kaempferol phân lập từ nụ Vối Việt Nam Kaempferol chứng minh có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase với giá trị IC50 55±5 mM(8,41µg/ml) [10] ♦ Chất CO9(Quercetin) Hợp chấtCO9 phân lập từ phần chiết etyl axetat Vối dạng tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c 295-297 oC, Rf = 0,4 (TLC, silica gel, diclometan-axeton 4:1, v/v) OH 3' 2' HO O 4' 1' OH 5' 6' 10 OH OH O Quercetin – CO9 Công thức phân tử C 15H10O7 CO9 giả thiết từ phổ ESI-MS với xuất pic giả ion phân tử m/z 303 ([M + H]+) 301 ([M - H]-) Phổ 1H-NMR (CD3OD) CO9cho thấy có mặt nhóm tín hiệu cộng hưởng từ proton δH 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,41 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,9 (1H, d, J = 9,0 Hz),7,65 (1H, dd, J = 9,0 Hz, 2,0 Hz) 7,75 (1H, d, J = 2,0 Hz) Các tín hiệu đặc trưng cho cấu trúc khung flavonol với vòng A bị 5,7-dihydroxy vòng B có phần cấu trúc catechol (3,4-dihydroxy) 47 Các kiện phổ 1H-NMR cho thấy cấu trúc CO9 quercetin chồng khít với phổ tài liệu tham khảo đo dung môi [35] Quercetin phân lập từ nụ Vối Việt Nam Quercetin chứng minh có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase tốt với giá trị IC50 29,4 mM (8,88 µg/ml)[26] ♦ Chất CO10 (Axit arjunolic) Hợp chất CO10 phân lập từ phần chiết etanol-nước Vối dạng tinh thể hình que màu vàng, đ.n.c 295-297 oC, Rf = 0,4 (TLC, silica gel, diclometan-axeton 4:1, v/v) 30 29 19 12 25 HO 11 23 22 17 14 HO 18 26 13 21 20 16 COOH 28 15 27 24 OH Axit arjunolic – CO10 Phổ 1H-NMR CO10chỉ có mặt nhóm metyl bậc dạng singlet H0,72 (3H, s), 0,86 (3H, s), 0,95 (3H, s), 0,98 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,22 (3H, s), hai nhóm oxymetin H3,37 (1H, d, J = 9,5 Hz), 3,71 (1H, m) proton olefinic H 5,28 (1H, t, J = 3,5 Hz) Độ chuyển dịch hóa học proton nối đôi cho thấy vị trí C12/C-13 nối đôi Do khác biệt nhiều tín hiệu proton cacbon-13 vòng B, C, D E CO10 khiđược so sánh với axit maslinic (CO7), nhóm hydroxy giả thiết liên kết vào vị trí C-2 C-3 vòng A Khi giữ nguyên nhóm hydroxy C-3 phân tích số tương tác proton cacbinol quan sát thấy dịch chuyển phía trường thấp H-3 từ H 3,2 H 3,71; điều cho giả thiết nhóm hydroxy lại liên kết vào C-2 Trong 48 trường hợp nhóm hydroxy định hướng 2αvà3βdo số tương tác J = 9,5 Hz H-3axial H-2axial 11,5 Hz H-2axial H-1axial 9,5 Hz H2axial H-3axial Sự thiếu hụt nhóm metyl giải thích tín hiệu hệ AB với số tương tác J = 11,0 Hz nhóm hydroxymetyl C-23 Một cách tương ứng tín hiệu cộng hưởng cacbon-13 C-24 chuyển dịch trường cao từ C 17,6 axit maslinic C 13,9 axit arjunolic Các tín hiệu cacbon-13 lại hoàn toàn phù hợp với phổ công bố chất với 30 tín hiệu cacbon-13 bao gồm nhóm metyl CH3, 10 nhóm metylen CH2, nhóm metin CH, nhóm oxymetin C 69,9 (d) 78,1 (d), nhóm oxymetylen C 66,2 (t), nối đôi ba lần C 123,4 (t) 145,4 (s) nhóm cacboxyl C 181,8 (s) So sánh phổ 1H-NMR CO10 với kiện phổ chất oleanen-12en tài liệu tham khảo đo dung môi xác định xác cấu trúc CO10 axit arjunolic [43] Axit arjunolic ức chế enzymα-glucosidase với giá trị IC50 45,0±3,6µg/ml [43].Chấtnày chưa phân lập từCleistocalyx operculatus 3.5 TỔNG KẾT CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP 49 ♦ Chất CO1 (1-Tetratriacontanol) OH CH3 ♦ Chất CO2 (2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetyl-chalcon) OH O 2' 1' H3C 3' 4' HO 5' α β 6' O CH3 CH3 ♦ Chất CO3 (β-Sitosterol) 29 28 21 26 18 24 20 12 19 13 10 HO H 50 H 17 H 25 27 ♦ Chất CO4 (Betulin) 29 20 30 H 12 25 11 HO 22 OH 17 28 14 10 18 13 21 19 15 27 23 24 ♦ Chất CO5 (Axit betulinic) 29 30 20 21 19 H 12 22 11 25 26 10 17 COOH 28 15 18 16 HO 13 14 27 24 23 ♦ Chất CO6 (Axit oleanolic) 30 29 19 12 13 11 23 26 14 10 HO 25 18 15 24 51 27 21 22 17 COOH 16 20 28 ♦ Chất CO7 (Axit maslinic) 30 29 20 19 12 13 11 HO 25 17 14 10 28 15 27 COOH 16 HO 22 18 26 21 24 23 ♦ Chất CO8 (Kaempferol) 3' 4' 2' HO 1' O OH 5' 6' 10 OH OH O ♦ Chất CO9 (Quercetin) OH 3' 2' HO O 4' 1' 5' 6' 10 OH O 52 OH OH ♦ Chất CO10 (Axit arjunolic) 30 29 19 12 25 HO 11 23 24 OH 53 16 15 22 17 14 HO 18 26 13 21 20 27 COOH 28 Bảng 1: Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase hợp chất phân lập từ Vối TT Tên chất Ghi Lần 1-Tetratriacontanol(CO1) phân lập 2',4'-Dihydroxy-6'-metoxy-3',5'- Giá trị IC50 (µg/ml) - 4,3±0,2 [10] dimetylchalcon (CO2) β-Sitosterol(CO3) 283,67 [37] Betulin(CO4) Axit betulinic(CO5) 3,6 ± 0,5 [10] Axit oleanolic(CO6) 6,1 ± 0,3 [10] Axit maslinic(CO7) Kaempferol (CO8) 8,41 [10] Quercetin(CO9) 8,88 [26] Lần phân lập Lần phân lập Lần 10 Axit arjunolic (CO10) phân lập 54 10,02±1,24 [41] 5,52±0,19 [23] 45,0±3,6 [43] KẾT LUẬN Luận văn “Nghiên cứu hợp chất thành phần nhằm góp phần đánh giá tác dụng điều trị tiểu đường Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb Merr.et Perry)” thực đầy đủ nhiệm vụ nghiên cứu đặt ra.Trong trình thực đề tài, thu kết nghiên cứu sau: Đã lựa chọn quy trình chiết với etanol etanol-nước để điều chế từ Vối phần chiết có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase phân tách sắc ký để phân lập 10 hợp chấtthành phần nhằm đánh giá ảnh hưởng chúng đến tác dụng điều trị tiểu đường Vối 2.Sử dụng phương pháp phổ đại ESI-MS, H-NMR, 13 C-NMR, DEPT xác định cấu trúc chất phân lập 1tetratriacontanol(CO1), 2',4'-dihydroxy-6'-metoxy-3',5'-dimetylchalcon (CO2), βsitosterol (CO3), betulin (CO4), axit betulinic (CO5), axit oleanolic (CO6), axit maslinic (CO7), kaempferol (CO8), quercetin (CO9), axit arjunolic (CO10).Trong số chất phân lập có3 flavonoid: CO2, CO8, CO9;5 triterpenoid: CO4, CO5, CO6, CO7, CO10;1 ancol mạch dài: CO1 và1 steroid: CO3 Các chất 1tetratriacontanol (CO1), betulin (CO4), axit maslinic (CO7),axit arjunolic (CO10)lần phân lập từ Cleistocalyx operculatus 3.Trong số chất phân lập 9/10 chất chứng tỏ hoạt tính ức chế tốt enzym α-glucosidase qua góp phần giải thích tác dụng ức chế enzym αglucosidase dịch chiết etanol etanol-nước tác dụng điều trị tiểu đường Vối Y học cổ truyền 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên, Lê Khả Kế (1971),Cây cỏ thường thấy Việt Nam (II), NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trương Thị Tố Chinh (2014), “ Nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách tạo chế phẩm từ cao chiết chứa hoạt chất có khả ức chế α-glucosidase từ Vối (Cleistocalyx operculatus Roxb Merr.Et Perry) sử dụng hỗ trợ điều trị tiểu đường”, Đề tài nghiên cứu & phát triển, Bộ Công thương, Hà Nội Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997),“Nghiên cứu thành phần hoá học vối Việt Nam”,Tạp chí Khoa học, 3, 47-51 4.Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam,NXB Y học Hà Nội, 514-515 Phạm Hoàng Hộ (1994),Cây cỏ Việt Nam (II),NXB Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh Đào Thị Thanh Hiền, Phạm Thanh Kỳ(2003),“Nghiên cứu số tác dụng sinh học Vối”, Tạp chí Dược học, 3,22-23 7.https://vi.wikipedia.org/wiki/V%E1%BB%91i (truy cập tháng 12/2015) Đỗ Tất Lợi (1999),Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội,423 Nguyễn Đức Minh (1972),Tính kháng khuẩn thuốc Việt Nam,NXB Y học, Hà Nội 10 Hà Thị Bích Ngọc (2011), “Điều tra nghiên cứu số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội 11.Viện điều tra quy hoạch (1982), Cây gỗ rừng Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội TIẾNG ANH 12 Amor E C., Villasenor I M., Yasin A., Choudhary M I (2004), “Prolyl endopeptidase inhibitors from Syzygium samarangense (Blume) Merr & L M Perry”, Z Naturforsch., 59c, 86-92 56 13 Ayatollahi A M., Ghanadian M., Afsharypour S., Abdella O M., Mirzai M., Askari G (2011), “Pentacyclic triterpenes in Euphorbia microsciadia with their Tcell proliferation activity”, Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 10, 287294 14 Bajpai V K., Dung N T., Suh H I., Kang S C (2010), “Antibacterial Activity of Essential Oil and Extracts of Cleistocalyx operculatus Buds Against the Bacteria of Xanthomonasspp.”, Journal of the American Oil Chemists' Society, 87 (11), 1341-1349 15 Benalla W., Bellahcen S., Bnouham M (2010), “Antidiabetic medicinal plants as a source of alpha glucosidase inhibitors”, Current Diabetes Reviews, (4), 247254 16 CharoensinS., TayaS., WongpornchaiS., WongpoomchaiR (2012), “Assessment of genotoxicity and antigenotoxicity of an aqueous extract of Cleistocalyx nervosum var paniala in in vitro and in vivo models”, Interdiscip Toxicol.,5(4),201-206 17 Chen L S., OuJ J., LiS Y., LuS G.(2014), “Study on quantitative methods of Cleistocalycis operculatus cortex”,Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,39(16), 3128-3130 18.Choi J W., Kim M., Song H., Lee C S., Oh W K., Mook-Jung I., Chung S S., Park K S (2016), “DMC (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone) improves glucose tolerance as a potent AMPK activator”,Metabolism, 65 (4), 533-542 19 Dao T T., Tung B T., Nguyen P H., Thuong P T., Yoo S S., Kim E H (2010), “C-Methylated Flavonoids from Cleistocalyx operculatus and Their Inhibitory Effects on Novel Influenza A (H1N1) Neuraminidase”, J Nat Prod 73, 1636-1642 20 Dung N T., Bajpai V K., Yoon J I., Kang S C (2009), “Anti-inflammatory effects of essential oil isolated from the buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”,Food Chem Toxicol.,47(2), 449-453 21 Dung N T., Kim J M., Kang S C.(2008), “Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil and the ethanol extract ofCleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry buds”,Food Chem Toxicol., 46(12), 3632-3639 57 22 Guvenalp Z., Ozbe H K., Kuruuzum-Uz A., Kazaz C., Demirezer L O (2009), “Secondary metabolites from Nepeta heliotropifolia”, Turk J Chem., 33, 667-675 23 Hou W., Li Y., Zhang Q., Wei X., Peng A., Chen L., Wei Y (2009), Triterpene acids isolated from Lagerstroemia speciosa leaves as α-glucosidase inhibitors, Phytotherapy Research, 23 (5), 614–618 24.Hu Y C., Hao D M., Zhou L X., Zhang Z., Huang N., Hoptroff M., Lu Y H (2014), “2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone protects the impaired insulin secretion induced by glucotoxicity in pancreatic β-cells”,J Agric Food Chem.,62(7),1602-1608 25 Huang H Y., Niu J L., Lu Y H (2012), “Multidrug resistance reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor xenograft model”,J Sci Food Agric.,92(1), 135-140 26 Kumar S., Narwal S., Kumar V., Prakash O (2011), “α-Glucosidase inhibitor from plants: A natural approach to treat diabetes”, Pharmacognosy Review, (9), 19-29 27.Lu Y H., Du C B., Wu Z B., Ye C L., Liu J W., Wei D Z (2003), “Protective effects of Cleistocalyx operculatus on lipid peroxidation and trauma of neuronal cells” Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,28(10), 964-966 28 Luo Y., Lu Y (2012), “2',4'-Dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone inhibits apoptosis of MIN6 cells via improving mitochondrial function”,Pharmazie, 67(9), 798-803 29 Mai T T., Yamaguchi K., Yamanaka M., Lam N T., Otsuka Y., Chuyen N V (2010), “Protective and anticataract effects of the aqueous extract of Cleistocalyx operculatus flower buds on beta-cells of streptozotocin-diabetic rats”,J Agric Food Chem., 58(7), 4162-4168 30 Mai T T., Chuyen N V (2007), “Anti-hyperglyceamic Activity of an Aqueous Extract from Flower Buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr.and Perry”, Biosci Biotechnol.Biochem., 71 (1), 69-76 31 Manosroi J., Chankhampan C., Kumguan K., Manosroi W (2015), ”In vitro antiaging activities of extracts from leaves of Ma Kiang (Cleistocalyx nervosum var paniala)”, Pharm Biol.,53(6), 862-869 58 32 MinB S., ThuC V., DatN T., Dang N H., Jang H S., Hung T M (2008), “Antioxidative Flavonoids from Cleistocalyx operculatus ((Roxb.) Merr and Perry”, Chem Pharm Bull., 56(12), 1725-1728 33 MinB S., Cuong T.D., Lee J S., Shin B S., Woo M H., Hung T M.(2010), “Cholinestearase inhibitor from Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry Bubs”, Arch Pharm Res., 33(10), 1665-1670 34 Min B S., Cuong T D., Lee J S., Won M H., Hung T M (2010), “Flavonoids FromCleistocalyx operculatus Buds and their Cytotoxic Activity”, Bull Korean Chem Soc., 31(8), 2392-2394 35 Naidu V S., P Kinthada M M S., Kalyani P., Muralidhar P (2012), “Characterization and biological activities of quercetin thiosemicarbazone derivatives: potential anticancer drugs”, Int J Pharm Biomed Sci., 3, 24-27 36 Poontawee W., Natakankitkul S., Wongmekiat O (2016), “Protective Effect of Cleistocalyx nervosum var paniala Fruit Extract against Oxidative Renal Damage Caused by Cadmium”,Molecules,21 (2), 133 37 Sheng Z., Dai H , Pan S., Wang H., Hu Y., Ma W (2014), “Isolation and characterization of an α-glucosidase inhibitor from Musa spp (Baxijiao) Flowers”, Molecules, 19, 10563-10573 38 Soliman F M., Shehata A H., Khalael A E., Ezzat S M (2002), “An acylated kaempferol glycoside from flowers of Foeniculum vulgare and F dulce”, Molecules, 7, 245-251 39 Tanaka J C A., Vidotti G J., da Silva C C (2003), “A new tormentic acid derivative from Luchea divaricata Mart (Tuliaceae)”, J Braz Chem Soc., 14, 475-478 40 Taya S , Punvittayagul C., Inboot W., Fukushima S., Wongpoomchai R (2014), “Cleistocalyx nervosum extract ameliorates chemical-induced oxidative stress in early stages of rat hepatocarcinogenesis”,Asian Pac J Cancer Prev., 15 (6), 2825-2830 41 Thiantogin P., Sotimuang C., Ovatlarnporn C (2014), “α-Glucosidase and αamylase inhibitory activities of Thai folk antidiabetes formularies” Proceedings of the 3rd CDD International Conference, Ao Nang, Thailand 42 Tijjani A., Ndukwe I G., Ayo R G (2012), “Isolation and characterization of lup-20(29)-ene-3,28-diol (betulin) from 59 the stem-bark of Adenium obesum (Apocynaceae)”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 11, 159262 43.Use of arjunolic acid in preparing glycosidase inhibitor (2009),Patent CN101416970A 44 Woo A Y., Waye M M., Kwan H S., Chan M C., Chau C F., Cheng C H (2002), “Inhibition of ATPases by Cleistocalyx operculatus A possible mechanism for the cardiotonic actions of the herb”,Vascul Pharmacol., 38(3), 163-168 45.Ye C L., Lai Y F., Liu X G., Huang Q (2014), “Study on mechanism of inducing apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells by DMC, a chalcone from buds of Cleistocalyx operculatus”,Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 39(15), 29422946 46.Ye C L., Liu J W., Wei D Z., Lu Y H., Qian F (2004), “In vitro anti-tumor activity of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines”, Pharmacol Res., 50(5), 505-510 47.Ye C L., Lu Y H., Wei D Z.(2004), “Flavonoids from Cleistocalyx operculatus”, Phytochemistry, 65(4),445-447 48.Yu W G., He H., Yao J Y., Zhu Y X., Lu Y H (2015), “Dimethyl Cardamonin Exhibits Anti-inflammatory Effects via Interfering with the PI3K-PDK1-PKCα”, Signaling Pathway, 23(6), 549-556 49 Zhang F.-X., Liu M.-F., Lu R.-R (1990), “Studies on the chemical constituents from the bud of Cleistocalyx operculatus”,Acta Botanica Sinica, 32 (6), 469-472 60 PHỤ LỤC 61 ... hóa thành phần hóa học có Vối liên hệ chúng với tác dụng chữa bệnh đái tháo đường Vối Các nội dung nghiên cứu luận văn là: 1) Thực qui trình chiết etanol etanol-nước để điều chế cao chiết có tác. .. chiết có tác dụng ức chế enzym -glucosidase từ Vối 2) Phân tách sắc ký phân tích điều chế để phân lập hợp chất thành phần có phần chiết etanol etanol-nước từ Vối 3) Xác định cấu trúc hợp chất phân... cardamonin (2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcon(DMC) thành phần nụ hoa C operculatus Trong nghiên cứu này, tác dụng chống viêm DMC tác dụng chế phân tử nghiên cứu đại thực bào gây viêm