ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG DẤU ẤN MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH BẠCH CẦU CẤP CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC CƠ SỞ THỰC TẬP: BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG Đà Nẵng – Năm 2017 LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC I NỘI DUNG VÀ TIẾN ĐỘ THỰC TẬP STT Nội dung cơng việc Tìm hiểu quan thực tập Tìm hiểu kiến thức chuyên mơn xét nghiệm Nghỉ Tết Tìm hiểu trang thiết bị quan Tìm hiểu qui trình xét nghiệm Thực nghiệm qui trình xét nghiệm Viết báo cáo thực tập tốt nghiệp Tiến độ thực Tuần (09/01/2017 đến 15/01/2017) Tuần (16/1/2017 đến 22/01/2017) Tuần 3-4 (23/01/2017 đến 05/02/2017) Tuần (06/02/2017 đến 12/02/2017) Tuần (13/02/2017 đến 19/02/2017) Tuần 7-9 (20/02/2017 đến 12/03/2017) Tuần 10 (13/03/2017 đến 19/03/2017) II CÁC KẾT QUẢ CỤ THỂ Giới thiệu sở thực tập 1.1 Giới thiệu chung bệnh viện 1.1.1 Lịch sử thành lập Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng ( Danang Cancer Hospital- DCH) bệnh viện chuyên khoa ung thư loại hoàn chỉnh thành phố Đà Nẵng, quy mô 500 giường bệnh nội trú Bệnh viện đặt Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu, Thành phố Đà Nẵng, diện tích 15 hecta Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng thành lập theo định số 5898/QĐ-UBND ngày 15/8/2015 UBND thành phố Đà Nẵng, sở tổ chức lại Khoa Ung bướu thuộc Bệnh viện Đà Nẵng tiếp nhận nguyên trạng tổ chức máy, người lao động, trụ sở, sở vật chất, trang thiết bị, tài chính, tài sản Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng (thuộc Hội Bảo trợ phụ nữ trẻ em nghèo bất hạnh thành phố) Bệnh viện đơn vị nghiệp công lập, chịu quản lý, đạo trực tiếp Giám đốc Sở Y tế Đà Nẵng Hình 1.1: Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng 1.1.2 Mục tiêu, nhiệm vụ • Mục tiêu: Xây dựng bệnh viện chuyên khoa ung bướu đạt trình độ cao, để làm tốt cơng tác phịng chống ung bướu khu vực bước phát triển bệnh viện thành Viện ung bướu Bệnh viện đem lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân ung bướu khu vực Đặc biệt, bệnh nhân ung bướu nghèo Đà Nẵng khu vực Miền Trung có hội khám chữa bệnh miễn phí với chất lượng tốt • Nhiệm vụ  Bệnh viện thực nhiệm vụ Bộ Y tế quy định: (1) Cấp cứu, khám bệnh, chữa bệnh, (2) Đào tạo cán y tế, (3) Nghiên cứu khoa học y học, (4) Phòng bệnh, (5) Hợp tác quốc tế y học, (6) Quản lý kinh tế bệnh viện  Lãnh đạo thành phố Đà Nẵng giao cho bệnh viện nhiệm vụ là: (1) Làm tốt công tác khám, chữa bệnh cho bệnh nhân ung thư khu vực, (2) Tầm soát phát sớm bệnh ung thư (3) Triển khai chương trình nghiên cứu khoa học bệnh ung thư 1.1.3 Cơ cấu tổ chức Thầy thuốc nhân dân, bác sĩ Chuyên khoa Nguyễn Út, phó Giám đốc Sở Y tế Đà Nẵng, kiêm nhiệm chức vụ Giám đốc Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng Bệnh viện đầu tư xây hồn chỉnh cơng trình hạ tầng với khối nhà chính: - Khối hành hội trường, - Khối điều trị nội trú - Khối kỹ thuật nghiệp vụ Tổng diện tích sàn khoảng 54.000m2 Diện tích xây dựng trung bình cho giường bệnh gần 110m2 Bệnh viện thiết kế theo mơ hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan bệnh viện hài hòa, tiện nghi thân thiện Mọi phòng bệnh có phịng vệ sinh riêng, hệ thống điều hịa trung tâm hệ thống khí trung tâm Bệnh viện dành khu nhà nghỉ gần 50 phòng ( khoảng 400 giường) để người nhà bệnh nhân có điều kiện nghỉ ngơi thời gian chăm sóc bệnh nhân bệnh viện Bệnh viện có khu nhà dành cho nhân viên, sinh viên đến thực tập khu nhà dành cho chuyên gia nước đến giúp đỡ bệnh viện  Bệnh viện gồm: o phịng: • Phịng hành quản trị • Phịng kế hoạch tổng hợp • Phịng tổ chức cán • Phịng cơng nghệ thơng tin • Phịng điều dưỡng • Phịng đạo tuyến QLCLBV • Phịng vật tư thiết bị y tế o 18 khoa: Các khoa lâm sàng: • Khoa khám bệnh cấp cứu • Khoa chăm sóc giảm nhẹ • Khoa hóa trị I • Khoa hóa trị II • Khoa huyết học • Khoa gây mê hồi sức • Khoa ngoại • Khoa ngoại • Khoa ngoại • Khoa xạ trị • Khoa y học hạt nhân Các khoa cận lâm sàng: • Khoa dược • Khoa chẩn đốn hình ảnh • Khoa nội soi TDCN • Khoa kiểm soát nhiễm khuẩn • Khoa xét nghiệm-truyền máu • Khoa giải phẫu bệnh • Khoa kỹ thuật phóng xạ Bệnh viện có hệ thống trang thiết bị đại đồng bộ, đáp ứng tốt nhu cầu khám chữa bệnh ung bướu Các hệ thống chẩn đoán theo dõi điều trị ung bướu máy CT-scan đa lát cắt, máy MRI 3.0T, máy tăng sáng truyền hình, máy siêu âm màu chiều, máy nội soi can thiệp, máy SPECT, PET-CT, máy đếm tế bào tự động 40 thơng số, máy xét nghiệm sinh hóa tự động, ELISA tự động, FACS, miễn dịch hóa tổ chức, máy cắt lạnh, hệ thống phân tích gen… Các hệ thống trang thiết bị xạ trị ung thư kỹ thuật cao máy xạ trị gia tốc, máy xạ phẫu, xạ trị áp sát liều cao, CT mô phỏng,… Các sở điều trị đại 10 phòng mổ chuẩn, khu hậu phẫu 40 giường bệnh, khu hồi sức cấp cứu chăm sóc giai đoạn cuối 50 giường bệnh khu ghép tủy xương phòng ghép chuẩn… 1.2 Giới thiệu khoa xét nghiệm – truyền máu - Địa điểm: Tầng – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng Tổ 14 Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng - Điện thoại: 02363.717361 ( Hành chính) 10 điện trường Nguyên lý giúp phân tích khác biệt kích thước loại tế bào khác nhau, khơng nhận diện xác loại tế bào Các máy đếm tế bào sử dụng chia làm hai loại: - Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt loại tế bào dựa vào kích thước tế bào - Các máy hệ sau: ứng dụng laser xung điện đa chiều nên có tốc độ cao phân loại tế bào xác Với máy sản xuất trước 1996 khả phân loại xác thành phần bạch cầu nói chung khơng q 90% Các máy model gần đây, với việc áp dụng tổng hợp chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser scatter nên khả nhận diện tế bào nâng đến 95% Một số serie máy phân biệt loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới việc kết hợp với phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộm huỳnh quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 hãng ABBOTT, SE-Advance hãng Sysmex…) 2.3.2 Các phận máy flow cytometry Hình 2.4 : Hệ thống Flow Cytormetry 21 • Hệ thống tạo dịng chất lỏng (fluidics system) Hệ thống tạo dịng chất lỏng gồm có vùng chất lỏng có áp lực khác Dịng dịch lỏng bên ngồi (sheath fluid) cịn gọi dung dịch tạo dịng bao: có tác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên (core fluid) gọi dòng lõi thành dòng hẹp tới mức tế bào/hạt vật chất mẫu qua khe hẹp từ giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có mẫu thành dòng tế bào đơn vận chuyển dòng tế bào đơn qua hệ thống quang học với tốc độ cao, khoảng 1000 tế bào/giây Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực dòng bao dịng lõi mở rộng thu hẹp tiết diện dịng lõi, phù hợp với u cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu cần dịng lõi lớn, phân tích ADN cần dịng lõi hẹp) Nhờ chế hệ thống phân tích đồng thời nhiều đặc tính tế bào cách xác, giảm yếu tố nhiễu • Hệ thống quang học Hệ thống quang học bao gồm nguồn phát tia sáng (thường đèn laser đèn hồ quang), hệ thống kính lọc kênh thu tín hiệu quang học tính hiệu huỳnh quang (FSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, FL (Fluoressen Light), dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang số kênh màu huỳnh quang dao động từ đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – Photo Multiplier Tube, ống nhân quang tương ứng với kênh màu huỳnh quang có vai trị khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang) • Hệ thống điện tử: Về chất hệ thống có máy, tín hiệu ánh sáng tán xạ tín hiệu huỳnh quang sau khuếch đại hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm biểu dạng biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm máy tính thơng qua phần mềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy 22 2.4 Quá trình thực 2.4.1 Hóa chất thuốc thử STT TÊN HÓA CHẤT Bộ kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang FACS lysing solution Sheath (FACS flow) FACS clean CST Bead BD compbead Intrasure ĐÓNG GĨI SỐ LƯỢNG/1 XÉT NGHIỆM ĐƠN VỊ TÍNH Test Lọ/100 Thùng/20 Thùng/5 Lọ/50 Lọ/50 Kit/50 test 0.5 0.5 0.1 0.1 0.1 0.2 ML L L Test Test Test Bảng 2.2: Hóa chất, thuốc thử 2.4.2 Nguyên lý xét nghiệm Kháng nguyên có bề mặt bên tế bào kết hợp với kháng thể đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang, sau phân tích hệ thống FC với phần mềm FACSDivaTM giúp phân loại chuẩn đốn bệnh BCC 2.4.3 Quy trình thực Mẫu nghiệm • Xử lý mẫu Thu thập mẫu Kiểm tra phân tích Kết Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm Bệnh phẩm máu, dịch hút tủy xương, loại dịch khác theo yêu cầu lâm sàng Chất chống đơng EDTA Số lượng mẫu: 2ml • Bước 2: Xử lý mẫu • Xử lý mẫu xét nghiệm: loại mẫu tươi giữ dạng huyền phù thuốc chống đông, tốt EDTA; 23 Mẫu nghiệm nhuộm với kháng thể gắn huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng trạng hóa chất thuốc nhuộm mà phận xét nghiệm có Người ta thường nhập kháng thể phổ biến, dùng cho nhiều người • Nhuộm ngoại bào: - Đánh dấu tube chuẩn bị thực - Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 / tube) vào tube - Cho μl kháng thể đơn dòng (theo panel) - Votex tube giây - Ủ tube tối, nhiệt độ phòng 15 phút - Votex tube giây - Cho ml lysing vào tube - Votex tube giây - Ủ tube 10 phút tối, nhiệt độ phòng Chú ý votex tube phút/lần - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nổi, thấm giấy thấm - Cho tiếp ml sheath vào tube Votex - Ly tâm 300g/ phút - Đổ bỏ dịch - Tái huyền dịch tube 0.2 ml sheath Votex • Nhuộm nội bào: - Đánh dấu tube chuẩn bị thực - Cho 50 μl máu/ dịch tủy xương (số lượng bạch cầu khoảng 2-5.10 / tube) vào tube - Cho μl kháng thể đơn dòng nhuộm kháng nguyên bề mặt tế bào (theo panel) - Votex tube giây - Ủ tube tối, nhiệt độ phòng 15 phút - Votex tube giây 24 - Cho 100 μl dung dịch FIX vào tube nhuộm nội bào Votex đều, ủ tối 15 phút - Cho ml sheat vào tube Votex - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nhẹ nhàng, thấm giấy thấm (chú ý tránh để tế bào) - Cho 100 μl dung dịch Perm vào tube nhuộm nội bào, tiếp tục cho μl kháng thể nhuộm nội bào, Votex Ủ tối 20-30 phút (Votex tube phút/ lần) - Cho ml sheat vào tube Votex - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch nhẹ nhàng - Cho ml sheat vào tube Votex - Ly tâm tube 300g/5 phút - Đổ bỏ dịch - Tái huyền dịch tube 0.2 ml sheat Votex Lưu ý: Mẫu nhuộm sớm tốt để tránh tế bào bị chết nhiều làm ảnh hưởng đến kết Phương pháp nhuộm với nhiều màu huỳnh quang đánh giá cao cho phép phát nhiều DAMD tế bào lúc phản ánh mối quan hệ mật thiết dấu ấn Thơng thường để quan sát kháng nguyên bề mặt tế bào, cần ủ mẫu tủy mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 10-15 phút Vì chẩn đốn bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có nhân, nên phải sử dụng ammonium chloride dung dịch có tác dụng tương tự để loại bỏ hồng cầu trưởng thành (HC không nhân) Các tế bào thuộc dịng hồng cầu chưa trưởng thành có nhân khơng bị phá hủy đề kháng với ammonium chloride Khi cần khảo sát thêm dấu ấn nằm bào tương hay nhân tế bào, người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên qua màng tế bào đến gắn với kháng nguyên đích bên tế bào Các kháng nguyên bên tế 25 bào thông dụng TdT, chuỗi nhẹ chuỗi nặng, cyCD3, cyCD22, cyCD79a, MPO, bel-2, cyclin-D1, ZAP-70 • Bước 3: Thu thập mẫu Các mẫu sau nhuộm đưa vào chỗ hút mẫu máy FC chuẩn bị kiểm tra phân tích • Bước 4: Kiểm tra phân tích phần mềm BD FACS Diva hệ thống FACS Canto II • Bước 5: Kết Dựa vào tiêu sau để đánh giá đưa kết quả: - Nồng độ kháng nguyên có mức độ (âm tính, yếu, trung bình, mạnh); - Có mức độ tế bào dương tính (0-10%; 10-20%; 20-50%; 50-100%); - Sự diện mức kháng nguyên; - Sự biểu kháng nguyên khác dòng; - Sự vắng mặt kháng nguyên đặc hiệu dòng - Kiểm tra phân tích liệu có Dot plots - Tạo mẫu trả kết bệnh nhân - Nhập liệu cần thiết phân tích - Nhận xét sơ kết - Lưu kết bệnh nhân - Kiểm tra trả kết xét nghiệm - Kiểm tra đánh giá lại liệu kết xét nghiệm - Đề nghị kết luận cuối - Ký xác nhận phiếu kết xét nghiệm 2.4.4 Tác dụng dung dịch quy trình nhuộm Dung dịch Lysing Sheat FIX Perm Tác dụng Ly giải hồng cầu tiểu cầu Tạo thủy lực dồn tế bào chảy thành dòng Cố định tế bào Tác nhân thúc đẩy giúp kháng thể tìm kiếm gắn vào kháng nguyên nhanh dung dịch có thành phần giúp phá 26 vỡ hồng cầu giữ lại bạch cầu Bảng 2.3: Tác dụng dung dịch trình nhuộm 27 Hình 2.5: Các bước tiến hành xét nghiệm mẫu 28 Hình 2.6: Kiểm tra phân tích phần mềm BD FACS Diva 29 Kết Khi kiểm tra phân tích liệu có Dot plots, KTV tạo mẫu, in phiếu kết xét nghiệm bênh Sau chuyển giao cho bác sĩ để kết luận bệnh Hình 3.1 Kết xét nghiệm ghi nhận tăng tỷ lệ Lympho T_CD4 30 Hình 3.2 Kết xét nghiệm hướng BCC dịng Lympho B Hình 3.3 Kết xét nghiệm hướng BCC dịng thủy 31 Kết luận Q trình thực tập tuần trôi qua, em học hỏi khơng kinh nghiệm từ mơi trường làm việc có tính chun mơn cao cách xử giao tiếp với người Em học cách làm việc nhóm, giúp hỗ trợ phối hợp lẫn q trình làm việc, có trách nhiệm với việc làm Tuy người làm việc nhỏ phải nắm quy trình chung để phân cơng vào vị trí khác hồn thành phần việc mình, biết làm gì, quan sát ghi nhớ Phải mạnh dạng làm quen, thân thiện với người, mở rộng quan hệ lợi lớn sau, ln có thái độ chân thành hịa đồng với người Đưa ý kiến cần thiết để biết làm hay sai, sinh viên nên hỏi chưa biết hay chưa hiểu rõ từ quy trình hay khác thực tế lý thuyết học Siêng yếu tố quan trọng thích người chăm chỉ, khơng ngại việc, biết giúp đỡ người có trách nhiệm với việc làm Qua đó, em học nhiều kiến thức lĩnh vực Công nghệ sinh học, trao dồi kiến thức, học thêm kiến thức tích lũy kinh nghiệm thực tế quý báu mà em chưa có học giảng đường Điều giúp em nhận thức sâu sắc hơn, hiểu biết nhiều ngành nghề theo đuổi vị trí, vai trị Cơng nghệ sinh học xã hội Cũng qua đợt thực tập tốt nghiệp này, em có thêm nhiều hội tiếp xúc với anh, chị - chuyên viên nghành Cơng nghệ sinh học để học tập, trao dồi kiến thức bổ sung kỹ cơng việc, học tập để ngày hồn thiện 32 Tài liệu tham khảo [1] Hội Bệnh Bạch Cầu (The Leukaemia Foundation), “Am hiểu Bệnh bạch cầu, Bệnh bạch huyết Bệnh u tủy” [2] ThS.BS Huỳnh Đức Vĩnh Phú (2017), “Quá trình sinh bệnh chuẩn đốn bệnh bạch cầu mạn dịng tủy”, Bệnh viện Truyền Máu - Huyết Học Tp Hồ Chí Minh [3] BS CKII Lê Thanh Tú (2017), “ Tổng quát giải phẫu bệnh – bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (AML)”, Bệnh viện Truyền Máu - Huyết Học Tp Hồ Chí Minh [4] ThS BS Nguyễn Hạnh Thư (2017), “ Bệnh bạch cầu mạn dịng Lympho ?”, Bệnh viện Truyền Máu - Huyết Học Tp Hồ Chí Minh [5] BS.Vũ Hoàng Phương Thư (2011), “ Bệnh bạch cầu cấp ( Leukemia cấp)”, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, Sở Y tế - TP Hồ Chí Minh [6] Ths.BS Đỗ Thị Hải Vân – BS Nguyễn Đắc Quỳnh Anh – TS BS Huỳnh Văn Mẫn, “ Tìm hiểu bệnh bạch cầu cấp : chẩn đoán cách chữa trị” , Bệnh viện Truyền máu - Huyết học, Sở Y tế - TP Hồ Chí Minh 33 III NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP 34 35 ... xét ngiệm miễn dịch khác Ứng dụng dấu ấn miễn dịch chẩn đoán bệnh Bạch cầu cấp 2.1 Bệnh bạch cầu cấp 2.1.1 Giới thiệu Bệnh bạch cầu cấp bệnh ung thư tủy xương – tình trạng cấp tính bệnh lý ác... trị liệu Bạch cầu cấp, gọi bệnh lơ xê mi cấp, bệnh ung thư phổ biến trẻ em giới, bệnh chiếm khoảng phần tư bệnh ung thư trẻ em 15 tuổi Bạch cầu cấp thể lympho chiếm 75% bệnh bạch cầu cấp 2.1.2... non gia tăng, số lượng hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu giảm bớt Bốn dạng bệnh bạch cầu là: • Bệnh bạch cầu dịng tủy ác tính (Acute Myeloid Leukaemia - AML) • Bệnh bạch cầu dịng tủy mãn tính (Chronic