Đang tải... (xem toàn văn)
Bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra thường xuất hiện ở lợn con trước cai sữa và saucai sữa, mà nguyên nhân chủ yếu là do nhóm vi khuẩn ETEC mang gen mã hóa độctố ruột kém chịu nhiệt (LT) và gen mã hóa độc tố ruột chịu nhiệt (ST) gây ra (Gyles vàFairbrother, 2010). Bình thường các chủng vi khuẩn ETEC sống cộng sinh chiếm ưuthế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Khi có điều kiện bất lợi nhưthay đổi về thức ăn, thời tiết hoặc lợn bị mắc các bệnh khác, thì các chủng vi khuẩnETEC sẽ tăng sinh nhanh chóng, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy. Để gây bệnh,trước hết các chủng ETEC sẽ bám dính vào niêm mạc đường ruột thông qua các yếu tốbám dính như F4, F5, F6, F18…. Sau đó chúng sản sinh ra các loại độc tố đường ruộtnhư STa, STb và LT. Chính những độc tố này là nguyên nhân trực tiếp gây nên rối loạntrao đổi muối và nước trong đường ruột và hậu quả của nó là nước bị tiết quá mức vàođường ruột gây tiêu chảy
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG - - NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (STa, STb VÀ LT) CỦA VI KHUẨN E COLI PHÂN LẬP TỪ LỢN CON BỊ TIÊU CHẢY ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học NHA TRANG – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG - - NGUYỄN THỊ TRANG ĐÁNH GIÁ SỰ TƯƠNG ĐỒNG GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ ĐƯỜNG RUỘT (STa, STb VÀ LT) CỦA VI KHUẨN E COLI PHÂN LẬP TỪ LỢN CON BỊ TIÊU CHẢY ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Cán hướng dẫn: 1)TS Võ Thành Thìn 2)ThS Lê Nhã Uyên NHA TRANG - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Môi Trường tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin gửi đến biết ơn sâu sắc dành cho TS Võ Thành Thìn – Trưởng môn nghiên cứu vi trùng trực thuộc Phân viện Thú y miền Trung, thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Viện Trưởng Viện Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang, ThS Lê Đình Hải - Cán bộ môn nghiên cứu vi trùng ThS Lê Nhã Uyên – Giảng viên Trường Đại học Nha Trang tận tình bảo hướng dẫn em thực đồ án cách tốt Xin cảm ơn cô ThS Khúc Thị An – Trưởng môn Công nghệ Sinh học thầy TS Nguyễn Văn Duy – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh Môi trường – Trường Đại học Nha Trang với thầy, cô giảng viên phản biện cho em kiến thức sâu sắc lời khuyên vô quý báu để đồ án nghiên cứu hoàn thành tốt Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ thầy cô giáo môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, cán - Bộ môn nghiên cứu vi trùng tập thể cán công nhân viên - Phân viện Thú y miền Trung giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện làm việc tốt cho em suốt thời gian em thực đồ án Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, người thân bạn đồng hành tập thể lớp 54CNSH – Trường Đại học Nha Trang gắn bó động viên khích lệ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Nha Trang, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên thực Nguyễn Thị Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi khuẩn E coli 1.1.1 Giới thiệu vi khuẩn E coli 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm hình thái E coli tính chất bắt màu 1.2 Tổng quan nhóm ETEC 1.2.1 Các yếu tố gây bệnh nhóm ETEC 1.2.1.1 Yếu tố bám dính (colonization-CF) 1.2.1.2 Các loại độc tố đường ruột 10 1.2.2 Cơ chế gây bệnh ETEC 16 1.3 Một số nghiên cứu vai trò độc tố đường ruột bệnh tiêu chảy lợn 17 1.3.1 Nghiên cứu nước 17 1.3.2 Nghiên cứu giới 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nội dung đối tượng nghiên cứu 20 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 20 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương pháp nghiên c ứu 20 2.2.1 Phương pháp khảo sát lưu hành gen mã hóa độc tố STa, STb, LT vi khuẩn E coli 20 2.2.2 Phương pháp đánh giá tương đồng gen mã hóa độc tố STa, STb LT 22 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 2.3 Nguyên liệu trang thiết bị nghiên cứu 23 ii CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết khảo sát lưu hành gen mã hóa độc tố STa, STb, LT chủng vi khuẩn E coli 24 3.2 Tổ hợp gen chủng mang gene mã hóa độc tố STa, STb LT 27 3.3 Đánh giá tương đồng gen mã hóa độc tố STa, STb LT 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận .34 4.2 Kiến nghị .34 TÀI LIỆU THAM KHẢO .35 Tài liệu tiếng Việt 35 Tài liệu tiếng Anh 36 PHỤ LỤC 43 Phụ lục 1: Hóa chất điện di 43 Phụ lục 2: Hóa chất nhuộm gel 43 Phụ lục 3: Cách kiểm tra ý nghĩa thống kê 43 Phụ lục 4: Kết khảo sát có mặt gen mã hóa độc tố đường ruột (STa, STb, LT) vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 44 Phụ lục 4: Trình tự nucleotide gen eltAB 10 chủng ETEC khảo sát 50 Phụ lục 5: Trình tự nucleotide gen estA 10 chủng ETEC khảo sát 54 Phụ lục 6: Trình tự nucleotide gen estB 10 chủng ETEC khảo sát 55 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AIEC : Adherent Invasive E coli CFA : Colonization factor antigen (yếu tố bám dính) Cs : Cộng DAEC : Diffusely adherent E coli DNA : Deoxyribonucleid acid E coli : Escherichia coli EAEC : Enteroaggregative E coli EHEC : Enterohaemorrhagic E coli EIEC : Enteroinvasive E coli eltA : Gen mã hóa tiểu phân tử A độc tố LT eltAB : Gen mã hóa độc tố LT eltB : Gen mã hóa tiểu phân tử B độc tố LT EPEC : Enteropathogenic E coli ER : endoplasmic reticulum (mạng lưới nội chất) est : Gen mã hóa độc tố ST estA : Gen mã hóa độc tố STa estB : Gen mã hóa độc tố STb ETEC : Enterotoxigenic E coli FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hợp quốc F4, F5, F6, F18,… : yếu tố bám dính GM1 : Ganglioside (Thụ thể tế bào biểu mô niêm mạc ruột) hlt : Human heat labile toxin LT : Heat labile toxin PCR : Polymerase Chain Reaction plt : Porcine heat labile toxin ST : Heat stable toxin STEC : Enteroaggregative E coli iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái c vi khuẩn E coli Hình 1.2 Cấu trúc độc tố chịu nhiệt LT 11 Hình 1.3 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy độc tố LT 12 Hình 1.4 Cấu trúc độc tố ST Cầu nối disulfide (màu đỏ) biến thể độc tố STa, vùng lõi độc tố (gạch bên dưới) (Fleckenstein cs, 2010) 14 Hình 1.5 Cầu nối disulfide (-S-S-) số vị trí acid amin cấu trúc độc tố STb (Sukumar cs, 1995) 14 Hình 1.6 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy độc tố STa 15 Hình 1.7 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy độc tố STb 15 Hình 1.8 Quá trình lây nhiễm gây bệnh ETEC 16 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR xác định gen mã hóa độc tố STa, STb, LT 27 Hình 3.2 Kết điện di mẫu khuếch đại PCR 29 Hình 3.3 Một số vị trí sai khác trình tự nucleotide gen eltAB chủng ETEC 32 Hình 3.4 Một số vị trí sai khác trình tự acidamin gen eltAB chủng ETEC 32 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi (primer) sử dụng mutiplex-PCR 21 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng multiplex-PCR (25μl/ phản ứng) 22 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng multiplex-PCR 22 Bảng 3.1 Kết khảo sát lưu hành gen mã hóa độc tố STa, STb, LT E coli phân lập từ lợn bị tiêu chảy 24 Bảng 3.2 Kết tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb LT chủng ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 28 Bảng 3.3 Mức độ tương đồng nucleotide acid amin gen estA chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 30 Bảng 3.4 Mức độ tương đồng nucleotide acid amin gen estB chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 31 Bảng 3.5 Mức độ tương đồng nucleotide acid amin gen eltAB chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 33 vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Sự phân bố gen mã hóa độc tố STa, STb, LT E coli 25 Biểu đồ 3.2 Tổ hợp gen mã hóa độc tố STa, STb LT chủng ETEC phân lập từ lợn bị tiêu chảy 28 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Phương pháp nghiên cứu 20 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi lợn ngành có vị trí hàng đầu ngành chăn nuôi nước ta có phát triển mạnh mẽ Theo số liệu thống kê FAO (2013), tổng đàn lợn giới 977.020.798 con, Việt Nam có 26.261.400 con, đứng thứ toàn giới sau Trung Quốc (475.922.000 con), Mỹ (64.775.000 con), Brazil (39.040.000 con) Đức (27.690.100 con) Theo Tổng cục thống kê Việt Nam năm 2014 năm 2015 cho biết: thời điểm tháng 4/2014, đàn lợn nước có tới 26,4 triệu con, tăng 0,3% sản lượng thịt lợn đạt 1,9 triệu tấn, tăng 1,7% so với kỳ năm ngoái Tuy nhiên, bên cạnh thành tựu đạt được, ngành chăn nuôi đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, đặc biệt tình hình dịch bệnh Song song với phát triển quy mô chăn nuôi tình hình dịch bệnh xảy nhiều khó kiểm soát, mức độ thiệt hại mà dịch bệnh gây cho ngành chăn nuôi ngày lớn (Zimmerman JJ cs, 2012) Trong bệnh tiêu chảy vi khuẩn E coli gây xem nguyên nhân quan trọng dẫn đến hiệu chăn nuôi chưa cao Lợn bị mắc bệnh tiêu chảy thường dẫn đến còi cọc, chậm phát triển chết (Erume cs, 2008) Bệnh tiêu chảy E coli gây thường xuất lợn trước cai sữa sau cai sữa, mà nguyên nhân chủ yếu nhóm vi khuẩn ETEC - mang gen mã hóa độc tố ruột chịu nhiệt (LT) gen mã hóa độc tố ruột chịu nhiệt (ST) gây (Gyles Fairbrother, 2010) Bình thường chủng vi khuẩn ETEC sống cộng sinh chiếm ưu hệ vi sinh vật đường ruột người động vật Khi có điều kiện bất lợi thay đổi thức ăn, thời tiết lợn bị mắc bệnh khác, chủng vi khuẩn ETEC tăng sinh nhanh chóng, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy Để gây bệnh, trước hết chủng ETEC bám dính vào niêm mạc đường ruột thông qua yếu tố bám dính F4, F5, F6, F18… Sau chúng sản sinh loại độc tố đường ruột STa, STb LT Chính độc tố nguyên nhân trực tiếp gây nên rối loạn trao đổi muối nước đường ruột hậu nước bị tiết mức vào đường ruột gây tiêu chảy (Gyles Fairbrother, 2010) Bệnh tiêu chảy vi khuẩn E coli điều trị kháng sinh, nhiên giới nước tượng vi khuẩn kháng thuốc tồn dư kháng sinh thực phẩm vấn đề nan giải cần quan tâm Đặc biệt, xu 46 Sellwood R., Gibbons R A., Jones G W., Rutter J M (1975), Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to pig intestinal brush borders: the existence of two pig 47 Sukumar M., Josep Rizo, Mark Wall, Lawrence A Dreyfus, Yankel M Kupersztoch and Lila M Gi erasch (1995), The structure of Escherichia coli heat-stable enterotoxin b by nuclear magnetic resonance and circular dichroism, Printed in the USA 4:1718-1729 48 Gyles C L., John F Prescott, Glenn Songer, Charles O Thoen (2010), Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals, New York, NY John Wiley & Sons 49 Teneberg, S., T R Hirst, J Angstrom and K A Karlsson (1994), Comparison of the glycolipid-binding specificities of cholera toxin and porcine Escherichia coli heat-labile enterotoxin: identification of a receptor-active non-ganglioside glycolipid for the heat-labile toxin in infant rabbit small intestine, Glycoconjugate journal, 11, 533-540 50 Tsuji, T., S Taga, T Honda, Y Takeda and T Miwatani (1982), Molecular heterogeneity of heat-labile enterotoxins from human and porcine enterotoxigenic Escherichia coli, Infection and immunity, 38, 444-448 51 Thuy N Do, Phu H Cu, Huyen X Nguyen, Tuan X Au, Quy N Vu, Steve J Driesen, Kirsty M Townsend, James J.-C Chin and Darren J Trott (2006), Pathotypes and serogroups of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from preweaning pigs in north Vietnam, Journal of Medical Microbiology, 55, 93-99 52 Van den Broeck, W., E Cox, B Oudega, and B M Goddeeris (2000), The F4 fimbrial antigen of Escherichia coli and its receptors, Vet Microbiol 71:223-44 53 Zhang W, Berberov EM, Freeling J, He D, Moxley RA, et al (2006), Significance of heat-stable and heat-labile enterotoxins in porcine colibacillosis in an additive model for pathogenicity studies, Infect Immun 74: 3107–3114 54 Zhang W., Zhao M., Ruesch L., Omot A and Francis D (2007), Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US, Veterinary Microbiology, 123: 145-152 55 Zimmerman JJ, Karriker LA, Ramirez A, Schwartz KJ, Stevenson GW (2012), Diseases of swine, 10 th edn, Wiley-Blackwell, Ames, Iowa 41 56 Zinnah, M.A, M R Bari, M T, Islam, M.T.Hossain, M.T Rahman, M.H.Haque, S.A.M.Babu, R.P.Ruma and M.A.Islam (2007), Characterization of Escherichia coli isolated from samples of different biological and environmental sources, Bangladesh Journal of Veterinary Medicine, 5: 25-32 42 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hóa chất điện di TBE (5 X) Tris Base 54 g Acid Boric 27,5 g EDTA 2,92 g Nước siêu 1000 ml TBE (0.5 X): TBE (5 X) pha loãng 10 lần Agarose (1.2 % ) Phụ lục 2: Hóa chất nhuộm gel Ethidium bromide 3ul / l Phụ lục 3: Cách kiểm tra ý nghĩa thống kê Sử dụng hàm Chitest excel để kiểm tra độ tin cậy giá trị cần kiểm tra: P = Chitest (giá trị thực nghiệm; giá trị tính theo lý thuyết) Nếu giá trị P>0,05 giá trị thống kê ý nghĩa (với độ tin cậy 95%) Ngược lại, giá trị P