Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội – Năm 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung LỜI CẢM ƠN Lời đầ u tiên , xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới TS Phạm Thị Lƣơng Hằng PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣời đã trƣ̣c tiế p hƣớng dẫn , tạo mo ̣i điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i , giúp đỡ suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn Các cô không ngƣời truyền đạt cho kiến thức mà hỗ trợ nhiều vật chất Tôi thấy mình thật may mắn đƣợc học trò các cô Tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành nhấ t tới ThS Bùi Thị Vân Khánh, ThS Nguyễn Đắ c Tú , nhƣ̃ng ngƣời chi ̣ , ngƣời anh tâ ̣n tình hƣớng dẫn nhƣ̃ng ki ̃ thuâ ̣t đầ u tiên bƣớc chân vào phòng thí nghiê ̣m Anh, chị không truyền đạt cho nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m công viê ̣c mà cả nhƣ̃ng kinh nghiê ̣m quý báu cuô ̣c số ng, đó sẽ là nhƣ̃ng hành trang mà sẽ mang theo sau này Xin gửi lời cảm ơn đến CN Nguyễn Thị Thu Hà, CN Hà Hữu Cƣờng, CN Nguyễn Thị Loan, CN Vũ Anh Công nhiệt tình giúp đỡ quá trình làm thí nghiệm Xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắ c nhấ t tới các thầ y cô và cán bô ̣ Khoa Sinh học, đă ̣c biê ̣t là các thầ y cô Bô ̣ môn Sinh ho ̣c tế bào Bộ môn Sinh lí Thực vật Hóa sinh đã giúp đỡ , tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành lu ận văn Và, xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn các em Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào ngƣời động vật nhƣ Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô thực vật Vi tảo đã đồ ng hành , quan tâm và giúp đỡ thời gian tham gia nghiên cƣ́u ta ̣i Sƣ̣ quan tâm , chia sẻ các bạn các em động lực lớn lao với lúc mệt mỏi khó khăn Tôi sẽ không quên thời gian làm việc đầ y ắ p tiế ng cƣời cùng các ba ̣n hai gia điǹ h lớn trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội i Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ kinh phí cho nghiên cứu đề tài mang mã số 106.16-2012.24 Cuố i cùng, xin gƣ̉i lòng biế t ơn sâu sắ c và lớn lao nhấ t đế n gia đình , nhƣ̃ng ngƣời đã hy sinh cả vâ ̣t chấ t và tinh thầ n , yêu thƣơng , ủng hộ, đô ̣ng viên và tôn tro ̣ng mo ̣i quyế t đinh ̣ của Mỗi nghi ̃ về gia đin ̀ h nhƣ đƣơ ̣c tiế p thêm sƣ́c ma ̣nh để vƣ̃ng tin hoàn thành tố t luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Bùi Thị Thuỳ Dung ii Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Tƣ̀ viế t tắ t Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ED50 Median effective dose Liều có hiệu 50% số động vật thí nghiệm EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate HCT116 Human colon carcinoma cell HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan IC50 Half maximal inhibitory concetration Nồng độ ức chế 50% số tế bào LC/MS Liquid chromatography–mass spectrometry Dòng tế bào ung thƣ đại trực tràng Sắc kí lỏng - khối phổ LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú MeOH Methanol Dung môi methanol Minimal inhibitory MIC concentration Nồng độ ức chế tối thiểu n-Hex n-Hexan Dung môi n-Hexan OD Optical Density Mật độ quang học SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TLC Thin-layer chromatography Sắc kí mỏng MỤC LỤC iii Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lam 1.1.1.Đặc điểm hình thái sinh lí vi khuẩn lam 1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam 1.2 Tiềm phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam 1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam 1.4 Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam 13 Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Các chủng vi khuẩn lam 15 2.1.2 Dòng tế bào 16 2.2 Các nội dung nghiên cứu 17 2.3 Các phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào 17 2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 19 2.3.3 Phƣơng pháp sắc kí cột silica gel 20 2.3.5 Phƣơng pháp LC/MS 21 Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Đánh giá khả ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ 22 3.1.1.Kết hoạt hóa tế bào 22 3.1.2.Xác định số IC50 các dịch chiết từ vi khuẩn lam 22 3.2 Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 29 3.2.1.Sự phân tách cột sắc ký silica gel 29 3.2.2 Sự phân tách cột sắc kí sillica gel lần 32 3.2.3 Sự phân tách cột sắc kí silica gel lần 35 3.3 Xác định khối lƣợng phân tử hoạt chất phƣơng pháp LC/MS 37 iv Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Cryptophycin [36] v Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Borophycin [17] Hình 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng nghiên cứu 16 Hình 3.1 Các dòng tế bào ung thƣ dùng phép thử hoạt tính 22 Hình 3.2 Tế bào MCF7 mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm 23 Hình 3.3 Tế bào MCF7 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.4 Tế bào HCT116 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.5 Tế bào HepG2 dƣới tác dụng dịch chiết APD4- EtOAc 24 Hình 3.6 Đƣờng cong đáp ứng liều các dịch chiết có hoạt tính hai dòng tế bào MCF7 HCT116 27 Hình 3.7 Đƣờng cong đáp ứng liều dòng tế bào MCF7 đối với Taxol 28 Hình 3.8 Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met 30 Hình 3.9 Hình dạng tế bào MCF7 đƣợc ủ với phân đoạn DE5 32 Hình 3.10 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E) 33 Hình 3.11 Tế bào MCF7 ủ với phân đoạn DP1 DP5 nồng độ 50µg/ml 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC phân đoạn DP1 DP5 35 Hình 3.13 Tế bào MCF7 dƣới tác dụng phân đoạn DF4 36 Hình 3.14 Sắc kí đồ phân đoạn DF2 bƣớc sóng 256nm 37 Hình 3.15 Sắc kí đồ phân đoạn DF4 bƣớc sóng 256nm 38 Hình 3.16 Phổ khối lƣợng hợp chất P3 xuất phút 23,6 39 Hình 3.17 Kết tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton tháng 10/2016 40 Hình 3.18 Công thức cấu tạo Apratoxin E [26] 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chất có khả kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [39] Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng thí nghiệm đánh giá hoạt tính 15 vi Footer Page of 126 Header Page of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng 3.1 Giá trị tăng sinh A% các dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng MCF7 25 Bảng 3.2 Giá trị tăng sinh A% các dịch chiết có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào dòng HCT116 26 Bảng 3.3 Giá trị IC50 số dịch chiết có hoạt tính 27 Bảng 3.4 Giá trị IC50 Taxol ba dòng tế bào MCF7, HCT116 HepG2 28 Bảng 3.5 Khối lƣợng các phân đoạn từ dịch chiết chủng APD4 31 Bảng Khối lƣợng khô các phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 34 Bảng 3.7 Khối lƣợng các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 36 Bảng 3.8 Tỷ lệ tƣơng đối hàm lƣợng các chất phân đoạn DF4 38 vii Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung MỞ ĐẦU Sự xuất bệnh ung thƣ mối đe dọa tính mạng ngƣời hàng đầu giới với tỷ lệ mắc phải ngày tăng Theo số liê ̣u báo cáo Viện nghiên cứu quốc tế ung thƣ , năm 2012, toàn giới có 8,2 triệu ngƣời chết vì các loại bệnh ung thƣ khác Các chuyên gia cảnh báo ngƣời không sớm tìm đƣợc biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển nhƣ bệnh thì tới năm 2035, ung thƣ sẽ cƣớp sƣ̣ số ng của nh ất 24 triệu ngƣời [14] Hóa trị xạ trị từ lâu phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến điều trị ung thƣ, nhiên hai phƣơng pháp có nhiều tác dụng phụ, ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời bệnh, ngƣời bệnh có thể tử vong trƣớc tiêu diệt đƣợc tận gốc các tế bào ung thƣ Bởi vâ ̣y, viê ̣c tim ̀ mô ̣t loa ̣i thuố c đă ̣c hiê ̣u điề u tri ̣ung thƣ an toàn v ới ngƣời bệnh là mô ̣t vấ n đề r ất cấ p bách hiê ̣n Trong công tìm kiếm đó, các hợp chất từ thiên nhiên đƣợc quan tâm nhiều chúng có mặt các thuốc dân gian từ lâu có độ an toàn cao Vi khuẩn lam nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm dƣợc phẩm có ý nghĩa quan trọng Chúng cho thấy khả chống lại các khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm Một số hợp chất đƣợc phân lập tinh sạch từ vi khuẩn lam cho kết bƣớc đầu thành công các thử nghiệm điều trị ung thƣ lâm sàng Các hợp chất đƣợc xem hợp chất tiên phong cho phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt Từ các kiến thức nhƣ trên, chúng tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả ức chế tăng trƣởng số dòng tế bào ung thƣ” với mục đích: Đánh giá khả ức chế tăng trưởng dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam lên dòng tế bào ung thư phổ biến Việt Nam Tìm hợp chất có khả kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam Footer Page 10 of 126 Header Page 14 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung So sánh với các loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam trội hẳn nhờ có mặt hợp chất tiềm kháng ung thƣ Các nhà nghiên cứu 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đƣợc nuôi cấy có khả tiêu diệt tế bào ung thƣ ngƣời, 0,8% tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam có độc tính đối với các khối u rắn [27] Theo báo cáo Patterson, ông cộng tiến hành sàng lọc quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ các môi trƣờng sống khác Quá trình sàng lọc cho thấy khoảng 7% dịch chiết có khả ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thƣ KB [31] Các nghiên cứu Gerwick cộng tập trung vào việc sàng lọc các hợp chất kháng ung thƣ các chủng vi khuẩn lam sống môi trƣờng nƣớc biển Kết nghiên cứu cho thấy có tới 40% các chất từ vi khuẩn lam thu đƣợc có hoạt khả chống lại ung thƣ, ngăn ngừa khối u Chúng nguồn giàu các hợp chất peptide polyketide, các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể nguồn hợp chất tạo dƣợc phẩm kháng ung thƣ mới [16] Một số lƣợng lớn các hợp chất đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính ức chế trùng hợp tubulin đối tƣợng đƣợc nghiên cứu để phát triển thuốc kháng ung thƣ Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp ATCC 53789, Cryptophycin ứng cử viên đƣợc phát sớm có tiềm cao cho loại dƣợc phẩm mới chống ung thƣ Ở nhóm Cryptophycin có 25 thành viên có hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, đó Crytophycin có hoạt tính mạnh [36] Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Cryptophycin [36] Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Curacin A đƣợc phân lập từ chủng vi khuẩn lam Lyngbya majuscule có khả ức chế tăng sinh tế bào có độc tính mạnh với các tế bào ung thƣ đại tràng, thận vú Chúng hoạt động cách liên kết với vị trí bám tubulin ngăn cản tổng hợp vi ống, từ đó ức chế phân chia tăng sinh tế bào Tuy nhiên Curacin A tan nƣớc vì tiến hành thử nghiệm mô hình in vivo gặp nhiều khó khăn Để khắc phục tƣợng trên, các nhà khoa học tìm cách tổng hợp hợp chất có đặc tính sinh học tƣợng tự Curacin A với tính tan tốt [15, 40] Dolastatin 10 đƣợc phân lập lần vào năm 1987 Pettit từ loại sinh vật biển Dolabella auricularia đƣợc Luesch phân lập từ vi khuẩn lam Symploca sp năm 2001 Dolastatin 10 ức chế ức tăng sinh tế bào các thử nghiệm in vivo các bệnh bạch cầu, u lympho [35] Một thành viên khác nhóm Dolastatin Dolastatin 15 đƣợc dùng thử nghiệm mô hình in vitro với hoạt tính sinh học tƣơng tự ức chế tăng sinh tế bào ức chế gia tăng kích thƣớc khối u động vật Tuy nhiên, hợp chất có hiệu suất tổng hợp thấp khả tan nƣớc hạn chế Chính điều thúc các nhà khoa học tổng hợp thành công các chất có hoạt tính sinh học tƣơng tự Dolastatin 15 với hiệu suất tổng hợp cao, tính tan ổn định, đó là: ILX-651 LU3793 Các chất đƣợc thử nghiệm lâm sàng tại pha II Nhìn chung, các hợp chất Dolastatin có chế hoạt động ức chế quá trình lắp ráp vi ống bám vào tubulin Ngoài ra, chúng tham gia vào quá trình apoptosis thông qua can thiệp vào protein Bcl-2 [35] Hai chất có khả gây độc đến tế bào đƣợc nhiều nghiên cứu đề cập đến đó là: Borophycin Apratoxin A Borophycin phức hợp boron polyketide đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc linckia Nostoc spongiaeforme Borophycin có khả kháng ung thƣ dòng tế bào ung thƣ biểu bì ung thƣ đại trực tràng ngƣời [17] Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Borophycin [17] Apratoxin A chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập lần từ vi khuẩn lam Lyngbya majuscule Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp peptide- polyketide dạng vòng, gồm vòng thiazoline Đây chất có khả gây độc mạnh đối với tế bào ung thƣ khả kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ pha G1, gây quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình) Mặc dù chất có khả gây độc 60 dòng tế bào khối u nhƣng các nhà nghiên cứu chƣa tìm chế hoạt động chúng [4] Theo nghiên cứu Martins cộng cho tế bào HL-60 tiếp xúc với dịch chiết các chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp Synechococcus sp có tƣợng apoptosis xuất tế bào thử nghiệm Cụ thể, có biến đổi phần màng tế bào, tế bào bị co rút bắt đầu xuất hiện tƣợng phân mảnh nhân Bên cạnh đó, glycoside đƣợc phân lập từ Lyngbya sp hay Anabaena sp tham gia vào quá trình thúc đẩy tế bào ung thƣ tham gia vào chu trình apoptosis với dấu hiệu ban đầu ngƣng tụ chất nhiễm sắc phân mảnh nhân Các sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) gây ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển các dòng tế bào ung thƣ, đƣa chúng vào chu trình chết tế bào thông qua các hoạt động nhƣ: bắt giữ tế bào chu kì tế bào, làm rối loạn chức ty thể, lạp thể, gây các hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase để ngăn chặn không cho chúng tham gia vào các quá trình cắt nối hay thay đổi họ protein Bcl-2 thay đổi hoạt động các kênh vận chuyển màng ty thể, đƣờng trực tiếp dẫn tới apoptosis [7] Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Bảng 1.1 Một số chất có khả kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [37] STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động Ankaraholide A Geitlerinema sp Các dòng tế bào ung thƣ: phổi H460, vú MDA-MB 435, đại trƣc tràng LoVo, vòm họng KB Apratoxin A-G Belamide A Lyngbya majuscule Ung thƣ máu U2OS, Lyngbya sp cổ tử cung HeLa, phổi Lyngbya sordida H460, đại trực tràng Lyngbya bouilloni HCT116 Symploca sp Ung thƣ đại trực tràng HCT116 Calothrixin A Calothrix sp Ung thƣ cổ tử cung HeLa Caylobolide A Lyngbya majuscula Ung thƣ đại trực tràng HCT116 Dolastatin 10 Symploca sp Ung thƣ phổi các dòng: H69, H82, H446 H510, ung thƣ máu lympho Cryptophycin Nostoc sp Ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-435, ung thƣ phổi A549 Curacin A Lyngbya majuscula Ung thƣ phổi A549 Symplostatin Symploca hydnoides Ung thƣ vú ngƣời MDA-MB-435 Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 Luận văn cao học 2016 10 Malevamide D Bùi Thị Thùy Dung Symploca hydnoides Ung thƣ phổi A549, HT29, ung thƣ da SKMEL-28 1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) các chất hóa học có nguồn từ tự nhiên đƣợc ngƣời tách từ các loài động vật, thực vật có tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc [5] Chúng nguồn cung cấp các cấu trúc dẫn đƣờng để tổng hợp các chất tƣơng tự nhƣng đạt hiệu dƣợc lí an toàn cao hơn, đƣợc xem mốc khởi đầu quá trình tổng hợp sản xuất thuốc Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia các hợp chất tự nhiên thành hai nhóm chính, đó là: các hợp chất sơ cấp các hợp chất thứ cấp [22] Trong đó, các hợp chất thứ cấp không thực cần thiết cho sống thân sinh vật nhƣng chúng gây tác động đến các sinh vật khác, làm tăng khả cạnh tranh các sinh vật môi trƣờng sống Do có khả điều chỉnh đƣờng truyền sinh hóa tín hiệu, vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dƣợc liệu hữu ích Các hợp chất sinh học vi khuẩn lam cung cấp nguồn dƣợc liệu mới, nhiều tiềm Sự đa dạng mới lạ các chất tìm thấy vi khuẩn lam đƣợc so sánh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dƣợc phẩm quan trọng [3, 34] Các chất đƣợc tìm thấy vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khác bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide peptide không phụ thuộc ribosome Phần lớn các sản phẩm đƣợc sản xuất thông qua đƣờng sinh tổng hợp polyketide (PKS) peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS) phối hợp hai [24] Các nhóm chất từ vi khuẩn lam thể nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: kháng khuẩn, kháng ung thƣ, kháng virus, ức chế miễn dịch, Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung ức chế hoạt động proteinase, mục tiêu nghiên cứu quan trọng sinh y học 1.3.1 Nhóm chất alkaloid Sự phân lập định tính alkaloid đƣợc sớm, vào năm 1960 Đây nhóm các chất có độc tính cao, với liều vài milligram có thể gây tử vong cho ngƣời Các alkaloid có tác dụng sinh học đa dạng, chủ yếu làm dƣợc phẩm nhƣ: các thuốc ức chế thần kinh trung ƣơng (morphin, scopolamine, Ltetrahydropalmatin), các thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), các thuốc điều trị bệnh cao huyết áp (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khác có hoạt tính sinh học khác nhau, đó, vài chục alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi y học nông nghiệp [1] Anatoxin-a sản phẩm đƣợc phát vào năm đầu thập niên 1960 đƣợc phân lập lần vào năm 1972 J P Devlin từ chủng vi khuẩn lam Anabeana flos aquae Chúng đƣợc biết đến với cái tên “Yếu tố gây chết nhanh” (Very Fast Death Factor), chúng có khả gây độc nhanh mạnh lên hệ thần kinh làm co giật tử vong liệt hô hấp Bằng cách liên kết với thụ thể nicotinic acetylcholine (nAchR) màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay đổi hoạt động các kênh vận chuyển ion qua màng làm cho các cation qua màng, cuối dẫn đến tắc nghẽn truyền tín hiệu xung thần kinh [10] Cylindrospermopsin alkaloid tự nhiên mang độc tính đƣợc phân lập từ các loài vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans, Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii Raphidiopsis curvata Cấu trúc hóa học chất đƣợc phát vào năm 1992, bao gồm trycyclic guanidine liên kết với hydroxymethyluracil Dựa cấu trúc nucleotide khả phản ứng guanine nhóm sulphate Cyclindrospermopsin, các nhà nghiên cứu rằng, chất có khả liên kết với DNA/RNA đối tƣợng thí nghiệm Cụ thể, có liên kết chúng với DNA gan chuột 10 Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây phá vỡ DNA gan đồng thời làm tăng số lƣợng các nucleic nhỏ tế bào ung thƣ máu lympho dòng WIL2-NS [38] 1.3.2 Nhóm chất terpenoid Các terpenoid có vai trò chức đa dạng các hoạt động sinh học Chúng có thể các hormones (gibberellins, abscisic acid), các sắc tố quang hợp (phytol, carotenoids), các chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon) hay các chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol) Ngoài các chức sinh lí, trao đổi chất xây dựng cấu trúc, số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 tham gia vào quá trình “giao tiếp” “phòng vệ” nhƣ: chất hấp dẫn côn trùng thụ phấn, hỗ trợ quá trình phát tán hạt giống, kháng sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ Ở vi khuẩn lam, terpenoid đƣợc tổng hợp đƣờng methylerythritolphosphate (MEP) Nghiên cứu Kaneko cộng cho thấy, các gen mã hóa cho enzyme tham gia vào đƣờng sinh tổng hợp MEP đƣợc tìm thấy genome Synechocystis sp nhƣ genome nhiều loài vi khuẩn lam khác [30] Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol diterpenoid đƣợc nhận diện NMR phân tích khối phổ Tolypodiol thể hoạt tính kháng viêm mạnh tai chuột với ED50 30µg/tai [32] 1.3.3 Nhóm chất polyketide Là nhóm các sản phẩm thứ cấp có đa dạng cấu trúc chức đƣợc phân lập từ nguồn sinh vật khác nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng Các sản phẩm phân lập có đặc tính dƣợc lí quan trọng nhƣ: kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tác dụng nhiều đối tƣợng Ở vi khuẩn lam, polyketide đƣợc tổng hợp chuỗi các phản ứng liên tục đƣợc xúc tác các enzyme polyketide synthenase (PKS)- nhóm lớn các 11 Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung đa enzyme chứa nhóm phối hợp với vị trí hoạt động Các phản ứng diễn theo bƣớc cách hoạt hóa 2; 3; 4-cacbon khởi đầu nhƣ acetyl-CoA, propionyl, CoA, butyryl-CoA thành malonyl-, methylmalonyl- ethylmalonyl- CoA Các gen PKS đƣợc phát vi khuẩn lam nhờ nghiên cứu đột biến gen transposon tế bào dị hình có khả cố định ni-tơ [11] Coibacin A-D polyketide đƣợc phân lập từ loài vi khuẩn lam Oscillatoria sp biển Panama Nghiên cứu chứng minh, Coibacin A-D có khả ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thƣ H460 với giá trị IC50 từ 11,4-34,5µM Chúng có khả kháng viêm dựa khảo nghiệm nitric oxide, đó, Coibacin B thể khả kháng viêm mạnh Ngoài ra, có mặt Coibacin A làm giảm các cytokine nhƣ TNF-α IL-6 tế bào chuột RAW264.7 đƣợc kích thích lipopolysaccharide [2] 1.3.4 Nhóm chất peptide không phụ thuộc ribosome Là sản phẩm hệ thống sinh tổng hợp các enzyme nonribosomal peptides synthetase Các peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm D- Lamino acid, protein axit amin, axit hydroxyl, ornithine, acid β-amin các thành phần dị biệt khác Chúng có thể đƣợc sửa đổi glycosyl hóa, N-methyl hóa, acyl hóa Ngoài đa dạng cấu trúc, các peptide không phụ thuộc ribosome có phổ rộng các hoạt động sinh học, số đó có nhiều hữu ích y học, nông nghiệp nghiên cứu sinh học Các peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm các kháng sinh tiếng, chất ức chế miễn dịch, tác nhân kháng u các độc tố [25] Microcystin là chất chuyển hóa khẳng định có tồn tại đƣờng chuyển hóa không phụ thuộc ribosome Theo báo cáo Chorus Bartram, Microcystin sản phẩm các vi khuẩn lam Microcytis aeruginosa, Anabaena flos-aquae, Oscillatoria agardhii số loài thuộc chi Nostoc [19] Chúng đặc biệt ức chế protein phosphatase loại 2A sinh vật nhân thực Eukaryote 12 Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Microcystis có thể gây tổn thƣơng gan nghiêm trọng vận chuyển tích cực chúng vào tế bào gan nguyên nhân gây ngộ độc cho ngƣời [28] 1.4 Phân tách hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam Sự phát triển kĩ thuật sắc kí giúp bƣớc tiến lớn cho quá trình phân tách các hợp chất thiên nhiên có vi khuẩn lam Các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam đƣợc tồn tại hỗn hợp phức tạp gồm nhiều chất với cấu tạo khác Với các hợp chất quan tâm khác nhau, ngƣời ta sẽ sử dụng các phƣơng pháp khác để thu đƣợc hiệu tối ƣu Ví dụ loài vi khuẩn lam Spirulina sp., các chất có khả chống ô-xi hóa đƣợc phân tách cách sử dụng sắc kí cột có điều chỉnh tốc độ chảy áp suất dung môi phƣơng pháp chƣng cất đƣợc sử dụng để thu lấy các chất có khả kháng virus Sự phân tách các hợp chất phụ thuộc vào các yếu tố nhƣ: tính tan dung môi, độ ổn định chất, lƣợng chất có hỗn hợp [23] Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học khác đƣợc phân tách từ chủng vi khuẩn lam Spirulina platensis phƣơng pháp chiết lỏng cao áp (PLEPressurized Liquid Extraction) Các yếu tố nhƣ: dung môi phân cực (methanol, ethanol, n- hexan, nƣớc), nhiệt độ tách chiết, thời gian phân bố mẫu bên tế bào tách chiết đƣợc tối ƣu Bằng cách kết hợp PLE với các kĩ thuật sắc kí khác nhƣ: sắc kí mỏng TLC để kiểm tra độ phân tách các băng chất, sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp với đầu dò (HPLC-DAD) để xác định chất đƣợc phân tách băng, các chất đƣợc phát có thể α- β-carotene, βcryptoxanthin,…Ngoài ra, TLC đƣợc dùng phối hợp với phƣơng pháp điện di mao quản kết hợp khối phổ (EC/MS- Capillary electrophoresis - Mass spectrometry) để tăng hiệu tách chiết lƣợng chất giàu phycobiliprotein thời gian ngắn [18] Hàm lƣợng carotenoid có mặt loài vi khuẩn lam S platensis đƣợc xác định phƣơng pháp chiết siêu tới hạn (SFE- Supercritical fluid extraction) 13 Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung Đây phƣơng pháp sử dụng dung môi CO2 nhiệt độ áp suất vƣợt qua giới hạn chất Kết cho thấy, hàm lƣợng carotenoid thu đƣợc từ loài vi khuẩn lam cao hẳn sử dụng các phƣơng pháp khác [18] Nhƣ vậy, các phƣơng pháp tách chiết truyền thống nhƣ: chiết lỏngrắn (SLE- Solid liquid extraction), chiết lỏng-lỏng (LLE- Liquid–liquid extraction) với nhƣợc điểm sử dụng lƣợng lớn dung môi tốn nhiều thời gian tách chiết nhƣng hiệu tách chiết không cao thì đời số phƣơng pháp mới nhƣ: chiết lỏng cao áp, chiết chất lỏng siêu tới hạn,…để tăng hiệu tách chiết phân đoạn các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam Ngoài ra, ngƣời ta có thể dùng phối hợp các phƣơng pháp phân tích để đem lại hiệu nghiên cứu tốt nhƣ: sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp với khối phổ (LC/MS- Liquid chromatography- mass spectrometry), sắc kí khí kết hợp khối phổ GC/MS (Gas chromatography- mass spectrometry), sắc kí lỏng hiệu cao kết hợp hai lần khối phổ (LC/MS-MS- Liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry) nhằm dự đoán khối lƣợng cấu trúc phân tử hợp chất quan tâm Lịch sử nghiên cứu việc phân lập các chất tinh khiết từ vi khuẩn lam có hƣớng thay đổi tiến theo thời gian, thay vì sử dụng phƣơng pháp vật lí, hóa học để tìm nhiệt độ sôi, khác biệt so với các chất biết xác định khối lƣợng phân tử cần lƣợng mẫu lớn, thời gian xử lí mẫu lâu, phức tạp thì các phƣơng pháp đại đƣợc sử dụng nhƣ khối phổ, công hƣởng từ hạt nhân giúp xác định chất quan tâm nhanh chóng, dễ dàng với lƣợng mẫu nhỏ giúp quá trình phân tách chất đạt hiệu tối đa 14 Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phan Quốc Kinh, (2011), "Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học" Nhà xuất giáo dục Việt Nam TIẾNG ANH Balunas M.J., Grosso M.F., Villa F.A., Engene N., Mcphail K.L., Tidgewell K., Pineda M.L., Gerwick L., Spadafora C., Kyle D.E., and Gerwick W.H., (2012), "Coibacins A-D, antileishmanial marine cyanobacterial polyketides with intriguing biosynthetic origins", Organic letters, 14(15), pp 3878-81 Burja A.M., B Banaigs, E Abou-Mansour, J Grant Burgess, and P.C Wright, (2001), "Marine cyanobacteria - a prolific source of natural products", Tetrahedron, 57(46), pp 9347-9377 Chen J and Forsyth C.J., (2004), "Total synthesis of the marine cyanobacterial cyclodepsipeptide apratoxin A", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(33), pp 12067-72 Chin Y.-W., Balunas M J., Chai H B., and Kinghorn A.D., (2006), "Drug discovery from natural sources", The AAPS journal, 8(2), pp E239E253 Chun G., Lee Y.B., Kim D.J., Cho W.J, Lee S.K., Chung H.J., and Ahn C.H., (2014), "Characterization of a novel small molecule inhibitor with potent anticancer activity", Cancer research, 70(8), pp 3562 Costa M., Costa-Rodrigues J.,Fernandes M.H., Barros P., Vasconcelos V., and Martins R., (2012), "Marine cyanobacteria compounds with anticancer properties: a review on the implication of apoptosis", Mar Drugs, 10(10): pp 2181-207 De Los Rios A., Grube M., Sancho L.G., and Ascaso C., (2007), "Ultrastructural and genetic characteristics of endolithic cyanobacterial 45 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung biofilms colonizing Antarctic granite rocks", FEMS microbiology ecology, 59(2), pp 386-95 Devi T.I., Koijam L.,Singh O.A.,Tiwari O.N and Sharma G.D., (2010), "Assessment of cyanobacterial biodiversity through molecular approaches and possible exploitation for value addition", Assam University Journal of Science & Technology : Biological and Environmental Sciences, (1), pp 93-101 10 Dittmann E and Wiegand C., (2006), "Cyanobacterial toxins occurrence, biosynthesis and impact on human affairs", Molecular nutrition & food research, 50(1), pp 7-17 11 Dittmann E., Neilan B.A., and Borner T., (2001), "Molecular biology of peptide and polyketide biosynthesis in cyanobacteria", Applied Microbiol Biotechnol, 57(4), pp 467-73 12 Elliott A and Pace D.M., (1963), "Observations on the effects of Methanol and formaldehyde on estabilished cell lines cultivated in vitro”, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 41(2), pp 299-304 13 Fang W., Liu S., and Nie Y., (2011), "Anticancer activity of chamaejasmine: effect on tubulin protein", Molecules, 16(8), pp 6243-54 14 Ferlay J.,Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M, Parkin D., Forman D., and Bray F., (2015), "Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012", International journal of cancer, 136(5), pp E359-86 15 Gerwick W.H., Proteau P.J., Nagle D.G., Hamel E., Blokhin A., and Slate D.L., (1994), "Structure of Curacin A, a Novel Antimitotic, Antiproliferative and Brine Shrimp Toxic Natural Product from the Marine Cyanobacterium Lyngbya majuscula", The Journal of Organic Chemistry, 59(6), pp 1243-1245 46 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 16 Gerwick, W.H., Byrum T., Carland T., (2008),“Integratingchemical and biochemical approaches to natural products drug discovery from marine cyanobacteria”, International Conference on Newer Developments in Drug Discovery from Natural Products and Traditional Medicines, pp 33-43 17 Hemscheidt T., Puglisi M.P., Larsen L.K., Patterson G.M., Moore R., Rios J., and Clardy J., (1994), "Structure and biosynthesis of borophycin, a new boeseken complex of boric acid from a marine strain of the blue-green alga Nostoc linckia", The Journal of Organic Chemistry, 59(12), pp 3467-3471 18 Ibañez E., Herrero M., Mendiola J.A., and Castro-Puyana M (2012), “Extraction and Characterization of Bioactive Compounds with Health Benefits from Marine Resources: Macro and Micro Algae, Cyanobacteria, and Invertebrates”, Marine Bioactive Compounds: Characterization and Applications, pp 55-98 19 Ingrid Chorus, Jamie Bartram, (1999), Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide to their Public Health Consequences, Monitoring and Management, Chemical Rubber Company Press 20 James J Pitt (2009), “Principles and Applications of Liquid ChromatographyMass Spectrometry in Clinical Biochemistry”, Clin Biochem Reviews, 30(1), pp.19–34 21 Kenneth G Macleod and Simon P Langdon, (2011), “Essential Techniques of Cancer Cell Culture”, Cancer cell culture- Methods and Protocol, 88, pp.17-23 22 Kossel A., (1981), "The chemical composition of the cell", Archiv für Physiologie, 61(10), pp 181-186 47 Footer Page 26 of 126 Header Page 27 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 23 Kwei C.K.,(2012), Elucidation and isolation of specific bioactive compound in cyanobacteria isolates, Thesis (Ph.D): Chemical Engineering, University of Adelaide 24 Mandal S and Rath J., (2015), “Secondary Metabolites of Cyanobacteria and Drug Development”, Extremophilic Cyanobacteria For Novel Drug Development, pp 23-43 25 Martínez-Núñez M.A, (2016), "Nonribosomal peptides synthetases and their applications in industry", Sustainable Chemical Processes, 4(1), pp 13 26 Matthew S., Schupp P., and Luesch H., (2008), "Apratoxin E, a cytotoxic peptolide from a guamanian collection of the marine cyanobacterium Lyngbya bouillonii", Journal of natural products, 71(6), pp 1113-6 27 Moore R.E., Corbett, T H., Patterson, G M L., and Valeriote, F A ,(1996), “The Search for New Antitumor Drugs from Blue-Green Algae”, Current Pharmaceutical Design, 2(3),pp 317-330 28 Neilan B.A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass L.A., Schaub V., Sivonen K., and Börner T., (1999), "Nonribosomal Peptide Synthesis and Toxigenicity of Cyanobacteria", Journal of Bacteriology, 181(13), pp 4089-4097 29 Newman D.J and G.M Cragg, (2007), "Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years", Journal of natural products, 70(3), pp 461-477 30 Pattanaik B and P Lindberg, (2015), "Terpenoids and their biosynthesis in cyanobacteria", Life (Basel, Switzerland), 5(1), p 269-93 31 Patterson G.M.L, (1991), "Atineoplastic activity of cultured blue-green algae (Cyanpphyta)" Journal of Phycology, 27(4), pp 530-536 32 Prinsep M.R., Thomson R.A., West M.L., and Wylie B.L., (1996), "Tolypodiol, an antiinflammatory diterpenoid from the cyanobacterium Tolypothrix nodosa", Journal of natural products, 59(8), pp 786-8 48 Footer Page 27 of 126 Header Page 28 of 126 Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung 33 Sherma J., (2006), Thin-Layer Chromatography, in Encyclopedia of Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd 34 Shimizu Y., (1996), "Microalgal metabolites: a new perspective", Annual review of microbiology, 50, pp 431-65 35 Simmons T.L., Andrianasolo E., Mcphail K., Flatt P., and Gerwick W.H, (2005), "Marine natural products as anticancer drugs", Molecular cancer therapeutics, 4(2), pp 333-42 36 Smith C.D., Zhang X., Mooberry S.L., Patterson G.M., and Moore R.E., (1994), "Cryptophycin: a new antimicrotubule agent active against drug-resistant cells", Cancer research, 54(14), pp 3779-84 37 Subramaniyan Vijayakumar M.M., (2015), "Pharmaceutical applications of cyanobacteriad-A review", 5(1), Journal of Acute Medicine, pp.1-9 38 Vasas G., G Borbely, P Nanasi, and P.P Nanasi, (2010), "Alkaloids from cyanobacteria with diverse powerful bioactivities", Medicinal Chemistry, 10(10), pp 946-55 39 Voigt W., (2005), "Sulforhodamine B assay and chemosensitivity", Molecular Medicine, 110, pp 39-48 40 Wipf P., Reeves J.T and Day B.W., (2004), "Chemistry and biology of curacin A", Current pharmaceutical design, 10(12), pp 1417-37 41 Zakhia F., Jungblut A.J., Taton A.,Vincent W.F., and Wilmotte A., (2008), “Cyanobacteria in Cold Ecosystems”, Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology, pp 121-135 49 Footer Page 28 of 126 ... các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả ức chế tăng trƣởng số dòng tế bào ung thƣ” với mục đích: Đánh giá khả ức chế tăng trưởng dịch chiết từ chủng vi khuẩn lam lên dòng tế bào ung thư phổ... NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC... Thùy Dung Bảng 1.1 Một số chất có khả kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam [37] STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động Ankaraholide A Geitlerinema sp Các dòng tế bào ung thƣ: